李PsNAC基因家族鑒定及其在空腔褐變果實(shí)中的表達(dá)模式分析

摘 " "要：【目的】NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)逆境脅迫過(guò)程，被認(rèn)為是植物次生細(xì)胞壁生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一級(jí)開關(guān)。鑒定李PsNAC轉(zhuǎn)錄因子家族，探索其與皇冠李果實(shí)空腔褐變的關(guān)系?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)方法，分析李PsNAC家族成員、理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育和基因結(jié)構(gòu)等，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，分析PsNACs在空腔褐變皇冠李果實(shí)中的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】李PsNACs包含115個(gè)成員，不均勻地分布在8條染色體上，可分為17個(gè)亞族，與植物次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的OsNAC003和OsNAC7亞族分別含6和10個(gè)PsNACs。PsNACs啟動(dòng)子區(qū)域含有豐富的激素響應(yīng)元件和MYB結(jié)合位點(diǎn)。10個(gè)PsNACs在皇冠李空腔褐變果實(shí)中的表達(dá)量均高于非空腔褐變果實(shí)?！窘Y(jié)論】本結(jié)果為研究PsNAC家族成員與皇冠李果實(shí)空腔褐變的具體關(guān)聯(lián)性奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：皇冠李；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因家族；空腔褐變；基因表達(dá)量

中圖分類號(hào)：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2025）01-0048-15

Identification of plum PsNAC gene family and its expression patterns in development of fruit hollowness and browning

DENG Honghong， PENG Chao#， LIANG Xi， ZHANG Ziyang， LIU Junwei， LI Binqi， WEI Mingkang， WANG Xueying， LI Liumin， CHEN Faxing*

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， Fujian， China）

Abstract： 【Objective】 The NAC transcription factor family is one of the plant-specific transcription factor families and plays a pivotal role in plant growth and development and responses to biotic and abiotic stresses. Huangguan plum is a newly developed high-quality plum variety bred by our team specifically suited for cultivation in Fujian Province， China. Its fruit has the advantages of excellent taste， pleasant flavor， and rich nutrient profile. However， in our previous long-term observations， Huangguan plum has been found to be prone to fruit hollowness and browning （HB）， characterized by rough and crystalline fruit pulp surfaces undergoing lignification and browning. We found that lignin biosynthesis and accumulation is one of the predominant biochemical responses to HB. The NAC transcription factor is recognized as the primary regulator in the transcriptional control of plant secondary wall synthesis. This study aims to characterize the PsNAC gene family members in plum and investigate their association with fruit HB in Huangguan plum. 【Methods】 The molecular weight， theoretical isoelectric point， and other physicochemical properties were predicted by the online tool ExPASy. The subcellular localization of PsNACs was predicted by the online software WoLF PSORT. The MEGA 11 software was used to construct a phylogenetic tree. The online tool Simple MEME Wrapper was used to analyze the motifs. The conserved motifs and gene structure maps were drawn by Tbtools. To analyze the cis-acting elements in the promoter region of PsNACs， the upstream 2000 bp promoter sequences were extracted from the genomic sequences and submitted to the Plant TBDB website for the identification of cis-elements in the promoter region. The analysis results were organized and displayed using Simple BioSequence Viewer. The expression of ten PsNACs in Huangguan fruit with and without HB was analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. 【Results】 There are 115 PsNAC members identified in Prunus salicina Lindl.， with protein sequences ranging from 182 to 861 amino acids， molecular weights from 20.98 to 95.97 ku， theoretical isoelectric points from 4.43 to 9.55， and the instability index from 27.84 （PsNAC60） to 61.36 （PsNAC087）. The grand average of hydropathy values of PsNAC gene family members were negative， indicating that these proteins are hydrophilic in nature. Transmembrane structure analysis revealed that 94% of PsNAC gene family members do not possess a transmembrane domain. The subcellular localization prediction results showed that 91 PsNAC gene family members were located in the nucleus， and the rest were distributed in structures such as the cytoplasm， Golgi apparatus， peroxisome， cytoskeleton， mitochondria， chloroplasts， plasma membrane， and vacuole. Chromosomal localization analysis revealed uneven distribution across the plum’s eight chromosomes， with chromosomes 2 and 3 harboring the highest number counts （17.4%）， followed by chromosome 5 （15.2%）， and the fewest on chromosomes 6 and 7 （10 PsNACs each）. Phylogenetic tree analysis between Arabidopsis thaliana and P. salicina Lindl. classified PsNAC genes into 17 subfamilies， with 6 and 10 members clustered in OsNAC003， and OsNAC7， respectively， which are associated with plant secondary wall biosynthesis. The number of coding sequence segments in PsNACs ranged from 1 to 8， with most containing 3 to 6 segments. Analysis of gene annotation files identified a total of 10 conserved motifs among PsNACs， with varying positions and frequencies. Motif 1， motif 2， motif 3， and motif 6 were found in the majority of PsNACs， typically located towards the N-terminus of the sequences. PsNAC members within the same subfamily exhibited similar motif distributions and gene structure characteristics including the CDS and UTR regions， suggesting potential functional similarity. Analysis of the 2000 bp upstream sequences from the transcription start site of PsNACs identified a total of 3069 cis-elements. The most significant core elements included phytohormone-responsive elements， MYB binding sites， low temperature responsiveness， drought-inducible elements， and light-responsive elements. Intraspecific synteny analysis revealed that the PsNAC gene family contained 13 pairs of duplicated genes within the plum genome. The relative expression levels of PsNAC26， PsNAC57， PsNAC77， and PsNAC95 were highest at the fruit expansion period and gradually decreased as fruit development progressed. Conversely， PsNAC54 and PsNAC74 exhibited their lowest expression levels at the fruit expansion period， and increased gradually with fruit development and ripening. The expression levels of PsNAC26， PsNAC57， PsNAC77， PsNAC95， PsNAC54， and PsNAC74 were higher in Huangguan fruit showing hollowness and browning compared to those without. 【Conclusion】 This study represents the first comprehensive analysis of the PsNAC gene family in plum， identifying and characterizing 115 members of the PsNAC gene family. We explored their physical and chemical properties， gene structures， chromosome locations， phylogenetic relationships， and subcellular localization characteristics. Furthermore， using qRT-PCR technology， we investigated the gene expression patterns of PsNAC gene family members in Huangguan fruit exhibiting HB and non-HB across various developmental stages. The findings of this study will serve as a crucial foundation for further exploration into the biological functions of PsNAC gene family and the molecular mechanism by which PsNAC gene family members regulate fruit HB in Huangguan plum.

Key words： Huangguan plum; NAC transcription factor; Gene family; Fruit hollowness and browning; Gene expression

轉(zhuǎn)錄因子是植物生長(zhǎng)發(fā)育和外部（非）生物脅迫響應(yīng)的主要調(diào)控因子[1]。目前已知植物中存在的轉(zhuǎn)錄因子有58種，其中，NAC轉(zhuǎn)錄因子是超大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，是植物特有的基因家族[2]。NAC這一命名源自矮牽牛（Petunia hybrida）的NAM（no apical meristem）基因、擬南芥（Arabipopsis thaliana）的ATAF1/ATAF2（actiation factor 1/2）基因和CUC2（cup-shaped cotyledon 2）基因的首字母[3]。NAC蛋白的N末端區(qū)域含有約150個(gè)高度保守氨基酸的NAC結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)DNA結(jié)合和二聚體形成，可分為A～E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)，其中A、C和D高度保守，B和E較為多變。NAC蛋白的C端由一些簡(jiǎn)單氨基酸重復(fù)序列構(gòu)成高度可變的調(diào)控區(qū)域（transcription regulation region，TRR），具有蛋白結(jié)合活性，能夠轉(zhuǎn)錄激活或者抑制[4]。

植物基因組中NAC轉(zhuǎn)錄因子成員眾多，目前已在多種植物鑒定出這一家族成員，包括模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana，117個(gè)）[5]和毛果楊（Populus trichocarpa，170個(gè)）[6]、作物水稻（Oryza sativa，151）[5]、玉米（Zea mays，148個(gè)）[7]和大豆（Glycine max，152個(gè)）[8]、蔬菜作物番茄（Solanum lycopersicum，93個(gè)）[9]、辣椒（Capsicum annuum，104個(gè)）[10]、大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis，188個(gè)）[11]和果樹作物蘋果（Malus domestica，180個(gè)）[12]、梨（Pyrus bretschneideri，185）[13]、火龍果（Hylocereus undatus，64個(gè)）[14]、菠蘿（Ananas comosus，73個(gè)）[15]、歐李（Cerasus humilis，76個(gè)）[16]。

研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物多種生命代謝活動(dòng)，包括在植物調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫[17-20]、花器官形成[21]、器官邊界和植物形態(tài)建成[22-23]、次生細(xì)胞壁形成與增厚[24-25]、芽和根尖分生組織形成[1，26]、側(cè)根發(fā)育[20，27]、纖維發(fā)育[24]、植株衰老調(diào)節(jié)[28]、果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育[29]、果實(shí)風(fēng)味形成[30-31]、果實(shí)成熟[1，32]等方面發(fā)揮著重要作用。

皇冠李（Prunus salicina Lindl. var. cordata ‘Huangguan’）是筆者團(tuán)隊(duì)選育的一種適宜福建地區(qū)栽培的優(yōu)質(zhì)柰李新品種。該品種于2018年12月通過(guò)福建省林木良種審定，編號(hào)為閩S-SV-PS-2018?；使诶畹墓麑?shí)呈鮮亮的黃色，口味鮮甜，風(fēng)味濃郁，成熟期在5月底至6月初，是早熟柰李的優(yōu)新品種。然而，皇冠李是屬于典型的柰李類，存在的突出問(wèn)題是果實(shí)內(nèi)部的核頂端常與果肉分離，形成蛀孔狀（似蟲蛀而非蟲蛀）的空腔（hollowness，or cavity）。筆者課題組前期的長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象使得空腔周圍的果肉表面變得粗糙呈結(jié)晶狀，同時(shí)出現(xiàn)木質(zhì)化（lignification）褐變（化）（browning），降低了果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)與商品價(jià)值。這種空腔褐變特征，可能會(huì)讓消費(fèi)者誤認(rèn)為是爛果，從而對(duì)產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

果肉組織的木質(zhì)化過(guò)程是木質(zhì)素積累的結(jié)果，受到木質(zhì)素生物合成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)基因調(diào)控[33-34]。木質(zhì)素生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中轉(zhuǎn)錄因子如NAC、MYB、WRKY和bHLH等在調(diào)控木質(zhì)素生物合成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在這些轉(zhuǎn)錄因子中，NAC和MYB被認(rèn)為是木質(zhì)素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵上游轉(zhuǎn)錄因子，擔(dān)任主調(diào)節(jié)開關(guān)角色[37]。NAC轉(zhuǎn)錄因子特別被視為植物次生壁生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一級(jí)開關(guān)[35-37]。

本研究利用生物信息學(xué)手段，鑒定李PsNAC基因家族成員，并系統(tǒng)分析PsNAC家族基因的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化、亞細(xì)胞定位等特征，采用qRT-PCR技術(shù)分析PsNAC家族基因在皇冠李不同發(fā)育時(shí)期的空腔褐變果和非空腔褐變果的基因表達(dá)模式。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究PsNAC家族基因的生物學(xué)功能、尋找可能參與木質(zhì)素合成調(diào)控柰李果實(shí)空腔褐變的PsNAC候選基因提供重要參考，并有望為未來(lái)制定柰李果實(shí)空腔褐變防控技術(shù)方案、品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 基因家族成員鑒定、染色體定位和理化性質(zhì)分析

從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載NAC.hmm（PF01849）和NAM.hmm（PF02365）隱馬爾結(jié)構(gòu)域模型，利用TBtools軟件的Simple HMM search功能鑒定李NAC家族蛋白序列（E-value設(shè)定為1e-5）。利用NCBI在線CD-search工具，檢測(cè)候選蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，剔除冗余和無(wú)效基因模型，最終獲得PsNAC基因家族成員及其序列信息。

基于三月李（P. salicina Lindl.）基因組注釋的GFF文件，采用TBtools對(duì)PsNAC基因家族成員進(jìn)行染色體定位分析，并根據(jù)它們?cè)谌旧w上的位置順序進(jìn)行重命名。

利用ExPASy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）分析PsNAC家族成員的理化性質(zhì)，包括等電點(diǎn)、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)、氨基酸數(shù)目等。使用SignaIP4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預(yù)測(cè)這些PsNAC家族成員是否存在信號(hào)肽。采用TMHMM 2.0（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預(yù)測(cè)PsNAC家族成員的跨膜結(jié)構(gòu)、利用WoLF PSORT網(wǎng)站（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）預(yù)測(cè)PsNAC家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.2 基因家族成員多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/）獲取擬南芥NAC基因（125個(gè)）的蛋白序列，采用MEGA 11軟件的ClustalW進(jìn)行李和擬南芥NAC蛋白序列比對(duì)，去除差異較大的氨基酸序列。采用Neihgbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap設(shè)置為1000次）。利用iTOL網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/tree/）美化系統(tǒng)進(jìn)化樹。最后參考已知的擬南芥NAC基因家族分類信息，對(duì)構(gòu)建好的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行亞族分類。

1.3 基因家族成員保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)亞族分類結(jié)果，利用TBtools的Simple MEME Wrapper功能對(duì)PsNAC家族的保守基序進(jìn)行分析，最大motif數(shù)設(shè)置為20，其他參數(shù)為默認(rèn)值。根據(jù)生成的XML文件和家族成員ID，使用TBtools將PsNAC亞族成員的保守基序進(jìn)行可視化繪制。根據(jù)三月李基因注釋文件，使用TBtools將PsNAC亞族成員的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化繪制。

1.4 基因家族成員的啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

根據(jù)三月李基因組文件和基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件，使用TBtools篩選PsNAC家族成員基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp的序列，并將這些序列上傳到Plant TFDB網(wǎng)站，進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件的預(yù)測(cè)與分析。最后，通過(guò)TBtools的Simple BioSequence Viewer功能，將篩選出的啟動(dòng)子順式作用元件數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化展示。

1.5 基因家族成員共線性分析

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //www. arabidopsis.org/）下載擬南芥基因組和基因注釋文件，從三月李基因組（https：//www.rosaceae.org/Analysis/9450778）下載全基因組文件和注釋文件，利用MCScanX軟件對(duì)這2個(gè)物種進(jìn)行共線性比較。

1.6 PsNAC基因家族成員的表達(dá)模式分析

以皇冠李不同發(fā)育時(shí)期，包括膨大期、轉(zhuǎn)色期、成熟期和后熟期的果實(shí)作為試驗(yàn)材料，采自福建省寧德市古田縣旸谷村李園（E 118°49′4″，N 26°39′3″，海拔280 m）。選取樹齡為5年，株行距3.5 m′4.0 m，生長(zhǎng)一致、長(zhǎng)勢(shì)良好，水肥管理水平一致的植株為采樣樹。采樣時(shí)，選擇樹體東、南、西、北四個(gè)方向高度一致、外圍花束狀果枝上果形均勻一致的果實(shí)，每3株樹的樣本作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用冰盒放置帶回實(shí)驗(yàn)室。用手術(shù)刀將果實(shí)切開，判斷是否為空腔褐變果實(shí)。

采用qRT-PCR技術(shù)分析PsNAC家族基因的相對(duì)表達(dá)量。采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441，天根生化科技北京有限公司，北京）提取RNA，M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司，北京）合成cDNA第一鏈。使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，選用Actin為內(nèi)參基因（表1），引物由擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。qRT-PCR反應(yīng)使用LightCycler 480 SYBR Green I Master試劑盒（Roche），通過(guò)2-??CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsNAC基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)特征

通過(guò)三月李NAC轉(zhuǎn)錄因子特異隱馬可夫模型文件的構(gòu)建及對(duì)三月李蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的二次搜索，共提取到117個(gè)PsNAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員。經(jīng)過(guò)NCBI CD-search功能驗(yàn)證蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，剔除冗余和無(wú)效基因模型，最終獲得了115個(gè)PsNAC轉(zhuǎn)錄因子基因。根據(jù)其在染色體位置的排列順序，依次編號(hào)為PsNAC01～PsNAC115。

對(duì)PsNAC家族基因蛋白序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，如表2所示，PsNACs編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列長(zhǎng)度范圍是182（PsNAC98）至861（PsNAC95）個(gè)，平均氨基酸數(shù)量366個(gè)。蛋白理論等電點(diǎn)值（pI）分布在4.43～9.55之間，其中86個(gè)為酸性蛋白，29個(gè)為堿性蛋白。相對(duì)分子質(zhì)量在20 980.52（PsNAC98）～95 967.63（PsNAC95）之間。不穩(wěn)定指數(shù)范圍在27.64（PsNAC60）～61.36（PsNAC093），其中，108個(gè)PsNAC家族成員不穩(wěn)定指數(shù)大于35，7個(gè)PsNAC家族成員不穩(wěn)定指數(shù)則小于35。PsNAC家族成員的GRAVY值均為負(fù)數(shù)，說(shuō)明這些PsNAC家族成員蛋白均為親水性蛋白。

跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，94%的PsNAC家族成員沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，而PsNAC14、PsNAC80、PsNAC85、PsNAC95、PsNAC105和PsNAC107則各含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，僅PsNAC112具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，91個(gè)PsNAC家族成員位于細(xì)胞核，其余分布于細(xì)胞質(zhì)、高爾基體、過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞骨架、線粒體、葉綠體、質(zhì)膜和液泡等結(jié)構(gòu)中。

2.2 PsNAC基因染色體定位

染色體定位結(jié)果（圖1）顯示，115個(gè)PsNAC基因不均勻地定位到8對(duì)染色體上，其中，第2號(hào)和3號(hào)染色體上分布的PsNAC家族成員最多（占17.4%），其次是第5號(hào)染色體上（占15.7%），第6號(hào)和7號(hào)染色體上分布的基因數(shù)量最少，僅含有10個(gè)PsNACs。

2.3 PsNAC多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用擬南芥NAC基因序列作為對(duì)照，可將PsNACs分為17個(gè)亞族，不同亞族在功能和進(jìn)化關(guān)系上存在差異。OsNAC8和ANC063亞族不含PsNAC家族成員，其余亞族均含有數(shù)量不等的PsNAC家族成員。NAC-C和TIP亞族的PsNAC家族成員數(shù)量超過(guò)20個(gè)，其中NAC-C亞族包含PsNAC家族成員數(shù)量最多，為26個(gè)。OsNAC003亞族含6個(gè)PsNAC家族成員，分別是PsNAC22、PsNAC23、PsNAC54、PsNAC56、PsNAC57和PsNAC115；OsNAC7亞族含10個(gè)PsNAC家族成員，分別是PsNAC1、PsNAC51、PsNAC63、PsNAC64、PsNAC84、PsNAC86、PsNAC90、PsNAC93、PsNAC94和PsNAC114（圖2）。

2.4 PsNAC家族成員保守基序和基因結(jié)構(gòu)

PsNAC基因的CDS片段數(shù)量在1～8個(gè)不等，多數(shù)PsNAC基因具有3～6個(gè)CDS片段?；诨蜃⑨屛募姆治?，共識(shí)別出10個(gè)保守motifs，它們的分布位置和數(shù)量在PsNAC基因中并不完全一致。其中，motif 1、motif 2、motif 3和motif 6出現(xiàn)的次數(shù)最多，且通常是依次分布在N端。同一個(gè)亞族的PsNAC成員具有相似的motif分布和基因結(jié)構(gòu)（包括CDS和UTR區(qū)域），這說(shuō)明每個(gè)亞族的PsNAC成員可能具有類似的功能。PsNAC33和PsNAC95所具有的motif數(shù)量最少，僅有3個(gè)（圖3）。

2.5 PsNAC家族成員啟動(dòng)子順式作用元件

為便于預(yù)測(cè)PsNAC基因所具有的潛在功能，對(duì)PsNAC基因起始密碼子ATG上游2000 bp的序列進(jìn)行分析，共預(yù)測(cè)到3069個(gè)功能不同的順式作用元件（圖4）。其中，最主要的響應(yīng)元件是植物激素響應(yīng)元件，包括茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（MeJA-responsive element，320個(gè)）、脫落酸響應(yīng)元件（abscisic acid-responsive element，296個(gè)）、赤霉素響應(yīng)元件（gibberellin-responsive element，127個(gè)）和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（auxin-responsive element，78個(gè)）。此外，在非生物脅迫中，PsNAC家族還含有87、64和49個(gè)響應(yīng)元件，分別參與干旱誘導(dǎo)反應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)（MYB binding site involved in drought-inducibility）、參與低溫（Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness）和光（MYB binding site involved in light responsiveness）響應(yīng)。

2.6 PsNAC基因家族種內(nèi)共線性

為了鑒定PsNAC基因家族內(nèi)是否存在基因復(fù)制現(xiàn)象，通過(guò)MCScanX共線性分析，總共鑒定出16對(duì)片段重復(fù)基因復(fù)制事件（圖5，紅線相連的是基因復(fù)制事件的基因?qū)Γ?，片段重?fù)是PsNAC基因家族進(jìn)化重要事件。其中，PsNAC37與PsNAC19、PsNAC29與PsNAC56、PsNAC28與PsNAC96、PsNAC26與PsNAC58、PsNAC96與PsNAC56、PsNAC80與PsNAC94、PsNAC93與PsNAC1、PsNAC94與PsNAC71發(fā)生的是兩兩基因片段復(fù)制，PsNAC97、PsNAC59與PsNAC58，PsNAC79、PsNAC94與PsNAC95，PsNAC29、PsNAC28與PsNAC96發(fā)生的是3個(gè)基因之間的基因片段復(fù)制。PsNAC13、PsNAC14、PsNAC113與PsNAC114發(fā)生的是4個(gè)基因之間的基因片段復(fù)制。根據(jù)片段重復(fù)的基因結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，推測(cè)這些片段重復(fù)基因的功能可能存在相似性。

2.7 PsNAC基因家族在空腔褐變皇冠李果實(shí)中的表達(dá)模式分析

植物次生細(xì)胞壁加厚過(guò)程包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的合成，同時(shí)結(jié)合PsNAC基因家族成員的順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)10個(gè)PsNAC基因家族成員的基因表達(dá)量進(jìn)行了分析（圖6）。其中，PsNAC57、PsNAC54和PsNAC51既是OsNAC7和OsNAC003的亞族成員，又同時(shí)具有生長(zhǎng)素和赤霉素響應(yīng)元件，在激素參與木質(zhì)素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。PsNAC26、PsNAC57、PsNAC77和PsNAC95在果實(shí)膨大期的基因相對(duì)表達(dá)量最高，隨果實(shí)發(fā)育逐漸降低，在空腔褐變果實(shí)中的表達(dá)量高于非空腔褐變果。PsNAC54和PsNAC74在果實(shí)膨大期的表達(dá)量最低，隨果實(shí)發(fā)育逐漸上升，在空腔褐變果實(shí)中的表達(dá)量高于非空腔褐變果。PsNAC22和PsNAC23在果實(shí)膨大期基因相對(duì)表達(dá)量最高，隨果實(shí)發(fā)育呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。PsNAC51基因相對(duì)表達(dá)量隨果實(shí)發(fā)育呈現(xiàn)先下降后上升的波動(dòng)變化，后熟期的相對(duì)表達(dá)量最低，而PsNAC107在各時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量基本保持不變。

3 討 論

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵御病原菌、響應(yīng)非生物脅迫（如干旱、高鹽和低溫等）以及調(diào)控果實(shí)品質(zhì)等方面發(fā)揮著重要作用。盡管對(duì)NAC基因家族的鑒定和功能分類在多種植物中已有廣泛的研究，但NAC轉(zhuǎn)錄因子在李的系統(tǒng)性研究方面尚不充分。木質(zhì)素與果實(shí)品質(zhì)和風(fēng)味密切相關(guān)，其過(guò)度積累可能導(dǎo)致園藝植物的果實(shí)口感變差、果肉變硬、風(fēng)味變淡、顏色變褐加深等，致使感官特性劣變、商品價(jià)值降低[38-39]。筆者課題組前期觀察發(fā)現(xiàn)，皇冠李果實(shí)空腔褐變這一產(chǎn)業(yè)問(wèn)題與木質(zhì)素密切相關(guān)。作為木質(zhì)素生物合成途徑的上游調(diào)控因子[35-37]，NAC轉(zhuǎn)錄因子在木質(zhì)素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，對(duì)PsNAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行全面生物信息學(xué)鑒定和分析，有望為未來(lái)制定防控柰李果實(shí)空腔褐變的技術(shù)方案、品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供重要參考。

筆者在本研究中鑒定到115個(gè)PsNAC轉(zhuǎn)錄因子成員，該數(shù)量多于番茄（93個(gè)）[9]、辣椒（104個(gè)）[10]、火龍果（64個(gè)）[14]、菠蘿（73個(gè)）[15]和歐李（76個(gè)）[16]，但低于擬南芥（117個(gè)）[5]、毛果楊（170個(gè)）[6]、水稻（151個(gè)）[5]、玉米（148個(gè)）[7]、大豆（152個(gè)）[8]、大白菜（188個(gè)）[11]、蘋果（180個(gè)）[12]和梨（185個(gè)）[13]。與其他物種相比，李PsNAC基因家族成員數(shù)量存在一定的差異，顯示出明顯的物種間的差異性。

筆者在本研究中的蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，李PsNAC基因家族成員在氨基酸序列長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、CDS長(zhǎng)度等存在明顯差異，表明了PsNAC基因家族成員在結(jié)構(gòu)和功能上的多樣性。盡管PsNAC蛋白呈現(xiàn)親水性特征，但其穩(wěn)定性存在較大變異，反映了它們?cè)诓煌飳W(xué)環(huán)境中的適應(yīng)性和功能多樣性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PsNAC家族成員主要定位于細(xì)胞核中，也有少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等中，說(shuō)明李PsNAC轉(zhuǎn)錄因子可能在不同細(xì)胞部位發(fā)揮著多樣性的功能，從而為植物體的正常生命活動(dòng)提供保障。

以擬南芥NAC基因序列作為對(duì)照，將PsNACs基因分為17個(gè)亞族。其中，6個(gè)PsNAC基因聚集在OsNAC003亞族，10個(gè)PsNACs聚集在OsNAC7亞族。前人研究表明，OsNAC003和OsNAC7亞族的大部分基因參與植物的次生細(xì)胞壁合成[40]。因此，推測(cè)聚類在這2個(gè)亞族的PsNACs可能具有相似的功能。OsNAC7亞族在NAC家族中被廣泛研究，包括SND1、NST1、URP7、BRN1/2、VND1-7基因，其主要功能集中在調(diào)控莖、根和花藥次生壁的形成，在木質(zhì)素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中起重要作用[41-42]。

啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)可以為進(jìn)一步研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和潛在功能提供理論依據(jù)[43]。本研究中啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果表明，PsNACs含大量與激素相關(guān)元件的成員，推測(cè)這些成員在激素調(diào)控木質(zhì)素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物次生細(xì)胞壁合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)起關(guān)鍵作用，是該復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主要開關(guān)。枇杷EjNAC1通過(guò)反式激活木質(zhì)素合成相關(guān)基因EjPAL1和Ej4CL1的啟動(dòng)子，使其表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致果實(shí)木質(zhì)素積累，呈現(xiàn)出明顯的木質(zhì)化特征[33]。Ge等[34]發(fā)現(xiàn)，EjNAC3蛋白能直接結(jié)合并激活木質(zhì)素合成結(jié)構(gòu)基因EjCAD-like的啟動(dòng)子，參與調(diào)控枇杷果實(shí)木質(zhì)化過(guò)程。三紅蜜柚CgNAC043能激活下游轉(zhuǎn)錄因子CgMYB46和木質(zhì)素合成基因CgC3H和CgCCoAOMT1的啟動(dòng)子，共同參與蜜柚汁胞木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[44]。冬棗MYB激活子（LOC107425254）和抑制子（LOC107415078）通過(guò)調(diào)節(jié)F5H和CCR參木質(zhì)素生物合成，而NAC轉(zhuǎn)錄因子（LOC107435239）則促進(jìn)F5H的表達(dá)，從而正向調(diào)控木質(zhì)素的積累[45]。石榴NAC類蛋白PgSND1-like能結(jié)合木質(zhì)素合成酶基因啟動(dòng)子特異元件，提高PAL、4CL、F4H、CCR和CAD表達(dá)水平，從而調(diào)控石榴籽粒的硬度[46]。

筆者在本研究中結(jié)合PsNAC基因家族成員順式作用元件預(yù)測(cè)，共鑒定到10個(gè)PsNAC基因家族成員，其中PsNAC57、PsNAC54和PsNAC51既是OsNAC7和OsNAC003的亞族成員，又同時(shí)具有生長(zhǎng)素和赤霉素響應(yīng)元件。因此，這3個(gè)基因在激素參與木質(zhì)素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中至關(guān)重要。PsNAC26、PsNAC57、PsNAC77和PsNAC95在果實(shí)膨大期表達(dá)量最高，隨果實(shí)發(fā)育逐漸降低，在空腔褐變果中的表達(dá)量高于非空腔褐變果，推測(cè)這些家族成員可能負(fù)向調(diào)控木質(zhì)素生物合成。PsNAC54和PsNAC74在果實(shí)膨大期的表達(dá)量最低，隨果實(shí)發(fā)育逐漸上升，在空腔褐變果中的表達(dá)量高于非空腔褐變果，PsNAC54和PsNAC74可能正向調(diào)控木質(zhì)素生物合成。本研究為后續(xù)研究皇冠李空腔褐變的分子機(jī)制提供了重要靶標(biāo)。

4 結(jié) 論

首次鑒定并分析了115個(gè)李PsNAC基因家族成員，分析了PsNAC家族基因的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化、亞細(xì)胞定位等特征，采用qRT-PCR技術(shù)分析PsNAC家族基因在皇冠李不同發(fā)育時(shí)期的空腔褐變果和非空腔褐變果的基因表達(dá)模式。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究PsNAC家族基因的生物學(xué)功能、PsNAC家族成員與皇冠李果實(shí)空腔褐變的具體關(guān)聯(lián)性奠定了重要基礎(chǔ)。

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