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    高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

    2025-03-03 00:00:00何文彬張捷徐晴元侯莎吳昌正郭麗瓊林俊芳
    中國調(diào)味品 2025年2期

    摘要:近年來,食品工業(yè)和飼料工業(yè)快速發(fā)展,企業(yè)對酸性蛋白酶的需求不斷增長。發(fā)酵醬醪作為天然的微生物菌種庫,含有各種特性優(yōu)越的菌株。該研究旨在發(fā)酵醬醪中篩選出高產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物菌株。共篩選出14株不同形態(tài)的霉菌,經(jīng)過復(fù)篩,最后篩選出一株高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株黑曲霉(Aspergillus niger),命名為JL-08。隨后,通過對黑曲霉JL-08產(chǎn)生的酸性蛋白酶進(jìn)行性能評價,發(fā)現(xiàn)其具有在高鹽發(fā)酵產(chǎn)品中的應(yīng)用潛力。再采用單因素試驗(yàn)探索影響黑曲霉JL-08酸性蛋白酶酶活力的重要因素并利用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出碳氮比(C/N)、酪蛋白添加量、天冬氨酸添加量和蘇氨酸添加量4個因素。最后進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn),確定了最優(yōu)的因素組合為(C/N)16∶1、1%酪蛋白1.5 mL、30 mmol/L天冬氨酸1.5 mL。在此條件下,酸性蛋白酶酶活力提高至(5 507±426) U/g。

    關(guān)鍵詞:酸性蛋白酶;篩選;黑曲霉;因素優(yōu)化

    中圖分類號:TS201.25""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A"""""文章編號:1000-9973(2025)02-0010-07

    Screening of High-Yield Acid Protease Strains and

    Optimization of Culture Conditions

    HE Wen-bin1,2, ZHANG Jie-wen1, XU Qing-yuan1,2, HOU Sha3

    WU Chang-zheng3, GUO Li-qiong1,2, LIN Jun-fang1,2*

    (1.College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;

    2.Guangdong Engineering Technology Research Center for Microecological Agents,

    Guangzhou 510642, China; 3.Foshan Haitian (Gaoming) Flavouring amp;

    Food Co., Ltd., Foshan 528599, China)

    Abstract: In recent years, the food and feed industries have developed rapidly, and the demand for acid protease from enterprises has been continuously increasing. Fermented sauce mash, as a natural microbial strain library, contains various strains with superior characteristics. The aim of this study is to screen high-yield acid protease microbial strains from fermented sauce mash. A total of 14 strains of molds with different morphologies are screened, and after re-screening, a high-yield acid protease "strain Aspergillus niger "is finally screened, which is named JL-08. Subsequently, the performance of acid protease produced by Aspergillus niger JL-08 is evaluated, and it is found that it has application potential in high-salt fermented products, and then through single factor test, the important factors that affect the activity of acid protease from Aspergillus niger JL-08 are explored, and Plackett-Burman test is used to screen four factors, including carbon-nitrogen ratio (C/N), casein addition amount, aspartic acid addition amount and threonine addition amount. Finally, four-factor and three-level orthogonal test is conducted to determine the optimal combination of factors: C/N of 16∶1, 1% casein of 1.5 mL and 30 mmol/L aspartic acid of 1.5 mL. Under these conditions, the activity of acid protease increases to (5 507±426) U/g.

    Key words: acid protease; screening; Aspergillus niger; optimization of factors

    酸性蛋白酶(EC 3.4.23.18)屬于蛋白酶類,其最適pH值范圍為3.0~5.5[1]。酸性蛋白酶應(yīng)用的領(lǐng)域廣泛,包括肉類嫩化、增加飼料消化率、提高發(fā)酵食品的品質(zhì)等[2-4]。隨著工業(yè)酶制劑需求量的逐年增長,酸性蛋白酶的需求量也在不斷增加,因此篩選出安全且產(chǎn)量高的微生物菌株至關(guān)重要。對于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn),篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株具有重要意義。發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程有大量不同類型的微生物參與,這些微生物會分泌多種酶系促進(jìn)原料的分解和生成營養(yǎng)物質(zhì),并賦予發(fā)酵食品特殊的風(fēng)味[5]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品可以看作是天然的微生物菌種庫,其中參與的菌株具有很大的挖掘潛力和應(yīng)用前景。所以,在發(fā)酵食品中篩選、挖掘可能應(yīng)用于食品工業(yè)的微生物具有可行性。

    醬油屬于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的一種,其發(fā)酵過程涉及種類繁多的微生物。醬油的發(fā)酵過程可以分為制曲和鹽水發(fā)酵。在醬油的鹽水發(fā)酵開始后,發(fā)酵體系的pH值會迅速降低至4.0~5.0,酸性環(huán)境會一直持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束[6]。在酸性環(huán)境下,有利于酸性蛋白酶發(fā)生酶促反應(yīng),并使其維持在穩(wěn)定的狀態(tài)[7]。此外,由于醬油在發(fā)酵過程中處于高鹽環(huán)境,從中篩選的菌株可能具有耐鹽特性,同時也有利于篩選能生產(chǎn)性能優(yōu)良酸性蛋白酶的菌株。本研究從發(fā)酵醬醪中篩選高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株,對其產(chǎn)生的酸性蛋白酶進(jìn)行性能評價,并對該菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,本研究結(jié)果將為未來固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶提供菌株和理論支持。

    1"材料與方法

    1.1"材料與試劑

    1.1.1"篩選材料

    不同發(fā)酵階段的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪樣品:由佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司提供。

    1.1.2"培養(yǎng)基

    PDA培養(yǎng)基:去皮土豆200 g,葡萄糖20 g,七水硫酸鎂1.5 g,磷酸二氫鉀3 g,瓊脂20 g,用蒸餾水定容至1 L,于121 ℃高壓滅菌30 min。

    篩選培養(yǎng)基:培養(yǎng)基A液:脫脂乳粉25 g,蒸餾水250 mL。培養(yǎng)基B液:可溶性淀粉5 g,酵母提取物2.5 g,磷酸二氫鉀0.5 g,七水硫酸鎂0.1 g,瓊脂8.5 g,蒸餾水250 mL,pH值5.5。A液在115 ℃下滅菌20 min。B液在121 ℃下滅菌15 min。使用前將A液和B液等量混勻。

    復(fù)篩培養(yǎng)基:以麩皮作為碳源,豆粕作為氮源,培養(yǎng)基的C/N控制在16∶1(即麩皮17.44 g,豆粕2.56 g)。培養(yǎng)基基料質(zhì)量為20 g,然后加入20 mL蒸餾水,攪拌后在121 ℃下滅菌30 min。

    1.1.3"主要試驗(yàn)試劑

    乳酸、乳酸鈉、三氯乙酸:天津市富宇精細(xì)化工有限公司;福林酚試劑:北京博奧拓達(dá)科技有限公司;酪蛋白、酪氨酸、脫脂乳粉:北京索萊寶科技有限公司;酵母提取物、蛋白胨:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;硫酸銨、硝酸鈉、碳酸鈉:廣州化學(xué)試劑廠;其他使用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.1.4"發(fā)酵基料

    麩皮、豆粕、花生餅和菜籽粕:徐州宏昌糧油購銷有限責(zé)任公司;小麥秸稈粉、棉籽殼粉、玉米粉、木屑、玉米芯粉:購于長湴綜合市場。發(fā)酵基料中的粉狀原料使用前過20目篩。

    1.2"儀器與設(shè)備

    SKJH-1109超凈工作臺"上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;DK-8D三孔電熱恒溫水槽"上海一恒科學(xué)儀器有限公司;東勝龍ETC-811 PCR儀"北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;UV-1700PC紫外可見分光光度計(jì)"上海奧析科學(xué)儀器有限公司;Centrifuge 5804R臺式離心機(jī)"德國Eppendorf公司;Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀"丹麥FOSS公司;Vario TOC總有機(jī)碳分析儀"德國Elementar公司。

    1.3"試驗(yàn)方法

    1.3.1"菌株篩選

    準(zhǔn)確稱取10 g醬醪樣品于研缽中,充分研磨,轉(zhuǎn)移至裝有90 mL PDA培養(yǎng)基的三角瓶中制成懸浮液,在轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中富集2 h。富集后準(zhǔn)確吸取1 mL上清液加入裝有9 mL無菌水的試管中,并進(jìn)行多個梯度稀釋。準(zhǔn)確吸取0.1 mL稀釋液于篩選培養(yǎng)基中,涂布均勻,于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h。選取能產(chǎn)生透明圈且菌落形態(tài)有差異的菌株進(jìn)行甘油管保種和鑒定。

    1.3.2"分子生物學(xué)鑒定

    參考趙謀明等[8]的方法提取和擴(kuò)增菌株DNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括5 μL 5×SF Buffer,2 μL上、下游引物(ITS 1和ITS 4),2 μL模板DNA,0.5 μL dNTPs,0.5 μL酶,15 μL蒸餾水。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性45 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物測序由北京擎科生物科技股份有限公司完成,將返回的測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對。

    1.3.3"菌株復(fù)篩

    將篩選得到的多種菌株(孢子懸液濃度為1×108"CFU/mL)接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵,在28 ℃培養(yǎng)4 d后測定酸性蛋白酶的酶活力。

    1.3.4"培養(yǎng)基基料含碳量和含氮量測定

    使用Vario TOC總有機(jī)碳分析儀測定含碳量,Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀測定含氮量。

    1.3.5"制曲

    在250 mL錐形瓶中加入由碳源和氮源混合而成的培養(yǎng)基基料20 g,初始C/N控制在16∶1,料水比控制在1∶1,初始接種量為1 mL(孢子懸液濃度為1×108"CFU/mL),pH值自然,在28 ℃下培養(yǎng)4 d。在培養(yǎng)第1天后翻曲一次。每次試驗(yàn)均設(shè)置3個平行,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    1.3.6"酸性蛋白酶粗酶液提取和酶活力測定

    粗酶液的提取方法參照文獻(xiàn)[9]并作修改:稱取1 g發(fā)酵產(chǎn)物,加入20 mL蒸餾水并充分研磨,隨后轉(zhuǎn)移至離心管中,在轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中振蕩提取1 h,然后在8 000 r/min的條件下離心15 min,用中速濾紙過濾,所得上清液即為酸性蛋白酶粗酶液。酸性蛋白酶的酶活力測定方法參照SB/T 10317—1999中的福林酚法[10],所用緩沖液為50 mmol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液(pH值3.0)。酶活定義:發(fā)酵產(chǎn)物的粗酶液在pH值3.0、40 ℃條件下,1 min水解酪蛋白溶液產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酸性蛋白酶活力單位,以U/g表示。

    1.3.7"酸性蛋白酶粗酶液的性能評價

    參照楊正鳳[11]的方法對酸性蛋白酶分別進(jìn)行最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值和耐鹽性的評價。

    1.3.8"發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)優(yōu)化

    單因素試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基因素包括碳源、氮源、C/N、酪蛋白添加量、植酸添加量和氨基酸添加量。

    1.3.9"Plackett-Burman試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以酸性蛋白酶的酶活力為響應(yīng)值,采用Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)篩選對酸性蛋白酶的酶活力有顯著影響的因素。隨后在PB試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn),以探究最佳優(yōu)化條件。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

    1.3.10"數(shù)據(jù)處理

    采用Design-Expert 13進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Excel 2019、GraphPad Prism 9.5、OriginPro 2021和SPSS 27等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理和作圖,酶活測定數(shù)據(jù)保留整數(shù),并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次。

    2"結(jié)果與分析

    2.1"產(chǎn)酸性蛋白酶菌株的篩選結(jié)果

    從發(fā)酵醬醪中篩選得到41株在培養(yǎng)基中能產(chǎn)生透明圈的菌株,挑選了14株形態(tài)上具有差異的霉菌進(jìn)行ITS分子生物學(xué)鑒定,菌株鑒定結(jié)果和產(chǎn)酸性蛋白酶能力見表3。

    由表3可知,黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的能力最強(qiáng),故選擇JL-08菌株進(jìn)行深入研究。

    黑曲霉JL-08的菌落形態(tài)和ITS擴(kuò)增結(jié)果分別見圖1中a和b。為了更直觀地表示篩選出的14株菌株的親緣關(guān)系,根據(jù)鑒定結(jié)果,構(gòu)建14株菌株的基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹,見圖1中c。由圖1中c可知,在3株黑曲霉中,JL-08與JL-23近緣性較高,與JL-13近緣性較低。

    2.2"酸性蛋白酶粗酶液的性能評價

    黑曲霉JL-08產(chǎn)生的酸性蛋白酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值和耐鹽性測定結(jié)果見圖2。

    由圖2可知,酸性蛋白酶粗酶液的最適反應(yīng)pH值為3,隨著pH值的增加,酶活力逐漸減小。最適反應(yīng)溫度為50 ℃,在40~60 ℃的溫度區(qū)間,酸性蛋白酶粗酶液的酶活力保持在較高水平,證明該酸性蛋白酶有較好的溫度適應(yīng)能力。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為5%時,酸性蛋白酶的酶活力下降超過70%,并在NaCl質(zhì)量濃度為25%時達(dá)到最低,這與以往的研究中的變化特征相一致[12]。

    2.3"固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

    2.3.1"碳源和氮源優(yōu)化

    碳源和氮源是微生物生長繁殖以及合成代謝物的原料和能量來源[13]。培養(yǎng)基基料含碳量和含氮量測定結(jié)果見表4。

    通過分別更換固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源,在相同C/N的條件下評估了幾種不同的發(fā)酵基料對黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的影響,優(yōu)化結(jié)果見圖3。進(jìn)行碳源優(yōu)化時,氮源固定為豆粕;進(jìn)行氮源優(yōu)化時,碳源固定為麩皮。碳源和氮源的優(yōu)化結(jié)果表明,在多種發(fā)酵基料中,以麩皮為碳源和豆粕為氮源的條件下,黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的酶活力最高。在后續(xù)的優(yōu)化試驗(yàn)中繼續(xù)使用麩皮為碳源和豆粕為氮源的培養(yǎng)基配方。

    2.3.2"C/N優(yōu)化

    培養(yǎng)基中的C/N會影響菌株的生長速度和代謝產(chǎn)物的合成[14],以麩皮為碳源和豆粕為氮源,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基C/N優(yōu)化結(jié)果見圖4。

    由圖4可知,在C/N為13∶1時,黑曲霉JL-08產(chǎn)酸性蛋白酶的酶活力最高。

    2.3.3"外源添加物質(zhì)優(yōu)化

    氨基酸是微生物代謝物質(zhì)的合成原料,同時也是酶的組成成分。在NCBI數(shù)據(jù)庫中以黑曲霉為檢索物種,檢索出黑曲霉酸性蛋白酶基因編碼(Gene ID:4987328),從而得到其氨基酸組成,結(jié)果見表5。因?yàn)榘腚装彼嵋彩悄承┑鞍酌傅幕钚灾行?sup>[15],故本研究選擇了酸性蛋白酶中含量前7的氨基酸以及半胱氨酸作為外源添加氨基酸,對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。氨基酸優(yōu)化結(jié)果見圖5中a,天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸對酸性蛋白酶的酶活力有較明顯的促進(jìn)作用,故分別對這4種氨基酸進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化,結(jié)果見圖5中b~e。由氨基酸優(yōu)化結(jié)果可知,天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸對酸性蛋白酶的合成有促進(jìn)作用。

    由圖6可知,當(dāng)1%酪蛋白添加量為1 mL時,對酸性蛋白酶合成的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

    添加少量植酸可以有效促進(jìn)霉菌的發(fā)酵過程,提高酶活力[16-17]。植酸質(zhì)量濃度優(yōu)化結(jié)果見圖7。

    由圖7可知,添加少量植酸后,酸性蛋白酶的酶活力呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,表明植酸可能會抑制黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶的能力。

    2.4"Plackett-Burman試驗(yàn)

    Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)是一種評估各變量對特定響應(yīng)值的相對重要性的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。利用PB試驗(yàn)可以在不考慮變量相互作用的前提下,在多種影響酸性蛋白酶酶活力的因素中高效快速篩選出重要的因素[18]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以酸性蛋白酶的酶活力為響應(yīng)值,利用PB試驗(yàn)分析C/N(X1)、酪蛋白添加量(X2)、天冬氨酸添加量(X3)、絲氨酸添加量(X4)、蘇氨酸添加量(X5)和甘氨酸添加量(X6)的貢獻(xiàn)度。每個因素取兩個水平,每次試驗(yàn)重復(fù)3次。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

    由表7可知,PB試驗(yàn)?zāi)P偷腜=0.007 4lt;0.01,表明回歸方程極顯著。C/N(X1)、酪蛋白添加量(X2)、天冬氨酸添加量(X3)、蘇氨酸添加量(X5)和甘氨酸添加量(X6)顯著,證明這5個因素對酸性蛋白酶的酶活力有顯著影響。同時該模型的決定系數(shù)R2為0.936 1,調(diào)整決定系數(shù)RAdj2為0.859 4,證明多項(xiàng)式模型擬合較好。在下一步試驗(yàn)中,挑選P值較小的因素C/N、酪蛋白添加量、天冬氨酸添加量和蘇氨酸添加量進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

    2.5"正交試驗(yàn)

    根據(jù)PB試驗(yàn)的結(jié)果,篩選出4個對酸性蛋白酶酶活力貢獻(xiàn)度較高的因素。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)L9(34),以尋找酸性蛋白酶酶活力最高的因素組合。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表8。

    由表8可知,正交試驗(yàn)中各因素對酸性蛋白酶酶活力影響的主次順序?yàn)槔业鞍滋砑恿縢t;天冬氨酸添加量gt;C/Ngt;蘇氨酸添加量。黑曲霉JL-08的最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件組合為A3B3C3D1,即最佳條件為C/N 16∶1,酪蛋白添加量1.5 mL,天冬氨酸添加量1.5 mL,不添加蘇氨酸。在最優(yōu)條件下,酸性蛋白酶酶活力為(5 507±426) U/g。

    2.6"討論

    發(fā)酵醬醪具有含鹽量高和酸性環(huán)境的特點(diǎn),處于不同時期的發(fā)酵醬醪會經(jīng)歷多輪微生物演替[19],是一種篩選功能微生物的理想樣品。在這種嚴(yán)格的特殊生存環(huán)境下,很有可能篩選出能夠生產(chǎn)耐鹽或耐高溫酶的微生物菌株[20]。來源于發(fā)酵醬醪的菌株的酸性蛋白酶應(yīng)用場景廣闊,特別是在高鹽度和原料富含蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,如醬油、豆豉、酸魚和魚露等。本研究篩選出的黑曲霉所產(chǎn)生的酸性蛋白酶具有較好的溫度適應(yīng)能力,可以應(yīng)用于發(fā)酵溫度較高或者發(fā)酵過程溫度變化范圍較大的發(fā)酵食品中。通過外源添加酸性蛋白酶可以提高發(fā)酵食品的原料利用率,改善發(fā)酵食品的理化指標(biāo)及進(jìn)行風(fēng)味的改良[21],具有較好的應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果表明,根據(jù)酶的氨基酸組成成分進(jìn)行產(chǎn)酶優(yōu)化是可行的。不過由于多種氨基酸之間的復(fù)合作用與單一氨基酸的作用不盡相同,所以未來應(yīng)該更加注重如何利用多種氨基酸來進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)化。此外,在發(fā)酵工業(yè)中添加氨基酸比較昂貴,未來的研究應(yīng)挖掘更多富含多種氨基酸的工業(yè)副產(chǎn)品,以避免資源浪費(fèi)。

    3"結(jié)論

    本研究成功從發(fā)酵醬醪中篩選出一株高產(chǎn)酸性蛋白酶的黑曲霉JL-08,該酸性蛋白酶具有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力,有應(yīng)用于發(fā)酵食品工業(yè)的潛力。此外,從碳氮源、外源添加物質(zhì)等角度對發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行因素優(yōu)化試驗(yàn),最終提高了酸性蛋白酶的酶活力。未來可以繼續(xù)通過發(fā)酵罐擴(kuò)大黑曲霉JL-08的發(fā)酵規(guī)模以實(shí)現(xiàn)酸性蛋白酶的大量制備,為工業(yè)化生產(chǎn)酶制劑提供技術(shù)支持??傊?,本試驗(yàn)為未來改良固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶提供了依據(jù)和參考。

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