miR-205-5p啟動子甲基化對子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細胞功能調(diào)控的研究

【摘要】 目的 探討miR-205-5p啟動子甲基化對子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）患者子宮內(nèi)膜細胞功能的調(diào)控作用。方法 選擇2022年10月至2023年12月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院行手術治療且經(jīng)病理證實的子宮內(nèi)膜組織標本，根據(jù)術中及病理結果分為不存在EMS病灶的對照組（n = 9）和存在EMS病灶的EMS組（n = 9）。提取和分離原代子宮內(nèi)膜基質細胞（ESC），采用甲基化特異性聚合酶鏈式反應（MSP）檢測細胞miR-205-5p啟動子甲基化水平，使用實時聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測去甲基化處理對miR-205-5p表達的影響，分別進行劃痕-愈合、細胞增殖、細胞凋亡以及細胞侵襲實驗檢測去甲基化對功能的調(diào)控。將人子宮內(nèi)膜碎屑埋植入皮下建立EMS小鼠模型，分為去甲基化處理組和對照組，分別于腹腔注射去甲基化制劑或生理鹽水，觀察2組小鼠皮下移植病灶體積及miR-205-5p表達情況。結果 正常ESC啟動子呈非甲基化。EMS組ESC啟動子呈甲基化或高甲基化，并且使用去甲基化藥物處理后，ESC的miR-205-5p mRNA表達水平升高，細胞遷移能力、增殖能力、侵襲能力減弱，細胞凋亡能力增強（均P lt; 0.05）。經(jīng)去甲基化處理后的小鼠較對照組小鼠的皮下移植病灶體積縮小，miR-205-5p表達陽性率升高（均P lt; 0.05）。結論 MiR-205-5p啟動子甲基化與ESC功能調(diào)控有關，可能參與了EMS發(fā)生、發(fā)展的過程。

【關鍵詞】 子宮內(nèi)膜異位癥；miR-205-5p；甲基化；子宮內(nèi)膜細胞

Regulatory effect of miR-205-5p promoter methylation on endometrial stromal cell function in patients with endometriosis

MA Song1， CAI Zhaoxia2， MA Ying1

（1. Department of Obstetrics and Gynecology， Zhujiang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510260， China；

2. Department of Obstetrics and Gynecology， Liwan District Maternal and Child Health Hospital， Guangzhou 510375， China）

Corresponding author： MA Ying， E-mail： mayingwuzhuoyi@126.com

【Abstract】 Objective To investigate the regulatory effect of miR-205-5p promoter methylation on endometrial stromal cell （ESC） function in patients with endometriosis （EMS）. Methods Endometrial tissue samples were collected from patients pathologically diagnosed with EMS undergoing surgery in Zhujiang Hospital of Southern Medical University from October 2022 to December 2023. According to intraoperative and pathological results， all samples were divided into the control group （n = 9， without EMS lesions） and EMS group （n = 9， with EMS lesions）. Primary ESCs were extracted and isolated. Methylation-specific polymerase chain reaction （MSP） was used to detect the methylation level of miR-205-5p promoter. RTPCR was used to evaluate the effect of demethylation on the expression level of miR-205-5p. The regulatory effect of demethylation on ESC function was detected by scratch wound healing， cell proliferation， cell apoptosis and Transwell assays， respectively. EMS mouse models were established by subcutaneous seeding of human endometrial debris. All mouse models were divided into the demethylation and control groups. Demethylating agents and normal saline were injected into abdominal cavity in these two groups， respectively. The lesion size and the expression level of miR-205-5p were observed in two groups. Results Normal ESC prompter was unmethylated. In the EMS samples， the miR-205-5p promoter was methylated or hypomethylated. After demethylation， the expression level of miR-205-5p in the ESC samples was significantly upregulated， the capability of cell migration， proliferation and invasion was significantly weakened， while the ability of cell apoptosis was significantly enhanced （all P lt; 0.05）. Compared with the control group， the lesion size was decreased and the positive rate of miR-205-5p expression was increased in the demethylation group （both P lt; 0.05）. Conclusion MiR-205-5p promoter methylation is related to the regulation of ESC function in patients with EMS， which is probably involved with the incidence and progression of EMS.

【Key words】 Endometriosis； miR-205-5p； Methylation； Endometrial stromal cell

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS）是一種由多種因素導致的慢性婦科疾病，是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質）出現(xiàn)在子宮體以外的部位［1］。EMS具有病變廣泛、難以治愈、雌激素依賴性等特點［2］，其主要癥狀是盆腔痛，這無疑會影響患者的生活質量［3-4］。綜合文獻報道，10%～15%的育齡婦女患有EMS，20%～50%的不孕癥婦女合并EMS［5］，慢性盆腔痛患者的發(fā)病率在近年增加到70%［6］。EMS的發(fā)病機制不明，除根治性手術外，普通藥物或常規(guī)手術治療后的復發(fā)率甚至超過50%［7］。多種因素導致的子宮內(nèi)膜基質細胞（endometrial stromal cell，ESC）侵襲性增強，是誘發(fā)EMS的重要因素［8］。目前尚無一種學說（經(jīng)血逆流、炎癥等）能夠獨立、全面解釋EMS的病理機制［9］，故仍需深入研究EMS病因。

微RNA（microRNA，miRNA）是真核生物中廣泛存在的、一種長約21～23個核苷酸的RNA分子［10-11］。其通過與目標mRNA上的互補序列結合，抑制轉錄后基因的表達，在調(diào)節(jié)基因表達、細胞周期進展和生物體發(fā)育方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。有研究顯示，miRNA可用作EMS的輔助診斷工具［12］，或用于EMS的檢測、研究進展和預防，這些miRNA參與多種細胞功能調(diào)控［13］，如細胞遷移、侵襲和凋亡［14］。MiR-205-5p是筆者團隊前期利用基因芯片測序篩選出的EMS特異性miRNA，該項研究顯示，miR-205-5p低表達可上調(diào)ANGPT2表達，增強ESC侵襲性，誘發(fā)EMS［15］。

已有研究表明，EMS的發(fā)生與發(fā)展是遺傳易感性與環(huán)境因素相互作用的結果，同時伴隨著表觀遺傳學的改變［16］。DNA甲基化是最常見、目前研究的最為清楚的一種表觀遺傳修飾方式［17］。根據(jù)現(xiàn)有研究，EMS的發(fā)生、發(fā)展伴隨著DNA異常甲基化表達［18］。因此，本研究提出科學假說：miR-205-5p啟動子甲基化可影響EMS患者ESC的功能。本研究進一步探索分子生物水平啟動子甲基化對miR-205-5p的表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選擇2022年10月至2023年12月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院行手術治療且經(jīng)病理證實的子宮內(nèi)膜組織標本。對照組入選標準：術中及病理證實不存在EMS病灶（9例）。研究組入選標準：術中及病理證實存在EMS病灶（9例）。病例納入標準：①年齡22～49歲；②月經(jīng)周期28～35 d，月經(jīng)周期規(guī)律，月經(jīng)量正常；③卵巢功能正常。病例排除標準：①術前6個月內(nèi)服用激素類藥物，包括促性腺激素釋放激素激動劑/拮抗劑、雌激素、孕激素、絨毛膜促性腺激素或左甲狀腺素等；②術前6個月內(nèi)有哺乳史或妊娠史的患者。本研究獲得南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院倫理委員會批準（批件號：2022-KY-249-01），并征得所有患者或其家屬的知情同意。

1.2 細胞分離及培養(yǎng)

在嚴格的無菌條件下，將新鮮獲得的子宮內(nèi)膜組織迅速浸入預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，在無菌條件下于37 ℃下用膠原酶酶解、過濾、離心，棄上清液，用PBS沖洗、重懸，于37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ESC原代細胞，必要時更換培養(yǎng)基以保持最佳的細胞黏附性和對數(shù)生長期。

1.3 MiR-205-5p啟動子甲基化檢測

待ESC細胞在培養(yǎng)瓶中達到最佳生長和覆蓋率（約90%）后，用胰蛋白酶將其從表面分離，并收集到無酶EP管中進行進一步處理。ESC以1×105/孔的密度在6孔板中分離和傳代，并在含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2。培養(yǎng)24 h后，EMS組開始使用不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）的DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dC 處理，對照組則加入等體積的培養(yǎng)基。隨后，每隔1～2天更新1次培養(yǎng)基。在處理后第3、5 、7天，收集細胞。按照南京諾唯贊生物科技股份有限公司DNA提取試劑盒說明書（FastPure? Viral DNA/RNA Mini Kit），提取EMS組和對照組細胞DNA，并設加水的空白對照。甲基化特異性聚合酶鏈式反應（methylation-specific PCR，MSP）法處理各組細胞，抽取擴增樣品用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。

1.4 實時聚合酶鏈式反應檢測去甲基化對miR-205-5p表達的影響

按前述方法收集經(jīng)10.0 μmol/L 5-Aza-dC處理7 d的EMS組ESC細胞，使用 TB GreenTM Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus）通過TB Green法進行實時聚合酶鏈式反應（real time polymerase chain reaction，RT-PCR）。反應條件：95 ℃ 30 s預變性；60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共43循環(huán)，72 ℃ 10 min 延伸。使用2-ΔΔCt 法計算miR-205-5p mRNA表達水平。miR-205-5p引物序列見表1。

1.5 去甲基化對ESC功能的調(diào)控

1.5.1 細胞鑒定

取EMS組經(jīng)10.0 μmol/L 5-Aza-dC處理7 d的ESC細胞（去甲基化處理組）和未經(jīng)去甲基化處理的ESC細胞（對照組），PBS洗培養(yǎng)皿3次后固定，在室溫下用0.5% Triton-X-100處理20 min。在每張載玻片上滴加200 μL脫脂牛奶，再用冷PBS沖洗3次。然后加入一抗，在室溫下結合30 min，再轉移到溫室中在4 ℃孵育過夜。再加入二抗37 ℃孵育1 h；染核后將玻片轉移至載玻片中封片；共聚焦熒光顯微鏡觀察并采集圖片。

1.5.2 細胞遷移實驗

取EMS組經(jīng)10.0 μmol/L 5-Aza-dC處理7 d的ESC細胞（去甲基化處理組）和未經(jīng)去甲基化處理的ESC細胞（對照組），采用劃痕-愈合實驗檢測細胞遷移能力。將ESC接種于6孔板（約5×105/孔），培養(yǎng)24 h后待細胞豐度達95%以上時，用槍頭在板中垂直劃痕后用PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一段時間觀察并記錄細胞遷移情況。任意選取水平線，通過Image J軟件計算各細胞間的距離。劃痕愈合率為最終痕跡面積與初始痕跡面積之差除以初始痕跡面積。

1.5.3 細胞增殖實驗

取EMS組經(jīng)10.0 μmol/L 5-Aza-dC處理7 d的ESC細胞（去甲基化處理組）和未經(jīng)去甲基化處理的ESC細胞（對照組），使用細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測ESC增殖情況。將ESC懸液分別接種于96孔板（3 000個/孔），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h后分別加入CCK-8溶液10 μL，在酶標儀上測定450 nm波長處的光密度（D）值，并計算2組的細胞增殖率。細胞增殖率=（D研究組-D空白組）/（D對照組-D空白組）×100%。

1.5.4 細胞凋亡實驗

取EMS組經(jīng)10.0 μmol/L 5-Aza-dC處理7 d的ESC細胞（去甲基化處理組）和未經(jīng)去甲基化處理的ESC細胞（對照組），以流式細胞術檢測ESC凋亡，從培養(yǎng)箱中取出黏附的細胞，吸出生長培養(yǎng)基，然后用冷PBS沖洗細胞3次，含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetra- acetic acid，EDTA）的適量胰酶消化細胞1 min，加入2倍體積的基礎培養(yǎng)基終止消化，細胞懸液轉移至5 mL離心管中1 000轉/

分離心5 min，棄上清；預冷PBS重懸細胞2次，1 000轉/分離心5 min，棄上清；1 mL預冷PBS重懸細胞沉淀。然后將ESC懸液轉移至5 mL流式管中，避光加入5 μL Annexin Ⅴ/FITC和10 μL

碘化丙啶，室溫下孵育0.5 h后，在流式細胞儀中分析。

1.5.5 細胞侵襲實驗

取EMS組經(jīng)10.0 μmol/L 5-Aza-dC處理7 d的ESC細胞（去甲基化處理組）和未經(jīng)去甲基化處理的ESC細胞（對照組），應用Transwell實驗檢測ESC侵襲能力。將待用的ESC在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12 h，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調(diào)整為5×105/mL。上室加入100 μL細胞懸液，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μL

及5%雙抗的DMEM培養(yǎng)基。24 h后取出小室，用干棉簽拭去內(nèi)表面的細胞，細胞在4%多聚甲醛中固定30 min，室溫下用0.1%結晶紫染色20 min，

清洗，晾干，隨機拍攝5個視野并計數(shù)。

1.6 動物實驗

1.6.1 人子宮內(nèi)膜碎屑皮下注射建立EMS小鼠

模型

動物實驗選用的6～10周齡雌性小鼠（體質量18～22 g）購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，每6只放1籠，共12只，動物實驗方案經(jīng)南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院倫理委員會審核（批件號：LAEC-2022-179）。EMS小鼠模型的建立：取小鼠下腹部為手術部位，2%碘酊、75%酒精消毒后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后（約3～5 min），將其固定在手術板上，腹部手術部位再次用2%碘酊、75%酒精消毒，常規(guī)鋪巾。小鼠腹部皮膚剪開一約0.5 cm切口，鈍性分離皮膚與皮下組織直徑約4～5 mm，將人子宮內(nèi)膜碎屑埋植入皮下，縫合后消毒，覆蓋無菌輸液貼。術后分籠飼養(yǎng)，實驗前后稱其體質量，并觀察小鼠情況。術后每天觀察小鼠傷口及生活情況，每周檢查皮下種植組織3次，觀察皮下結節(jié)的生長情況，埋植組織處形成粟粒大小的結節(jié)為EMS小鼠模型制備成功。

1.6.2 干預方式

12只小鼠隨機分為去甲基化處理組與對照組。去甲基化處理組以1 mL無菌注射器抽取10.0 μmol/L

5-Aza-dC，75%酒精消毒小鼠腹部皮膚，予小鼠腹腔注射，每周1次，對照組予同時點同方法注射同體積生理鹽水。第5周頸椎脫臼法處死小鼠，測量離體腹部皮下移植病灶的長（l）、寬（b）、高（h），然后將皮下移植病灶置于甲醇中常溫固定備用。移植病灶體積計算公式為V=lbhπ/6。

1.6.3 原位雜交檢測miR-205-5p在皮下移植病灶中的表達

皮下移植病灶標本固定脫水、包埋，切片，連續(xù)5張切片，其中一張送常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察以確定診斷。其余4張切片完成后將切片烘干后脫蠟；0.1 mol/L甘氨酸glycine、0.3%Triton-X-100分別常溫浸沒；沖洗后使用胃蛋白酶處理；振蕩漂洗；在每張切片上滴加40 μL預雜交液，置于60℃濕盒30 min；去除預雜交，置于搖床上過夜；加入封閉液；切片組織中滴加抗地高辛生物素標記的抗體，37 ℃孵育；滴加緩沖液覆蓋組織，孵育后PBS洗3次，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色混合液避光2 h終止染色；染核2 min，沖洗切片。鏡下隨機選取3個高倍視野，拍攝、計算并記錄。陽性細胞比例為每個視野下陽性細胞數(shù)與每個視野下細胞總數(shù)的商乘以100%。

1.7 統(tǒng)計學方法

每個獨立實驗均重復3次，采用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布計量資料以表示，單組比較采用單樣本t檢驗，兩組比較滿足方差齊性用獨立樣本t檢驗，不滿足方差齊性用校正t檢驗；雙側P lt; 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-205-5p啟動子甲基化的MSP檢測

MSP檢測子宮內(nèi)膜組織樣本miR-205-5p啟動子甲基化情況，結果顯示正常ESC啟動子呈非甲基化，EMS組啟動子呈甲基化或高甲基化并且使用去甲基化藥物處理后，MSP檢測到相應的啟動子甲基化水平降低，見圖1A。隨著去甲基化藥物時間濃度梯度增加，miR-205-5p啟動子甲基化水平逐漸降低，見圖1B。研究組9例ESC，給予去甲基化藥物處理后，ESC的miR-205-5p表達水平較對照組升高（P lt; 0.001），見圖1C。

2.2 去甲基化對ESC的影響

2.2.1 ESC及腺上皮細胞鑒定

原代培養(yǎng)的ESC及腺上皮細胞在接種后3～8 d接近鋪滿。ESC可用0.03%EDTA傳代，傳代后3～5 d鋪滿，10代以內(nèi)形態(tài)基本不變。采用免疫熒光鑒定ESC為波形蛋白陽性呈棕黃色，而腺上皮細胞為角蛋白陽性呈綠色，見圖2。

2.2.2 去甲基化后ESC遷移能力降低

采用劃痕試驗檢測ESC遷移能力，分別培養(yǎng)6、12、48、72、96 h拍照，Image J軟件計算各ESC的距離。與對照組比較，去甲基化組ESC劃痕愈合率降低，ESC遷移能力明顯受抑制（P lt; 0.01）。見圖3。

2.2.3 去甲基化后ESC增殖能力降低

CCK-8法檢測18例ESC（對照組9例，去甲基化組9例）活力，在72、96 h組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P lt; 0.05）。與對照組相比，去甲基化處理組ESC增殖能力明顯降低。見圖4。

2.2.4 去甲基化后ESC凋亡能力增強

流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組比較，去甲基化處理組ESC凋亡率升高（P = 0.042），見圖5。

2.2.5 去甲基化后ESC侵襲能力降低

Transwell實驗結果顯示，去甲基化組ESC侵襲能力明顯下降且差異具有統(tǒng)計學意義（P = 0.009），見圖6。

2.3 去甲基化抑制小鼠皮下異位病灶生長

去甲基化處理組較對照組皮下異位病灶體積明顯縮?。≒ lt; 0.001），見圖7A。去甲基處理后，小鼠皮下病灶中miR-205-5p表達升高（P = 0.010），見圖7B、C。

3 討 論

EMS是生育年齡婦女的常見病，其發(fā)病與遺傳、免疫、雌激素暴露及腸道菌群失調(diào)有關［19］，一直以來都是婦科臨床研究的熱點。由于EMS的復雜性，目前尚無有效的早期診斷分子標志物［20］。雖然EMS屬于良性疾病，但其臨床特征與惡性腫瘤相同，如增生、浸潤、轉移和復發(fā)等［21］。本研究從表觀遺傳學角度出發(fā)，探索EMS發(fā)生、發(fā)展。

MiRNA是一類長度約為19～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA［22］，近年來多項研究顯示miRNA在EMS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［23］，包括介導細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和上皮-間質轉化過程［24］。目前的研究顯示，miR-205-5p參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。如Huang等［25］研究發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p可以抑制氧化修飾低密度脂蛋白誘導的人主動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移。Huang等［26］miR-205-5p通過靶向血管內(nèi)皮生長因子A和PI3K/Akt信號通路，為透明細胞型腎細胞癌的治療提供了潛在的治療靶點。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p在EMS組織中的表達水平較正常子宮內(nèi)膜降低，上調(diào)miR-205-5p抑制了EMS來源ESC的遷移和侵襲能力，且促進了細胞的凋亡［27］。近年研究顯示，表觀遺傳學參與調(diào)控EMS的發(fā)生、發(fā)展，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA。EMS可能涉及表觀遺傳變化，各種表觀遺傳畸變，特別是異常的DNA甲基化可能在EMS的發(fā)病機制中起重要作用［28］。Esfandiari等［29］報道，與正常子宮內(nèi)膜相比，大多數(shù)Hox簇（A～D）和Hox輔因子顯示異位或在位子宮內(nèi)膜組織和異位或在位子宮內(nèi)膜甲基化改變有差異。Hao等［30］報道了粒狀頭樣2（grainyhead-like 2，GRHL2）啟動子高甲基化引起的GRHL2低表達與卵巢子宮內(nèi)膜異位。Li等［31］報道了子宮腺肌病上皮和間質DNA甲基化與正常子宮內(nèi)膜存在差異。本研究進一步探索啟動子甲基化對miR-205-5p的表達進行調(diào)控，結果顯示，EMS組ESC給予去甲基化處理后的miR-205-5p表達水平較前升高，并且同時可以調(diào)控ESC功能。

本研究首先使用MSP檢測ESC miR-205-5p啟動子甲基化程度在EMS患者及非EMS人群中的差異。明確了非EMS組啟動子呈非甲基化，EMS啟動子呈甲基化或高甲基化，這與既往研究相符。使用去甲基化藥物處理miR-205-5p表達降低或缺失的細胞后，相應的啟動子甲基化水平降低。本研究通過RT-PCR檢測到給予去甲基化藥物處理后，ESC的 miR-205-5p表達量較之前明顯升高。動物實驗也同時檢測到經(jīng)注射去甲基化制劑的小鼠miR-205-5p在皮下移植病灶中的表達較未注射去甲基化制劑的小鼠高。目前的研究結果證實，EMS人群在miR-205-5p 啟動子區(qū)呈高甲基化。這些結果表明，EMS組miR-205-5p的表達缺失或降低，與其上游調(diào)控區(qū)的高甲基化狀態(tài)有關。經(jīng)過去甲基化處理后的EMS啟動子區(qū)甲基化仍存在，可能與其染色質異構及分化方向等有關。隨后檢測ESC的功能發(fā)現(xiàn)，EMS組經(jīng)去甲基化處理后ESC的遷移、增殖及侵襲能力明顯抑制，凋亡能力明顯增強。

本研究探討了miR-205-5p表達與EMS發(fā)生、發(fā)展之間的關系，結果顯示，EMS組織中的miR-205-5p表達水平比正常子宮內(nèi)膜組織降低。進一步分析發(fā)現(xiàn)，EMS細胞株中miR-205-5p的表達水平下調(diào)可能是由于其啟動子高甲基化所致。研究結果提示，miR-205-5p的表達水平及其甲基化狀態(tài)可能是評價EMS的潛在指標，對EMS的預防、診斷和治療可能有一定價值。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

參 考 文 獻

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（責任編輯：林燕薇）