Gli基因及蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

摘要：目的 探討Gli1、Gli2和Gli3基因及蛋白在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中的表達(dá)特征及其與預(yù)后的關(guān)系。方法 利用cBioportal數(shù)據(jù)庫分析315例HCC樣本中Gli基因的表達(dá)情況，并通過免疫組織化學(xué)方法檢測40例HCC及其他肝臟組織中Gli蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 315例HCC樣本中57例（18.1%）出現(xiàn)Gli基因改變，Gli1、Gli2和Gli3的改變頻率分別為19例（6.0%）、13例（4.1%）和25例（7.9%）。Gli1與Gli2，Gli1與Gli3呈現(xiàn)顯著共存性（P＜0.05），而Gli2與Gli3表現(xiàn)出互斥趨勢(shì)。Gli1基因表達(dá)增加的患者無病生存率明顯降低（P＜0.01）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Gli1蛋白在HCC組織中的表達(dá)顯著高于正常肝臟、癌旁組織、病毒性肝炎和肝硬化/肝纖維化組織（P＜0.05）。在HCC組織中，Gli蛋白間呈現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)性（Gli1 vs. Gli2：rs=0.796；Gli1 vs. Gli3：r s=0.759；Gli2 vs. Gli3 rs=0.891，均P＜0.01）。53.3%（8/15）的HCC樣本同時(shí)呈現(xiàn)3種Gli蛋白的高表達(dá)，而在非癌肝組織中僅為11.8%（2/17）。結(jié)論 Gli1、Gli2和Gli3蛋白在HCC組織中普遍呈現(xiàn)協(xié)同高表達(dá)和顯著正相關(guān)，Gli1出現(xiàn)獨(dú)立高表達(dá)的特殊表達(dá)模式。

關(guān)鍵詞：肝腫瘤；轉(zhuǎn)錄因子；基因表達(dá)；Gli；cBioportal基因數(shù)據(jù)庫

中圖分類號(hào)：R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240977

Abstract： Objective To investigate the expression patterns of Gli1， Gli2 and Gli3 genes and proteins in hepatocellular carcinoma （HCC） tissue and their correlation with prognosis. Methods" Gli gene expression in 315 HCC samples were analyzed using the cBioportal database， and Gli protein expression was examined in 40 HCC and other liver tissue samples through immunohistochemistry. Results Gli gene alterations were found in 57 cases （18.1%） of HCC samples， with alteration frequencies of 19 cases （6.0%）， 13 cases （4.1%） and 25 cases （7.9%） for Gli1， Gli2 and Gli3， respectively. Gli1 showed significant co-occurrence with both Gli2 and Gli3 （P＜0.05）， while Gli2 and Gli3 exhibited a tendency toward mutual exclusivity. Increased Gli1 gene expression significantly correlated with decreased disease-free survival （P＜0.01）. Immunohistochemical analysis demonstrated that Gli1 protein expression was significantly higher in HCC tissue than that in normal liver tissue， adjacent tissue， hepatitis and cirrhotic tissue （P＜0.05）. In HCC tissue， strong positive correlation was observed between the three Gli proteins （Gli1 vs. Gli2： rs=0.796; Gli1 vs. Gli3： rs=0.759; Gli2 vs. Gli3：rs=0.891， all P＜0.01）. High expression levels of all three Gli proteins were detected in 53.3% （8/15） of HCC samples， compared to only 11.8% （2/17） in non-cancerous liver tissue. Conclusion Gli1， Gli2 and Gli3 proteins commonly exhibit synergistic high expression and significant positive correlation in HCC tissue， with Gli1 showing a special expression pattern of independent high expression.

Key words：liver neoplasms; transcription factors; gene expression; Gli; cBioportal gene database

肝細(xì)胞癌（HCC）是常見的原發(fā)性肝癌，近年來死亡率增長迅速，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。由于缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)HCC患者在確診時(shí)已屬晚期，且對(duì)系統(tǒng)性化療反應(yīng)較差，5年生存率僅為19.5%［1］。研究表明，Hedgehog-Gli（Hh-Gli）信號(hào)通路的異常激活與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在肝硬化過程中的祖細(xì)胞擴(kuò)增、炎癥細(xì)胞募集及肝損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。Gli家族包括Gli1、Gli2和Gli3［3］，Hh-Gli信號(hào)通路主要通過這3種轉(zhuǎn)錄因子的活性平衡來調(diào)控其最終效應(yīng)。其中，Gli1主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子，而Gli2和Gli3則可在不同條件下發(fā)揮激活或抑制作用［4-5］。研究表明，Gli2和Gli3蛋白的功能轉(zhuǎn)換受到多種因素調(diào)控，包括翻譯后修飾和蛋白水平的調(diào)控［6］。在HCC中，Gli2的激活功能與腫瘤干細(xì)胞特性密切相關(guān)，而Gli3則通過其抑制功能參與腫瘤進(jìn)展的調(diào)控［7］。然而，目前尚缺乏HCC中Gli家族因子表達(dá)水平的系統(tǒng)性比較的研究。為此，本研究擬通過利用cBioportal肝癌數(shù)據(jù)庫對(duì)HCC患者中Gli1、Gli2、Gli3的基因變化進(jìn)行可視化分析，探討其在肝癌及其鄰近組織中的表達(dá)模式和相互關(guān)系，以期為HCC的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HCC樣本 本研究利用cBioportal數(shù)據(jù)庫（https：//www.cbioportal.org/）中的肝癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。選擇TCGA PanCancer Atlas中的肝癌數(shù)據(jù)集，包含348例HCC患者的臨床和基因組學(xué)數(shù)據(jù)?；颊吣挲g16～90歲，中位年齡61歲，其中男232例（66.7%），女116例（33.3%），臨床分期Ⅰ期171例（49.1%），Ⅱ期84例（24.1%），Ⅲ期83例（23.9%），Ⅳ期4例（1.1%），分期不明6例（1.8%）。

1.1.2 組織芯片樣本 人肝臟組織芯片BC03002購自美國US Biomax公司，包含40例80個(gè)組織點(diǎn)（每例2個(gè)點(diǎn)，直徑1.5 mm）。樣本構(gòu)成包括15例HCC、8例肝硬化/肝纖維化、5例病毒性肝炎、2例癌灶臨近正常組織、2例正常肝臟和8例膽管癌組織（不作為本研究探討目標(biāo)）。為降低癌灶位置差異造成的結(jié)果偏差，選用3張連續(xù)切片進(jìn)行分析。所有臨床病理資料由US Biomax公司提供。組織芯片的使用符合《赫爾辛基宣言》的倫理學(xué)原則，US Biomax公司確保所有樣本的采集均獲得了患者的知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 抗體及試劑 兔抗人Gli1多克隆抗體購自Novus Biologicals公司（美國）；兔抗人Gli2和Gli3多克隆抗體購自英國Abcam公司。SP-9001即用型免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。PBS緩沖液、檸檬酸抗原修復(fù)液、過氧化氫溶液等常規(guī)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。抗鼠或抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 主要儀器 BenchMark ULTRA全自動(dòng)免疫組化染色儀（美國Ventana Medical Systems公司）； Aperio AT2型數(shù)字病理切片掃描儀（德國Leica公司）；BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 cBioportal數(shù)據(jù)庫分析 登錄cBioportal數(shù)據(jù)庫，進(jìn)入Repository界面，選擇文檔類型為RNA-seq，選擇病例類型Liver Hepatocellular Carcinoma，共獲得348例HCC數(shù)據(jù)。排除數(shù)據(jù)庫中腫瘤純度低于0.7的標(biāo)本、石蠟包埋組織和重復(fù)標(biāo)本后，共收集HCC標(biāo)本315例。利用R程序（https：//www.r-project.org/）分析HCC組織Gli1、Gli2和Gli3表達(dá)與患者總生存率和無病生存率的關(guān)系。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟包埋的組織芯片切片于65 ℃孵育2 h，二甲苯中脫蠟復(fù)水后枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2溶液孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。進(jìn)一步用Gli1、Gli2和Gli3多克隆抗體（1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫放置15 min，最后用蘇木素與二氨基聯(lián)苯胺作顯色劑進(jìn)行復(fù)染。由3位病理科醫(yī)生獨(dú)立對(duì)組織芯片的免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。綜合組織染色強(qiáng)度和染色比例進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度評(píng)分：0分（無色，無表達(dá)）；1分（淺黃色，弱表達(dá)）；2分（深黃色，中度表達(dá)）；3分（棕褐色，高表達(dá)）。陽性腫瘤細(xì)胞百分率評(píng)分：1分（0～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞比例評(píng)分的乘積除以12（最高總分），得到0～1之間的最終評(píng)分。最終評(píng)分＜0.4定義為低表達(dá)，≥0.4定義為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖表?；蚋淖冾l率以例（%）表示；基因間的共存性分析采用比值比（OR值）和P值評(píng)估；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；Gli蛋白表達(dá)水平以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，Gli蛋白表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gli1、Gli2和Gli3基因改變頻率 結(jié)果顯示，315例HCC樣本中57例（18.1%）樣本出現(xiàn)Gli基因改變，其中Gli1、Gli2和Gli3的改變頻率分別為19例（6.0%）、13例（4.1%）和25例（7.9%）。Gli2主要表現(xiàn)為基因突變，而Gli1和Gli3主要以mRNA表達(dá)上調(diào)及基因擴(kuò)增兩種形式為主，見圖1。

2.2 Gli基因改變的共存性和互斥性分析 Gli1和Gli2，Gli1和Gli3的表達(dá)變化存在共存關(guān)系（P＜0.05）。Gli2和Gli3的變化呈現(xiàn)互斥趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3 Gli基因改變與患者生存率的關(guān)系 生存分析顯示，Gli1基因高表達(dá)患者的無病生存率較低表達(dá)患者升高（P＜0.05），而在總體生存率方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Gli2和Gli3的表達(dá)變化對(duì)HCC患者的總生存率和無病生存率均無影響（P＞0.05），見圖2。

2.4 Gli蛋白在肝細(xì)胞癌及其他肝臟組織中的表達(dá)模式 免疫組織化學(xué)染色顯示，Gli1、Gli2和Gli3蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以核內(nèi)表達(dá)更為明顯，呈棕褐色陽性染色，見圖3。Gli1蛋白在HCC組織中的表達(dá)顯著高于正常肝臟、癌旁組織、肝炎和肝硬化組織（P＜0.05）。Gli2和Gli3蛋白在HCC組織中的表達(dá)也明顯高于正常肝臟組織（P＜0.05），見表2。

2.5 Gli蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在非癌肝組織中，Gli1與Gli2以及Gli1與Gli3的表達(dá)呈現(xiàn)低度相關(guān)或無明顯相關(guān)性（Gli1 vs. Gli2：rs=0.349，P=0.049；Gli1 vs. Gli3：rs=0.187，P=0.305），而Gli2與Gli3的表達(dá)水平呈高度正相關(guān)（rs=0.866，P＜0.01）。在HCC組織中，Gli2與Gli3的表達(dá)保持高度正相關(guān)（rs=0.891，P＜0.01）；Gli1與Gli2以及Gli1與Gli3的表達(dá)也呈現(xiàn)中度正相關(guān)（Gli1 vs. Gli2：rs=0.796，P＜0.01；Gli1 vs. Gli3：rs=0.759，P＜0.01）。

2.6 Gli蛋白共表達(dá)模式在肝細(xì)胞癌中的特征 通過三維散點(diǎn)圖分析Gli1、Gli2和Gli3蛋白的共表達(dá)模式，結(jié)果顯示HCC組織中，53.3%的（8/15）樣本同時(shí)呈現(xiàn)3種Gli蛋白高表達(dá)，而在正常肝臟、肝炎、肝硬化等非癌肝組織中，這一比例僅為11.8%（2/17）。在HCC組織中，Gli1的表達(dá)增幅最為顯著，Gli2和Gli3的表達(dá)增幅相對(duì)較小，但仍高于非癌組織。同時(shí)，13.3%（2/15）的HCC樣本僅表現(xiàn)出Gli1的高表達(dá)。非癌肝組織中Gli蛋白的表達(dá)水平普遍較低，且相對(duì)均衡，僅在部分肝炎和肝硬化樣本中Gli2和Gli3表達(dá)略有升高，見圖4。

3 討論

Gli轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶基因參與了細(xì)胞增殖、凋亡、干細(xì)胞再生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成［8］。Gli轉(zhuǎn)錄因子的過度活化與肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，18.1%的HCC樣本出現(xiàn)Gli基因改變，其中Gli1表達(dá)升高的患者無病生存率顯著下降，這表明Gli1可能在HCC的進(jìn)展和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。這一發(fā)現(xiàn)與Clara等［10］的報(bào)道一致，該研究認(rèn)為HCC患者中Gli1的高表達(dá)與較短的無病生存期相關(guān)，Gli1可作為預(yù)后生物標(biāo)志物。然而本研究未觀察到Gli1表達(dá)差異對(duì)總生存率的影響。Massah等［11］通過對(duì)HCC患者5年隨訪發(fā)現(xiàn)，Gli1高表達(dá)患者的總生存率下降。這一差異可能源于樣本量、隨訪時(shí)間或檢測方法的不同，提示需要進(jìn)行更大規(guī)模、更長期的前瞻性研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)Gli2和Gli3的表達(dá)水平對(duì)HCC患者的總生存率和無病生存率均不產(chǎn)生影響，這與Rodrigues等［12］的研究部分一致，該研究發(fā)現(xiàn)雖然Gli3與腫瘤大小呈現(xiàn)相關(guān)性，但同樣未證實(shí)兩者表達(dá)對(duì)預(yù)后有影響。值得注意的是，本研究首次發(fā)現(xiàn)Gli1與Gli3、Gli1與Gli2在基因水平上呈現(xiàn)共存性，而Gli2與Gli3則表現(xiàn)出互斥的趨勢(shì)。Gli蛋白在HCC的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出多重功能，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Gli1主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，而Gli2和Gli3則可根據(jù)細(xì)胞微環(huán)境表現(xiàn)出雙向調(diào)控特性［13］。這些蛋白通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因（如Cyclin D1、p21和p27）影響HCC細(xì)胞的增殖與生長，同時(shí)在維持肝癌干細(xì)胞的特性和分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，Gli蛋白還參與調(diào)控HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，構(gòu)成了肝癌進(jìn)展的重要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Matissek等［14］研究表明，Gli3作為Hedgehog信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子，存在全長活化型（GLI3-FL）和抑制型（GLI3-R）兩種形式。在不同分化程度的HCC中，這2種形式可能被差異性激活，從而通過調(diào)控Hedgehog基因及其下游靶點(diǎn)影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。此外，Gli基因表達(dá)的改變不僅影響HCC的發(fā)生發(fā)展，還可能與治療耐藥性相關(guān)。Wang等［15］報(bào)道，Hedgehog信號(hào)通路的激活可促進(jìn)HCC對(duì)索拉非尼的耐藥。

本研究通過三維散點(diǎn)圖分析揭示了Gli蛋白在HCC中的獨(dú)特共表達(dá)模式。53.3%的HCC樣本同時(shí)呈現(xiàn)3種Gli蛋白高表達(dá)，而在非癌肝組織中僅為11.8%。這種協(xié)同高表達(dá)模式反映了Hedgehog信號(hào)通路在HCC中的全面激活。Hu等［16］研究表明，Hedgehog信號(hào)通路的持續(xù)激活可導(dǎo)致肝臟慢性損傷和纖維化。Ding等［17］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在HCC樣本中Hedgehog信號(hào)通路的關(guān)鍵分子（包括SHh、Gli1和Gli2）均顯著上調(diào)，其中Gli2主要通過轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）/Smad 家族成員3（Smad3）介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑被激活。這提示Gli1可能主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子促進(jìn)腫瘤生長，而Gli2和Gli3則可能在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和維持腫瘤干細(xì)胞特性等方面發(fā)揮作用［18］。值得注意的是，本研究中芯片檢測結(jié)果顯示，約13.3%的HCC樣本僅表現(xiàn)出Gli1的高表達(dá)，這一比例與Wu等［19］在HCC樣本中觀察到的Gli單獨(dú)高表達(dá)的比例相符，他們認(rèn)為Gli1通過非經(jīng)典途徑被激活，這可能解釋了部分樣本中Gli1獨(dú)立表達(dá)的現(xiàn)象。Gli蛋白共表達(dá)模式的形成機(jī)制可能涉及多個(gè)層面的調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，Niewiadomski等［20］研究表明，Gli蛋白之間存在復(fù)雜的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)。在蛋白水平，Gli蛋白的穩(wěn)定性和活性受到多種翻譯后修飾的影響［21］。

綜上所述，Gli1、Gli2和Gli3蛋白在HCC組織中普遍呈現(xiàn)協(xié)同高表達(dá)和顯著正相關(guān)，Gli1出現(xiàn)獨(dú)立高表達(dá)的特殊表達(dá)模式。然而，研究未能直接評(píng)估Gli蛋白的轉(zhuǎn)錄活性；其次，樣本量相對(duì)有限，可能影響了某些亞組分析的統(tǒng)計(jì)效能。未來將擴(kuò)大樣本量，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法，深入探討Gli蛋白共表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其在HCC進(jìn)展中的作用。

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（2024-07-21收稿 2024-12-12修回）

（本文編輯 胡小寧）