高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

摘要：近年來，食品工業(yè)和飼料工業(yè)快速發(fā)展，企業(yè)對酸性蛋白酶的需求不斷增長。發(fā)酵醬醪作為天然的微生物菌種庫，含有各種特性優(yōu)越的菌株。該研究旨在發(fā)酵醬醪中篩選出高產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物菌株。共篩選出14株不同形態(tài)的霉菌，經(jīng)過復(fù)篩，最后篩選出一株高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株黑曲霉（Aspergillus niger），命名為JL-08。隨后，通過對黑曲霉JL-08產(chǎn)生的酸性蛋白酶進(jìn)行性能評價，發(fā)現(xiàn)其具有在高鹽發(fā)酵產(chǎn)品中的應(yīng)用潛力。再采用單因素試驗探索影響黑曲霉JL-08酸性蛋白酶酶活力的重要因素并利用Plackett-Burman試驗篩選出碳氮比（C/N）、酪蛋白添加量、天冬氨酸添加量和蘇氨酸添加量4個因素。最后進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，確定了最優(yōu)的因素組合為（C/N）16∶1、1%酪蛋白1.5 mL、30 mmol/L天冬氨酸1.5 mL。在此條件下，酸性蛋白酶酶活力提高至（5 507±426） U/g。

關(guān)鍵詞：酸性蛋白酶；篩選；黑曲霉；因素優(yōu)化

中圖分類號：TS201.25""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""""文章編號：1000-9973（2025）02-0010-07

Screening of High-Yield Acid Protease Strains and

Optimization of Culture Conditions

HE Wen-bin^1，2， ZHANG Jie-wen¹， XU Qing-yuan^1，2， HOU Sha³，

WU Chang-zheng³， GUO Li-qiong^1，2， LIN Jun-fang^1，2*

（1.College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

2.Guangdong Engineering Technology Research Center for Microecological Agents，

Guangzhou 510642， China; 3.Foshan Haitian （Gaoming） Flavouring amp;

Food Co.， Ltd.， Foshan 528599， China）

Abstract： In recent years， the food and feed industries have developed rapidly， and the demand for acid protease from enterprises has been continuously increasing. Fermented sauce mash， as a natural microbial strain library， contains various strains with superior characteristics. The aim of this study is to screen high-yield acid protease microbial strains from fermented sauce mash. A total of 14 strains of molds with different morphologies are screened， and after re-screening， a high-yield acid protease "strain Aspergillus niger "is finally screened， which is named JL-08. Subsequently， the performance of acid protease produced by Aspergillus niger JL-08 is evaluated， and it is found that it has application potential in high-salt fermented products， and then through single factor test， the important factors that affect the activity of acid protease from Aspergillus niger JL-08 are explored， and Plackett-Burman test is used to screen four factors， including carbon-nitrogen ratio （C/N）， casein addition amount， aspartic acid addition amount and threonine addition amount. Finally， four-factor and three-level orthogonal test is conducted to determine the optimal combination of factors： C/N of 16∶1， 1% casein of 1.5 mL and 30 mmol/L aspartic acid of 1.5 mL. Under these conditions， the activity of acid protease increases to （5 507±426） U/g.

Key words： acid protease; screening; Aspergillus niger; optimization of factors

酸性蛋白酶（EC 3.4.23.18）屬于蛋白酶類，其最適pH值范圍為3.0～5.5^[1]。酸性蛋白酶應(yīng)用的領(lǐng)域廣泛，包括肉類嫩化、增加飼料消化率、提高發(fā)酵食品的品質(zhì)等^[2-4]。隨著工業(yè)酶制劑需求量的逐年增長，酸性蛋白酶的需求量也在不斷增加，因此篩選出安全且產(chǎn)量高的微生物菌株至關(guān)重要。對于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)，篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株具有重要意義。發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程有大量不同類型的微生物參與，這些微生物會分泌多種酶系促進(jìn)原料的分解和生成營養(yǎng)物質(zhì)，并賦予發(fā)酵食品特殊的風(fēng)味^[5]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品可以看作是天然的微生物菌種庫，其中參與的菌株具有很大的挖掘潛力和應(yīng)用前景。所以，在發(fā)酵食品中篩選、挖掘可能應(yīng)用于食品工業(yè)的微生物具有可行性。

醬油屬于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的一種，其發(fā)酵過程涉及種類繁多的微生物。醬油的發(fā)酵過程可以分為制曲和鹽水發(fā)酵。在醬油的鹽水發(fā)酵開始后，發(fā)酵體系的pH值會迅速降低至4.0～5.0，酸性環(huán)境會一直持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束^[6]。在酸性環(huán)境下，有利于酸性蛋白酶發(fā)生酶促反應(yīng)，并使其維持在穩(wěn)定的狀態(tài)^[7]。此外，由于醬油在發(fā)酵過程中處于高鹽環(huán)境，從中篩選的菌株可能具有耐鹽特性，同時也有利于篩選能生產(chǎn)性能優(yōu)良酸性蛋白酶的菌株。本研究從發(fā)酵醬醪中篩選高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株，對其產(chǎn)生的酸性蛋白酶進(jìn)行性能評價，并對該菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，本研究結(jié)果將為未來固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶提供菌株和理論支持。

1"材料與方法

1.1"材料與試劑

1.1.1"篩選材料

不同發(fā)酵階段的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪樣品：由佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司提供。

1.1.2"培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，七水硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 L，于121 ℃高壓滅菌30 min。

篩選培養(yǎng)基：培養(yǎng)基A液：脫脂乳粉25 g，蒸餾水250 mL。培養(yǎng)基B液：可溶性淀粉5 g，酵母提取物2.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.1 g，瓊脂8.5 g，蒸餾水250 mL，pH值5.5。A液在115 ℃下滅菌20 min。B液在121 ℃下滅菌15 min。使用前將A液和B液等量混勻。

復(fù)篩培養(yǎng)基：以麩皮作為碳源，豆粕作為氮源，培養(yǎng)基的C/N控制在16∶1（即麩皮17.44 g，豆粕2.56 g）。培養(yǎng)基基料質(zhì)量為20 g，然后加入20 mL蒸餾水，攪拌后在121 ℃下滅菌30 min。

1.1.3"主要試驗試劑

乳酸、乳酸鈉、三氯乙酸：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；福林酚試劑：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；酪蛋白、酪氨酸、脫脂乳粉：北京索萊寶科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；硫酸銨、硝酸鈉、碳酸鈉：廣州化學(xué)試劑廠；其他使用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4"發(fā)酵基料

麩皮、豆粕、花生餅和菜籽粕：徐州宏昌糧油購銷有限責(zé)任公司；小麥秸稈粉、棉籽殼粉、玉米粉、木屑、玉米芯粉：購于長湴綜合市場。發(fā)酵基料中的粉狀原料使用前過20目篩。

1.2"儀器與設(shè)備

SKJH-1109超凈工作臺"上海蘇坤實業(yè)有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽"上海一恒科學(xué)儀器有限公司；東勝龍ETC-811 PCR儀"北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；UV-1700PC紫外可見分光光度計"上海奧析科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5804R臺式離心機(jī)"德國Eppendorf公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀"丹麥FOSS公司；Vario TOC總有機(jī)碳分析儀"德國Elementar公司。

1.3"試驗方法

1.3.1"菌株篩選

準(zhǔn)確稱取10 g醬醪樣品于研缽中，充分研磨，轉(zhuǎn)移至裝有90 mL PDA培養(yǎng)基的三角瓶中制成懸浮液，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中富集2 h。富集后準(zhǔn)確吸取1 mL上清液加入裝有9 mL無菌水的試管中，并進(jìn)行多個梯度稀釋。準(zhǔn)確吸取0.1 mL稀釋液于篩選培養(yǎng)基中，涂布均勻，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h。選取能產(chǎn)生透明圈且菌落形態(tài)有差異的菌株進(jìn)行甘油管保種和鑒定。

1.3.2"分子生物學(xué)鑒定

參考趙謀明等^[8]的方法提取和擴(kuò)增菌株DNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μL 5×SF Buffer，2 μL上、下游引物（ITS 1和ITS 4），2 μL模板DNA，0.5 μL dNTPs，0.5 μL酶，15 μL蒸餾水。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性45 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物測序由北京擎科生物科技股份有限公司完成，將返回的測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對。

1.3.3"菌株復(fù)篩

將篩選得到的多種菌株（孢子懸液濃度為1×10⁸"CFU/mL）接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在28 ℃培養(yǎng)4 d后測定酸性蛋白酶的酶活力。

1.3.4"培養(yǎng)基基料含碳量和含氮量測定

使用Vario TOC總有機(jī)碳分析儀測定含碳量，Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀測定含氮量。

1.3.5"制曲

在250 mL錐形瓶中加入由碳源和氮源混合而成的培養(yǎng)基基料20 g，初始C/N控制在16∶1，料水比控制在1∶1，初始接種量為1 mL（孢子懸液濃度為1×10⁸"CFU/mL），pH值自然，在28 ℃下培養(yǎng)4 d。在培養(yǎng)第1天后翻曲一次。每次試驗均設(shè)置3個平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.6"酸性蛋白酶粗酶液提取和酶活力測定

粗酶液的提取方法參照文獻(xiàn)[9]并作修改：稱取1 g發(fā)酵產(chǎn)物，加入20 mL蒸餾水并充分研磨，隨后轉(zhuǎn)移至離心管中，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中振蕩提取1 h，然后在8 000 r/min的條件下離心15 min，用中速濾紙過濾，所得上清液即為酸性蛋白酶粗酶液。酸性蛋白酶的酶活力測定方法參照SB/T 10317—1999中的福林酚法^[10]，所用緩沖液為50 mmol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH值3.0）。酶活定義：發(fā)酵產(chǎn)物的粗酶液在pH值3.0、40 ℃條件下，1 min水解酪蛋白溶液產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酸性蛋白酶活力單位，以U/g表示。

1.3.7"酸性蛋白酶粗酶液的性能評價

參照楊正鳳^[11]的方法對酸性蛋白酶分別進(jìn)行最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值和耐鹽性的評價。

1.3.8"發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的單因素試驗優(yōu)化

單因素試驗優(yōu)化的培養(yǎng)基因素包括碳源、氮源、C/N、酪蛋白添加量、植酸添加量和氨基酸添加量。

1.3.9"Plackett-Burman試驗和正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酸性蛋白酶的酶活力為響應(yīng)值，采用Plackett-Burman（PB）試驗篩選對酸性蛋白酶的酶活力有顯著影響的因素。隨后在PB試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，以探究最佳優(yōu)化條件。PB試驗設(shè)計因素與水平見表1。正交試驗設(shè)計因素與水平見表2。

1.3.10"數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 13進(jìn)行試驗設(shè)計。采用Excel 2019、GraphPad Prism 9.5、OriginPro 2021和SPSS 27等軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理和作圖，酶活測定數(shù)據(jù)保留整數(shù)，并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次。

2"結(jié)果與分析

2.1"產(chǎn)酸性蛋白酶菌株的篩選結(jié)果

從發(fā)酵醬醪中篩選得到41株在培養(yǎng)基中能產(chǎn)生透明圈的菌株，挑選了14株形態(tài)上具有差異的霉菌進(jìn)行ITS分子生物學(xué)鑒定，菌株鑒定結(jié)果和產(chǎn)酸性蛋白酶能力見表3。

由表3可知，黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的能力最強(qiáng)，故選擇JL-08菌株進(jìn)行深入研究。

黑曲霉JL-08的菌落形態(tài)和ITS擴(kuò)增結(jié)果分別見圖1中a和b。為了更直觀地表示篩選出的14株菌株的親緣關(guān)系，根據(jù)鑒定結(jié)果，構(gòu)建14株菌株的基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖1中c。由圖1中c可知，在3株黑曲霉中，JL-08與JL-23近緣性較高，與JL-13近緣性較低。

2.2"酸性蛋白酶粗酶液的性能評價

黑曲霉JL-08產(chǎn)生的酸性蛋白酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值和耐鹽性測定結(jié)果見圖2。

由圖2可知，酸性蛋白酶粗酶液的最適反應(yīng)pH值為3，隨著pH值的增加，酶活力逐漸減小。最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在40～60 ℃的溫度區(qū)間，酸性蛋白酶粗酶液的酶活力保持在較高水平，證明該酸性蛋白酶有較好的溫度適應(yīng)能力。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為5%時，酸性蛋白酶的酶活力下降超過70%，并在NaCl質(zhì)量濃度為25%時達(dá)到最低，這與以往的研究中的變化特征相一致^[12]。

2.3"固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗優(yōu)化結(jié)果

2.3.1"碳源和氮源優(yōu)化

碳源和氮源是微生物生長繁殖以及合成代謝物的原料和能量來源^[13]。培養(yǎng)基基料含碳量和含氮量測定結(jié)果見表4。

通過分別更換固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源，在相同C/N的條件下評估了幾種不同的發(fā)酵基料對黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的影響，優(yōu)化結(jié)果見圖3。進(jìn)行碳源優(yōu)化時，氮源固定為豆粕；進(jìn)行氮源優(yōu)化時，碳源固定為麩皮。碳源和氮源的優(yōu)化結(jié)果表明，在多種發(fā)酵基料中，以麩皮為碳源和豆粕為氮源的條件下，黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的酶活力最高。在后續(xù)的優(yōu)化試驗中繼續(xù)使用麩皮為碳源和豆粕為氮源的培養(yǎng)基配方。

2.3.2"C/N優(yōu)化

培養(yǎng)基中的C/N會影響菌株的生長速度和代謝產(chǎn)物的合成^[14]，以麩皮為碳源和豆粕為氮源，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基C/N優(yōu)化結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在C/N為13∶1時，黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的酶活力最高。

2.3.3"外源添加物質(zhì)優(yōu)化

氨基酸是微生物代謝物質(zhì)的合成原料，同時也是酶的組成成分。在NCBI數(shù)據(jù)庫中以黑曲霉為檢索物種，檢索出黑曲霉酸性蛋白酶基因編碼（Gene ID：4987328），從而得到其氨基酸組成，結(jié)果見表5。因為半胱氨酸也是某些蛋白酶的活性中心^[15]，故本研究選擇了酸性蛋白酶中含量前7的氨基酸以及半胱氨酸作為外源添加氨基酸，對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。氨基酸優(yōu)化結(jié)果見圖5中a，天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸對酸性蛋白酶的酶活力有較明顯的促進(jìn)作用，故分別對這4種氨基酸進(jìn)行單因素試驗優(yōu)化，結(jié)果見圖5中b～e。由氨基酸優(yōu)化結(jié)果可知，天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸對酸性蛋白酶的合成有促進(jìn)作用。

由圖6可知，當(dāng)1%酪蛋白添加量為1 mL時，對酸性蛋白酶合成的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

添加少量植酸可以有效促進(jìn)霉菌的發(fā)酵過程，提高酶活力^[16-17]。植酸質(zhì)量濃度優(yōu)化結(jié)果見圖7。

由圖7可知，添加少量植酸后，酸性蛋白酶的酶活力呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，表明植酸可能會抑制黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶的能力。

2.4"Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman（PB）試驗是一種評估各變量對特定響應(yīng)值的相對重要性的試驗設(shè)計方法。利用PB試驗可以在不考慮變量相互作用的前提下，在多種影響酸性蛋白酶酶活力的因素中高效快速篩選出重要的因素^[18]。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酸性蛋白酶的酶活力為響應(yīng)值，利用PB試驗分析C/N（X₁）、酪蛋白添加量（X₂）、天冬氨酸添加量（X₃）、絲氨酸添加量（X₄）、蘇氨酸添加量（X₅）和甘氨酸添加量（X₆）的貢獻(xiàn)度。每個因素取兩個水平，每次試驗重復(fù)3次。PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

由表7可知，PB試驗?zāi)Ｐ偷腜=0.007 4lt;0.01，表明回歸方程極顯著。C/N（X₁）、酪蛋白添加量（X₂）、天冬氨酸添加量（X₃）、蘇氨酸添加量（X₅）和甘氨酸添加量（X₆）顯著，證明這5個因素對酸性蛋白酶的酶活力有顯著影響。同時該模型的決定系數(shù)R²為0.936 1，調(diào)整決定系數(shù)R_Adj²為0.859 4，證明多項式模型擬合較好。在下一步試驗中，挑選P值較小的因素C/N、酪蛋白添加量、天冬氨酸添加量和蘇氨酸添加量進(jìn)行優(yōu)化試驗。

2.5"正交試驗

根據(jù)PB試驗的結(jié)果，篩選出4個對酸性蛋白酶酶活力貢獻(xiàn)度較高的因素。在此基礎(chǔ)上設(shè)計四因素三水平的正交試驗L₉（3⁴），以尋找酸性蛋白酶酶活力最高的因素組合。正交試驗設(shè)計和結(jié)果見表8。

由表8可知，正交試驗中各因素對酸性蛋白酶酶活力影響的主次順序為酪蛋白添加量gt;天冬氨酸添加量gt;C/Ngt;蘇氨酸添加量。黑曲霉JL-08的最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件組合為A₃B₃C₃D₁，即最佳條件為C/N 16∶1，酪蛋白添加量1.5 mL，天冬氨酸添加量1.5 mL，不添加蘇氨酸。在最優(yōu)條件下，酸性蛋白酶酶活力為（5 507±426） U/g。

2.6"討論

發(fā)酵醬醪具有含鹽量高和酸性環(huán)境的特點，處于不同時期的發(fā)酵醬醪會經(jīng)歷多輪微生物演替^[19]，是一種篩選功能微生物的理想樣品。在這種嚴(yán)格的特殊生存環(huán)境下，很有可能篩選出能夠生產(chǎn)耐鹽或耐高溫酶的微生物菌株^[20]。來源于發(fā)酵醬醪的菌株的酸性蛋白酶應(yīng)用場景廣闊，特別是在高鹽度和原料富含蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，如醬油、豆豉、酸魚和魚露等。本研究篩選出的黑曲霉所產(chǎn)生的酸性蛋白酶具有較好的溫度適應(yīng)能力，可以應(yīng)用于發(fā)酵溫度較高或者發(fā)酵過程溫度變化范圍較大的發(fā)酵食品中。通過外源添加酸性蛋白酶可以提高發(fā)酵食品的原料利用率，改善發(fā)酵食品的理化指標(biāo)及進(jìn)行風(fēng)味的改良^[21]，具有較好的應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果表明，根據(jù)酶的氨基酸組成成分進(jìn)行產(chǎn)酶優(yōu)化是可行的。不過由于多種氨基酸之間的復(fù)合作用與單一氨基酸的作用不盡相同，所以未來應(yīng)該更加注重如何利用多種氨基酸來進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)化。此外，在發(fā)酵工業(yè)中添加氨基酸比較昂貴，未來的研究應(yīng)挖掘更多富含多種氨基酸的工業(yè)副產(chǎn)品，以避免資源浪費。

3"結(jié)論

本研究成功從發(fā)酵醬醪中篩選出一株高產(chǎn)酸性蛋白酶的黑曲霉JL-08，該酸性蛋白酶具有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力，有應(yīng)用于發(fā)酵食品工業(yè)的潛力。此外，從碳氮源、外源添加物質(zhì)等角度對發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行因素優(yōu)化試驗，最終提高了酸性蛋白酶的酶活力。未來可以繼續(xù)通過發(fā)酵罐擴(kuò)大黑曲霉JL-08的發(fā)酵規(guī)模以實現(xiàn)酸性蛋白酶的大量制備，為工業(yè)化生產(chǎn)酶制劑提供技術(shù)支持?？傊?，本試驗為未來改良固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶提供了依據(jù)和參考。

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