超聲靶向微泡破壞技術(shù)調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠神經(jīng)功能修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

摘" " 要" " 目的" " 探討超聲靶向微泡破壞技術(shù)（UTMD）調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）移植在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）小鼠神經(jīng)功能修復(fù)中的應(yīng)用價(jià)值及其作用機(jī)制。方法" " 將50只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、TBI組、UTMD組、UTMD+NSCs組及UTMD+NSCs+AS組，每組各10只，其中對(duì)照組為正常小鼠且未進(jìn)行任何處理；其余各組小鼠使用改良Feeney法建立TBI模型，建模1 d后進(jìn)行分組治療，每3天治療1次，共治療3次，具體方法：TBI組僅建模，UTMD組接受UTMD開(kāi)放血腦屏障，UTMD+NSCs組接受UTMD開(kāi)放血腦屏障聯(lián)合NSCs移植，UTMD+NSCs+AS組接受UTMD開(kāi)放血腦屏障聯(lián)合NSCs和AS移植。于治療第1、4、8、12天采用改良神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分（mNSS）評(píng)估神經(jīng)功能損傷程度；于治療第12天應(yīng)用MRI檢查各組小鼠腦組織水腫體積；同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）檢測(cè)各組小鼠腦組織中神經(jīng)保護(hù)因子［腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）］和神經(jīng)損傷因子［中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白（S100B）、熱休克蛋白70（HSP70）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）］表達(dá)水平，比較各組上述檢查結(jié)果的差異。結(jié)果" " 治療第1、4、8、12天，UTMD+NSCs+AS組、UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組mNSS評(píng)分均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。治療第1、4天，UTMD+NSCs+AS組、UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組mNSS評(píng)分兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療第8天，UTMD+NSCs+AS組mNSS評(píng)分低于UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；其余組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療第12天，UTMD+NSCs+AS組mNSS評(píng)分低于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，UTMD+NSCs組mNSS評(píng)分低于UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；UTMD組與TBI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療第12天，TBI組、UTMD組、UTMD+NSCs組、UTMD+NSCs+AS組小鼠腦組織水腫體積分別為（8.38±0.50）mm3、（7.47±0.28）mm3、（5.56±1.45）mm3、（1.68±0.14）mm3，呈逐漸降低趨勢(shì)，但各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，UTMD+NSCs+AS組BDNF、GDNF、NGF、bFGF表達(dá)水平均高于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平均低于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，UTMD+NSCs+AS組GDNF、NGF、bFGF表達(dá)水平均高于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，BDNF表達(dá)水平高于UTMD組、TBI組、對(duì)照組，S100B、HSP70表達(dá)水平均低于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，Caspase-3表達(dá)水平低于UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。結(jié)論" " UTMD調(diào)控AS聯(lián)合NSCs移植能夠顯著改善TBI小鼠生化微環(huán)境，通過(guò)上調(diào)神經(jīng)保護(hù)因子表達(dá)并下調(diào)神經(jīng)損傷因子表達(dá)，可促進(jìn)TBI小鼠神經(jīng)功能修復(fù)。

關(guān)鍵詞" " 超聲靶向微泡破壞技術(shù)；星形膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)功能修復(fù)；創(chuàng)傷性腦損傷，小鼠

［中圖法分類(lèi)號(hào)］R445.1" " " ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

ABSTRACT" " Objective" " To explore the application value and mechanism of action of ultrasound-targeted microbubbles destruction technology（UTMD）-mediated astrocytes（AS） combined with neural stem cells（NSCs） transplantation on neurological function recovery in traumatic brain injury（TBI） mice.Methods" " A total of 50 mice were randomly divided into 5 groups：control group，TBI group，UTMD group，UTMD+NSCs group and UTMD+NSCs+AS group，with 10 mice in each group.The control group consisted of normal mice that didn’t receive any treatmeat，while the remaining groups were subjected to TBI model using the modified Feeney method.1 d after modeling，the mice were treated according to their respective groups，with treatments administered every 3 d for a total of 3 times.The TBI group only underwent modeling，the UTMD group underwent UTMD blood-brain barrier opening treatment，the UTMD+NSCs group underwent UTMD blood-brain barrier opening treatment combined with NSCs transplantation，and the UTMD+NSCs+AS group underwent UTMD blood-brain barrier opening treatment combined with NSCs and AS transplantation.Neurological dysfunction degree were assessed by the modified neurological severity score（mNSS） on the 1st，4th，8th and 12th after treatment.On the 12th day，MRI was used to measure brain edema volume of brain tissue in each group，and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR） were used to measure neuroprotective factors，including brain-derived neurotrophic factor（BDNF），glial cell-derived neurotrophic factor（GDNF），nerve growth factor（NGF） and basic fibroblast growth factor（bFGF），and neurotoxic factors，including central nervous system-specific protein（S100B），heat shock protein 70（HSP70） and cysteine protease-3（caspase-3） expression levels in brain tissue in all groups.The differences in the above examination results among each group were compared.Results" " The mNSS scores of the UTMD+NSCs+AS group，UTMD+NSCs group，UTMD group and TBI group were higher than those of the control group on the 1st，4th，8th and 12th after treatment（all Plt;0.05）.There were no significant differences in mNSS scores among the UTMD+NSCs+AS group，UTMD+NSCs group，UTMD group and TBI group on the 1st and 4th day.On the 8th day，the mNSS score of the UTMD+NSCs+AS group was lower than that of the UTMD group and TBI group（both Plt;0.05），there were no significant differences between the other groups.On the 12th day，the mNSS score of the UTMD+NSCs+AS group was lower than that of the UTMD+NSCs group，UTMD group and TBI group，and the mNSS score of the UTMD+NSCs group was lower than that of the UTMD group and TBI group（all Plt;0.05），there was no significant difference between the UTMD group and TBI group.The brain edema volumes of mice in the TBI group，UTMD group，UTMD+NSCs group and UTMD+NSCs+AS group were （8.38±0.50）mm3，（7.47±0.28）mm3，（5.56±1.45）mm3 and （1.68±0.14） mm3，respectively on the 12th day，and there was no significant difference among the groups.ELISA results showed that BDNF，GDNF，NGF and bFGF expression levels of the UTMD+NSCs+AS group were higher than those of the UTMD+NSCs group，UTMD group and TBI group，and S100B，HSP70 and caspase-3 expression levels were lower than those of the UTMD+NSCs group，UTMD group and TBI group，and the differences were statistically significant（all Plt;0.05）.RT-PCR results showed that the GDNF，NGF and bFGF expression levels of the UTMD+NSCs+AS group were higher than those of the UTMD+NSCs group，UTMD group and TBI group， and BDNF expression level of the UTMD+NSCs+AS group were higher than that of the UTMD group，TBI group and control group，S100B and HSP70 expression levels of the UTMD+NSCs+AS group were lower than those of the UTMD+NSCs group，UTMD group and TBI group，and Caspase-3 expression level of the UTMD+NSCs+AS group were lower than that of the UTMD group and TBI group，and the differences were statistically significant（all Plt;0.05）.Conclusion" " UTMD-mediated AS combined with NSCs transplantation can significantly ameliorate the biochemical microenvironment in TBI mice，upregulates the expression of neuroprotective factors，downregulates the expression of neurotoxic factors，and can promote the neurological recovery function.

KEY WORDS" " Ultrasound-targeted microbubbles destruction technology；Astrocytes；Neural stem cells；Neurological function recovery；Traumatic brain injury，mice

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是全球醫(yī)學(xué)界面臨的重大挑戰(zhàn)之一，TBI后發(fā)生的繼發(fā)性神經(jīng)元壞死通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激等病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可引發(fā)患者持續(xù)性神經(jīng)功能損傷及認(rèn)知功能障礙［1］。星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AS）在TBI的病理生理過(guò)程中發(fā)揮雙向調(diào)控作用，其不僅在神經(jīng)支持、血腦屏障維護(hù)和神經(jīng)信號(hào)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］，還能夠響應(yīng)損傷信號(hào)，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)生化微環(huán)境改善，為神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）提供有利的生存和分化條件［3］。在TBI早期，雖然大腦皮質(zhì)的AS會(huì)被激活，對(duì)損傷具有一定的修復(fù)作用，但隨著激活的AS大量增生會(huì)形成膠質(zhì)瘢痕，從而加重繼發(fā)性腦損傷［4］。TBI后自發(fā)性的神經(jīng)功能修復(fù)有限，主要是由于炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和進(jìn)行性組織受損所致［5-6］。因此，尋找替代神經(jīng)元的再生療法對(duì)于重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)具有重要意義。NSCs具有自我更新和多向分化的能力，已成為替代受損細(xì)胞、改善神經(jīng)功能的有效方法［7］。既往實(shí)驗(yàn)［8］表明，AS與NSCs聯(lián)合移植能夠提高移植NSCs的存活率和增殖率。但仍需新的策略以增強(qiáng)AS與NSCs聯(lián)合移植的有效性，以促進(jìn)移植NSCs的存活和TBI小鼠神經(jīng)功能修復(fù)。而低強(qiáng)度脈沖超聲可以有效促進(jìn)AS分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，降低炎癥水平，改善生化微環(huán)境［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以超聲空化效應(yīng)為主的生物學(xué)效應(yīng)能有效調(diào)控體外AS，促進(jìn)保護(hù)性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，改善生化微環(huán)境。超聲靶向微泡破壞技術(shù)（ultrasound-targeted microbubbles destruction technology，UTMD）作為一種新興的生物物理刺激手段，能瞬時(shí)開(kāi)放血腦屏障、增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和NSCs在創(chuàng)傷區(qū)域的富集，直接作用于創(chuàng)傷微環(huán)境，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及再生作用［10］。基于此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討UTMD調(diào)控AS聯(lián)合NSCs移植在TBI小鼠神經(jīng)功能修復(fù)中的應(yīng)用價(jià)值及其作用機(jī)制，為T(mén)BI治療提供新的策略。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6J雄性小鼠56只［北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008］，周齡6～8周，平均（7.00±0.58）周，體質(zhì)量20～25 g，平均（23.00±1.55）g；C57BL/6J孕鼠2只（北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008），周齡分別為6+4、7+1周，孕14 d，體質(zhì)量分別為27 g、28 g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：AMUWEC20234973）。

2.主要試劑及儀器：AS（C8-D1A，武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；小鼠NSCs培養(yǎng)基（NeuroCult? Proliferation Kit ，加拿大Stem Cell公司）；1.25%三溴乙醇（北京萊艾特科技發(fā)展有限公司）；ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen Corporation公司）；數(shù)顯腦立體定位儀（68025，深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司）；超聲空化儀（DCT-700，深圳市威爾德醫(yī)療電子有限公司），KHT-0101探頭，頻率1.2 MHz，其余參數(shù)設(shè)置：聲壓1.0 kPa，占空比0.6%，治療時(shí)間1 min；一體化彩色多普勒超聲診療儀（VINNO Ultimus 9E，飛依諾科技股份有限公司），X4-12L探頭，頻率3 MHz，脈沖重復(fù)頻率100 Hz，其余參數(shù)設(shè)置：脈沖長(zhǎng)度26.0 cycle，脈沖時(shí)間0.6 s，間隔時(shí)間2 s，持續(xù)時(shí)間300 s，深度2 cm，機(jī)械指數(shù)0.8，聲功率85%；注射用全氟丁烷微球（Sonozoid?，美國(guó)GE Healthcare公司）；小動(dòng)物MRI儀（Biospec 70/20 USR，美國(guó)Bruker Corporation公司），參數(shù)設(shè)置：重復(fù)時(shí)間4000 ms，回波時(shí)間45 ms，視野25 mm×25 mm，層厚0.6 mm。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.NSCs培養(yǎng)及懸液制備：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，從2只C57BL/6J孕鼠中分別取出胎鼠腦組織，參考文獻(xiàn)［11］中的方法分離NSCs并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每7～10天傳代1次，至第3代。選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，體內(nèi)治療時(shí)經(jīng)消化、離心和重懸，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml備用。

2.AS培養(yǎng)及懸液制備：于37℃、含有5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)AS，每4～5天傳代1次，至第3代。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，每孔200 μl的細(xì)胞懸液接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。于體內(nèi)治療前12 h使用超聲空化儀進(jìn)行UTMD處理，同時(shí)每孔加入200 μl濃度為1×106/ml的Sonozoid?混懸液。體內(nèi)治療時(shí)經(jīng)消化、離心和重懸，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml備用。

3.TBI模型的建立及UTMD開(kāi)放血腦屏障效果評(píng)估

（1）使用改良Feeney法［12］建立TBI模型，具體方法為：將C57BL/6J小鼠經(jīng)腹腔注射1.25%三溴乙醇0.1 ml/5 g全身麻醉后固定于數(shù)顯腦立體定位儀，沿中線(xiàn)剪開(kāi)頭皮及皮下組織以顯露顱骨，于矢狀縫與冠狀縫交界處外各2 mm的位置使用顱骨鉆制備一大小3 mm×3 mm骨窗，將20 g砝碼從20 cm垂直高度釋放撞擊骨窗造成局部腦組織損傷。隨機(jī)選取3只小鼠通過(guò)上述方法建立TBI模型，采用改良神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）評(píng)估神經(jīng)功能損傷程度，應(yīng)用MRI掃查腦組織觀察其損傷情況，并采集腦組織標(biāo)本進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色觀察病理變化，評(píng)估建模是否成功。mNSS評(píng)分［13］包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡4個(gè)方面，總分18分，其中13～18分為重度顱腦損傷，7～12分為中度顱腦損傷，1～6分為輕度顱腦損傷。

（2）隨機(jī)選取3只C57BL/6J小鼠通過(guò)上述方法建立TBI模型，應(yīng)用UTMD開(kāi)放血腦屏障，經(jīng)尾靜脈注入滅菌的2%伊文思藍(lán)（0.1 ml/10 g），觀察其是否滲透腦組織，評(píng)估UTMD開(kāi)放血腦屏障效果。

4.實(shí)驗(yàn)分組：將剩余的50只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、TBI組、UTMD組、UTMD+NSCs組及UTMD+NSCs+AS組，每組各10只，其中對(duì)照組為正常小鼠且未進(jìn)行任何處理，其余各組小鼠使用上述改良Feeney法建立TBI模型。UTMD組、UTMD+NSCs組及UTMD+NSCs+AS組建模后1 d，建立尾靜脈通道，使用一體化彩色多普勒超聲診療儀，以小鼠眼耳連線(xiàn)中點(diǎn)作為聲窗，同時(shí)將200 μl濃度為1×109/ml的Sonozoid?混懸液分5次經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)開(kāi)放血腦屏障［14］。其中UTMD組僅接受UTMD開(kāi)放血腦屏障；UTMD+NSCs組在接受UTMD開(kāi)放血腦屏障后經(jīng)尾靜脈注射200 μl濃度為1×106/ml的NSCs懸液；UTMD+NSCs+AS組在接受UTMD開(kāi)放血腦屏障后經(jīng)尾靜脈注射200 μl濃度為1×106/ml的 NSCs懸液及200 μl濃度為1×106/ml經(jīng)體外UTMD處理的AS懸液；每3天治療1次，共治療3次。TBI組未進(jìn)行任何處理。

5.神經(jīng)功能損傷程度評(píng)估：建模前，各組小鼠接受3 d的運(yùn)動(dòng)、協(xié)調(diào)和平衡訓(xùn)練。于治療第1、4、8、12天分別從各組取5只小鼠，采用mNSS評(píng)估神經(jīng)功能損傷程度，比較各組治療第1、4、8、12天mNSS評(píng)分。

6.腦組織水腫程度評(píng)估：于治療第12天分別從各組取2只小鼠，應(yīng)用MRI掃查腦部，觀察小鼠腦組織水腫程度；掃查序列包括軸位T2W1和軸位T2W1反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列，獲取小鼠腦組織水腫層數(shù)和最大面積，使用ITK-SNAP軟件對(duì)圖像進(jìn)行半自動(dòng)分割、勾畫(huà)，獲得腦組織水腫立體三維圖像并計(jì)算水腫體積，比較各組小鼠腦組織水腫體積的差異。

7.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)小鼠腦組織神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)水平：于治療第12天分別從各組取5只小鼠，全身麻醉（方法同前）后取出腦組織，按照一定比例（腦組織重量∶PBS體積=1∶9）加入預(yù)冷的PBS進(jìn)行組織勻漿，離心取上清液，使用ELISA試劑盒和酶標(biāo)儀嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白（S100B）、熱休克蛋白70（HSP70）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)水平，比較各組小鼠腦組織中上述神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)水平的差異。

8.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）檢測(cè)小鼠腦組織神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)水平：于治療第12 天將各組剩余的5只小鼠全身麻醉（方法同前）后取出腦組織，嚴(yán)格按照Trizol試劑使用說(shuō)明從組織中分離出總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行單鏈cDNA的合成，在20 μl的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體系中，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在含有10 ng/ml溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算BDNF、GDNF、NGF、bFGF、S100B、HSP70、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，比較各組小鼠腦組織中上述神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1" " RT-PCR引物序列表

[引物名稱(chēng) 序列 GDNF-F TATGGGATGTCGTGGCTGTC GDNF-R GCCGCTTGTTTATCTGGTGA NGF-F GGCAGCATGGTGGAGTTT NGF-R GTGGGCTTCAGGGACAGA bFGF-F CTTCCCACCAGGCCACTT bFGF-R GCCGTCCATCTTCCTTCATA HSP70-F CAGCACAACTCATCGGCACA HSP70-R CCCGCATCAGCACTGAGAAT S100B-F GCCCTCATTGATGTCTTCC S100B-R TCTTCGTCCAGCGTCTCC Caspase-3-F TCTGACTGGAAAGCCGAAAC Caspase-3-R CTGGATGAACCACGACCC BDNF-F TTATTTCATACTTCGGTTGCA BDNF-R GTGTCAGCCAGTGATGTCG GAPDH-F CCTTCCGTGTTCCTAC GAPDH-R GACAACCTGGTCCTCA ]

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，各組比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)組間兩兩比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)" 果

一、TBI建模方法評(píng)估

3只TBI小鼠mNSS評(píng)分分別為10、11、12分，達(dá)到中度顱腦損傷程度；MRI和HE染色檢查結(jié)果顯示小鼠創(chuàng)傷區(qū)腦組織水腫嚴(yán)重，紅細(xì)胞滲出明顯，表明模型均建立成功，該建模方法可行。見(jiàn)圖1。

二、UTMD開(kāi)放血腦屏障效果評(píng)估

TBI小鼠腦組織大體標(biāo)本顯示伊文思藍(lán)成功滲透腦組織，表明UTMD成功開(kāi)放血腦屏障。見(jiàn)圖2。

三、各組小鼠mNSS評(píng)分比較

治療第1、4、8、12天，UTMD+NSCs+AS組、UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組mNSS評(píng)分均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。治療第1、4天，UTMD+NSCs+AS組、UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組mNSS評(píng)分兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療第8天，UTMD+NSCs+AS組mNSS評(píng)分低于UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；其余各組兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療第12天，UTMD+NSCs+AS組mNSS評(píng)分低于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，UTMD+NSCs組mNSS評(píng)分低于UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；UTMD組與TBI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

四、各組小鼠腦組織水腫體積比較

治療第12天MRI檢查顯示，UTMD+NSCs+AS組腦組織水腫體積層面（紅色區(qū)域，3層）少于TBI組（6層）、UTMD組（5層）、UTMD+NSCs組（4層），水腫最大層面面積小于其他各組，見(jiàn)圖3。TBI組、UTMD組、UTMD+NSCs組、UTMD+NSCs+AS組小鼠腦組織水腫體積分別為（8.38±0.50）mm3、（7.47±0.28）mm3、（5.56±1.45）mm3、（1.68±0.14）mm3，呈逐漸降低趨勢(shì)，但各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

五、ELISA檢測(cè)各組小鼠腦組織神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)水平比較

UTMD+NSCs+AS組、UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組BDNF、GDNF、NGF、bFGF表達(dá)水平均低于對(duì)照組，S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；UTMD+NSCs+AS組BDNF、GDNF、NGF、bFGF表達(dá)水平均高于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平均低于TBI組、UTMD組、UTMD+NSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；其余各組BDNF、GDNF、NGF、bFGF、S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。見(jiàn)表3。

六、RT-PCR檢測(cè)各組小鼠腦組織神經(jīng)相關(guān)因子水平比較

UTMD+NSCs+AS組GDNF、NGF、bFGF表達(dá)水平均高于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，BDNF表達(dá)水平高于UTMD組、TBI組、對(duì)照組，S100B、HSP70表達(dá)水平均低于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，Caspase-3表達(dá)水平低于UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。 UTMD+NSCs組BDNF表達(dá)水平高于UTMD組、TBI組，GDNF、bFGF表達(dá)水平均高于TBI組，NGF表達(dá)水平低于對(duì)照組，S100B表達(dá)水平低于UTMD組，HSP70表達(dá)水平低于TBI組，Caspase-3表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；UTMD組、TBI組GDNF、NGF、bFGF表達(dá)水平均低于對(duì)照組，S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平均高于對(duì)照組，TBI組BDNF表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；其余各組BDNF、GDNF、NGF、bFGF、S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

討" 論

TBI是指頭部受到撞擊或外力沖擊導(dǎo)致正常腦部功能或結(jié)構(gòu)的獲得性破壞［15］。其發(fā)生后，局部和全身的炎癥反應(yīng)被迅速激活，導(dǎo)致大量炎癥因子和凋亡因子釋放，繼而在生化微環(huán)境中形成了一個(gè)有害生態(tài)，不僅直接加劇了NSCs損傷，抑制其增殖和分化，還通過(guò)激活細(xì)胞凋亡途徑，降低了移植NSCs的存活率［16］，從而影響TBI小鼠的神經(jīng)功能修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)將UTMD調(diào)控AS聯(lián)合NSCs移植至TBI小鼠體內(nèi)，探索其在改善TBI小鼠生化微環(huán)境、促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)中的作用。本實(shí)驗(yàn)采用改良Feeney法建立TBI模型，通過(guò)模擬頭部受到撞擊的物理過(guò)程，成功建立了具有典型病理學(xué)特征和神經(jīng)功能損傷的TBI模型［17］，本研究MRI和HE染色檢查結(jié)果顯示小鼠創(chuàng)傷區(qū)腦組織水腫嚴(yán)重，紅細(xì)胞滲出明顯，表明該建模方法可行。此外，為了提高細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)因子在損傷區(qū)域的富集，本實(shí)驗(yàn)采用UTMD開(kāi)放血腦屏障，經(jīng)尾靜脈注入滅菌的2%伊文思藍(lán)評(píng)估血腦屏障開(kāi)放效果，結(jié)果顯示UTMD成功開(kāi)放血腦屏障。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)上述方法不僅成功建立了小鼠TBI模型，還提高了血腦屏障的通透性，以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和NSCs在創(chuàng)傷區(qū)域的富集，從而增強(qiáng)治療效果，為后續(xù)的治療研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

TBI后的炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜且持續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，通常在損傷后的數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)即刻啟動(dòng)，并可能持續(xù)數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)個(gè)月甚至數(shù)年，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)變性和延遲性細(xì)胞死亡，從而加重原發(fā)性損傷，同時(shí)TBI后的原發(fā)性和繼發(fā)性損傷會(huì)促使損傷區(qū)域炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，這些因子能夠破壞血腦屏障的完整性，致使蛋白質(zhì)液體滲透到組織間隙，引發(fā)組織缺血缺氧，從而導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加和血管擴(kuò)張，最終形成血管源性腦水腫［18-19］。研究［20］顯示，AS可通過(guò)分泌可溶性因子GDNF、bFGF表達(dá)繼而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，對(duì)血腦屏障的修復(fù)和功能穩(wěn)定起到至關(guān)重要的調(diào)控作用。同時(shí)，TBI后1～7 d AS于病灶周?chē)鲋?，且其?shù)量在損傷后3 d達(dá)到峰值［21］，而早期炎癥反應(yīng)通常在損傷后3～7 d達(dá)到高峰［22］。此外，移植NSCs在體內(nèi)能夠存活3 d以上［10］，且BDNF、GDNF、NGF、bFGF等因子在神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元存活、軸突再生、突觸形成和功能修復(fù)過(guò)程中通常展現(xiàn)出協(xié)同作用［23-24］。基于上述研究，本實(shí)驗(yàn)選擇在TBI后7 d這一時(shí)間窗內(nèi)連續(xù)治療3次并觀察效果。結(jié)果顯示，UTMD+NSCs+AS組mNSS評(píng)分低于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，UTMD+NSCs組mNSS評(píng)分均低于UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），表明通過(guò)UTMD 調(diào)控AS聯(lián)合NSCs 移植在神經(jīng)功能損傷評(píng)分方面均優(yōu)于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組；MRI檢查進(jìn)一步顯示，TBI組、UTMD組、UTMD+NSCs組、UTMD+NSCs+AS組小鼠腦組織水腫體積呈逐漸降低趨勢(shì)，尤以UTMD+NSCs+AS組降低最為顯著，表明通過(guò)UTMD調(diào)控AS聯(lián)合NSCs可以更顯著改善生化微環(huán)境，為NSCs提供更長(zhǎng)時(shí)間的有利條件，從而促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)，同時(shí)在修復(fù)血腦屏障、減輕腦組織水腫方面可能較單獨(dú)使用NSCs治療更為有效。但本實(shí)驗(yàn)中各組小鼠腦組織水腫體積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因?yàn)闃颖玖枯^小。

在TBI生化微環(huán)境中，S100B、HSP70常被用于評(píng)估其嚴(yán)重程度和預(yù)后，其水平在損傷早期達(dá)到峰值，以響應(yīng)細(xì)胞損傷和應(yīng)激狀態(tài)，并隨著損傷的修復(fù)和細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)的緩解而逐漸下降；Caspase-3在細(xì)胞凋亡中扮演關(guān)鍵角色，在TBI早期被迅速激活，并參與細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)［25-27］。為了進(jìn)一步探討UTMD調(diào)控AS聯(lián)合NSCs移植對(duì)TBI生化微環(huán)境中神經(jīng)保護(hù)因子和神經(jīng)損傷因子表達(dá)水平的影響，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA和RT-PCR兩種方法檢測(cè)神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)水平，ELISA因其高靈敏度和特異度，適用于檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，提供了蛋白質(zhì)層面的直接證據(jù)，而RT-PCR則能夠精確測(cè)量mRNA水平的變化信息，揭示基因表達(dá)的調(diào)控變化，從分子層面補(bǔ)充了蛋白質(zhì)水平數(shù)據(jù)，兩種方法同時(shí)檢測(cè)，相互驗(yàn)證，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UTMD+NSCs+AS組BDNF、GDNF、NGF、bFGF表達(dá)水平均高于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平均低于UTMD+NSCs組、UTMD組、TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），表明通過(guò)UTMD調(diào)控AS聯(lián)合NSCs 移植可以使TBI應(yīng)激狀態(tài)和損傷程度得到有效緩解，明顯改善生化微環(huán)境。同時(shí)，ELISA結(jié)果顯示TBI組、UTMD組、UTMD+NSCs組BDNF、GDNF、NGF、bFGF、S100B、HSP70、Caspase-3表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），表明單獨(dú)UTMD或UTMD聯(lián)合NSCs移植也能夠在一定程度上改善TBI應(yīng)激狀態(tài)和創(chuàng)傷微環(huán)境，尤以UTMD 調(diào)控AS聯(lián)合NSCs 移植效果最為顯著，提示通過(guò)UTMD 調(diào)控AS聯(lián)合NSCs 移植可顯著改善TBI生化微環(huán)境中神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)，減輕細(xì)胞損傷和凋亡，促進(jìn)NSCs的存活、再生和功能修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)的局限性：①由于小動(dòng)物MRI需要預(yù)約，每組僅有部分樣本進(jìn)行MRI檢查，雖然在影像學(xué)檢測(cè)大體觀上UTMD+NSCs+AS組小鼠腦組織水腫體積相較于其他組明顯降低，但各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，限制了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果更深度和廣度的評(píng)估；②ELISA檢測(cè)的是上清液中蛋白質(zhì)含量，RT-PCR檢測(cè)的是RNA水平的特定序列，兩種方法在檢測(cè)原理、靈敏度、特異度、操作復(fù)雜度、檢測(cè)內(nèi)容、樣本處理及可能的誤差方面存在差異，導(dǎo)致二者所測(cè)BDNF、Caspase-3表達(dá)水平比較結(jié)果不一致，限制了結(jié)果解讀的一致性。

綜上所述，UTMD調(diào)控AS聯(lián)合NSCs移植能夠顯著改善TBI小鼠生化微環(huán)境，通過(guò)上調(diào)神經(jīng)保護(hù)因子表達(dá)并下調(diào)神經(jīng)損傷因子表達(dá)，可促進(jìn)TBI小鼠神經(jīng)功能修復(fù)。

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（收稿日期：2024-11-29）