副溶血弧菌口服疫苗免疫大菱鲆后IgM基因的變化

摘要：用不同方法制備或不同方式免疫的3種副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）疫苗免疫大菱鲆，實(shí)驗(yàn)分為4組，注射免疫組、口服疫苗免疫組、口服緩釋疫苗免疫組和陰性對(duì)照組，于免疫后1周、2周、3周和4周分別取大菱鲆脾、頭腎和后腸3種組織，提取mRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3種組織中免疫球蛋白M（IgM）基因的變化。結(jié)果顯示：IgM基因在3種組織中表達(dá)量均上調(diào)，高峰值出現(xiàn)在第4周，表達(dá)量是對(duì)照組的3～12倍。研究結(jié)果為口服疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：副溶血弧菌；疫苗；大菱鲆；IgM基因

中圖分類號(hào)：S9425文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已被廣泛應(yīng)用，為控制魚類病害的發(fā)生發(fā)揮重要作用［1］。漁用疫苗共有三種免疫接種方式：注射免疫、浸泡免疫和口服免疫。注射免疫因能有效激活魚體系統(tǒng)免疫反應(yīng)，起到較好的免疫效果而被普遍使用，是目前最常用的免疫接種方法，然而注射免疫也具有勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易造成魚體應(yīng)激，對(duì)于規(guī)格較小的幼魚，操作較為困難等缺點(diǎn)。浸泡免疫因使用量過大而成本高。相比之下，口服免疫具備安全易行、操作方便、使用量小、不受魚類個(gè)體大小限制等優(yōu)勢(shì)，具有很好的應(yīng)用前景［2］。為研究魚類疫苗的免疫效果，對(duì)免疫后一些特異性指標(biāo)及非特異性指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，如血清和黏液抗體水平的變化［3-5］、淋巴細(xì)胞數(shù)量［6］、免疫相關(guān)酶活性［7-8］、補(bǔ)體活性［9-10］和呼吸爆發(fā)［8］等。近年來，從基因表達(dá)水平對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)的報(bào)道越來越多，常見的基因有免疫球蛋白M（IgM）［11-12］、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHC Ⅰ）［13］、MHC Ⅱ［14-15］、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）［16］和自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子（NKEF）［17-18］等。

1 材料與方法

11 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大菱鲆購自天津某水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體長10～15 cm，體重50～80 g。大菱鲆在水溫22℃下馴養(yǎng)3周，連續(xù)充氣，每日投喂2次配合飼料，合計(jì)為魚體重的1%。

12 副溶血弧菌全菌滅活疫苗的制備

將保存的副溶血弧菌菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)活，經(jīng)過37℃培養(yǎng)24 h后，按1∶100接種量接種于營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，6000 r/min離心5 min去掉培養(yǎng)基，用滅菌PBS洗滌3次，加入終濃度為05%的甲醛37℃滅活24 h，其間可輕輕震蕩2～3次，平板檢測(cè)無活菌存在；滅活結(jié)束后，6000 r/min離心5 min去除甲醛，用滅菌PBS離心洗滌菌體3次，用滅菌PBS調(diào)整菌液濃度至10×1012 cfu/mL，4℃保存?zhèn)溆?，為副溶血弧菌口服緩釋疫苗制備提供原料?/p>

13 副溶血弧菌口服緩釋疫苗制備

采用大菱鲆商品化飼料為載體，首先將滅活疫苗均勻噴于飼料表面，制備成疫苗飼料，疫苗有效濃度約為6×109 cfu/g飼料，再進(jìn)行緩釋層的包衣，包衣材料由乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素（HPMC）等材料制備而成。

14 大菱鲆的免疫

暫養(yǎng)后的大菱鲆分為4組，每組40尾。實(shí)驗(yàn)共分4組，其中實(shí)驗(yàn)1組（test1）為注射免疫組，實(shí)驗(yàn)2組（test2）為口服疫苗免疫組，實(shí)驗(yàn)3組（test3）為緩釋口服疫苗免疫組，實(shí)驗(yàn)4組（control）為陰性對(duì)照組，均不設(shè)平行組。口服疫苗免疫組每天投喂制備的未包被的口服疫苗2次，緩釋口服疫苗免疫組每天投喂制備的包被的口服疫苗2次，連續(xù)投喂7 d，然后投喂正常餌料；陰性對(duì)照組每天投喂2次正常顆粒餌料。注射免疫組每尾大菱鲆腹腔注射濃度為1×108 cfu/mL的滅活疫苗01 mL，在口服免疫的第7 d進(jìn)行注射免疫。每日餌料投喂量為魚體重的1%。

15 大菱鲆的免疫及取樣

免疫后于1周、2周、3周和4周在各組隨機(jī)取3尾大菱鲆，分別取脾、頭腎、后腸3種組織，保存于RNA保存液中，4℃過夜，-80℃保存?zhèn)溆茫崛〗M織RNA，用于檢測(cè)IgM基因表達(dá)的變化。

16 RNA的提取及cDNA的合成

從-80℃冰箱中取各組織樣品約20 mg，應(yīng)用離心柱海洋動(dòng)物RNA提取試劑盒（北京天根生化試劑公司）提取RNA，以微量核酸測(cè)定儀（NanoDrop One，Thermo）測(cè)定RNA的濃度和純度，提取合格的RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

17 熒光定量PCR所用引物的設(shè)計(jì)與選擇

根據(jù)已知的大菱鲆肌動(dòng)蛋白（β-actin）、IgM基因的基因序列，采用Primer Premier 50軟件設(shè)計(jì)各基因特異性引物，隨機(jī)選取對(duì)照組的脾、頭腎、后腸的cDNA樣品，利用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（Takara），在熒光定量PCR儀（StepOne Plus）上進(jìn)行擴(kuò)增，選擇單一溶解曲線的引物進(jìn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

18 熒光定量PCR檢測(cè)

以β-actin為內(nèi)參，利用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒在熒光定量PCR儀（ABI StepOne Plus）上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL，即：cDNA模板2 μL，正反向引物各04 μL（引物濃度為10 μmol/L），ROX Reference Dye 04 μL，混合液10 μL，無菌水68 μL，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增的條件為：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)，獲取Ct值用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理及分析。

19 數(shù)據(jù)處理及分析

熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)按照2-ΔΔCt法進(jìn)行處理，所有數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±SD）表示。利用Origin Pro 2016軟件作圖，SPSS 130軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)分析不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量的差異，以Plt;005作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

21 熒光定量PCR所用引物的獲得

內(nèi)參基因β-actin、IgM基因引物序列、退火溫度等信息見表1。應(yīng)用特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR，所有檢測(cè)樣品的擴(kuò)增結(jié)果均為單一產(chǎn)物。

22 IgM基因在脾臟、頭腎和后腸中的表達(dá)

脾臟中，實(shí)驗(yàn)1組IgM的表達(dá)量呈一直上升趨勢(shì)，第1周和第2周表達(dá)量為對(duì)照組的2倍左右，到第4周顯著上調(diào)，表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組的1209倍（P＜005）；實(shí)驗(yàn)2組前兩周IgM的表達(dá)量與對(duì)照組無差異，第3周開始上調(diào)，為對(duì)照組的204倍，第4周繼續(xù)上調(diào)為對(duì)照組的455倍；實(shí)驗(yàn)3組趨勢(shì)與實(shí)驗(yàn)2組相近，只是表達(dá)量有所提高，第4周時(shí)為對(duì)照組的787倍（圖1）。頭腎中，各實(shí)驗(yàn)組IgM的表達(dá)趨勢(shì)一致，前2周均與對(duì)照組無差異，實(shí)驗(yàn)1組IgM的表達(dá)量從第3周開始上調(diào)為對(duì)照組的741倍，第4周為2376倍；實(shí)驗(yàn)2組IgM的表達(dá)量從第3周開始上調(diào)為對(duì)照組的356，第4周為584倍；實(shí)驗(yàn)3組第3周IgM的表達(dá)量為對(duì)照組的40倍，第4周為132倍（圖2）。后腸中，實(shí)驗(yàn)1組IgM的表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，第2周開始升高，第3周最高，為對(duì)照組的337倍，第4周降低到283倍；實(shí)驗(yàn)2組同樣為先升后降，最高值達(dá)到336倍；實(shí)驗(yàn)3組到第4周才達(dá)到最高值，為對(duì)照組的585倍（圖3）。

3 討論

免疫球蛋白IgM是體內(nèi)免疫反應(yīng)最早出現(xiàn)的一種免疫蛋白，主要功能是抗菌、抗病毒和中和毒素等，它是一種高效能的抗體，其殺菌、溶菌、溶血、調(diào)理及凝集作用較IgG高。注射疫苗可使頭腎、脾等免疫器官引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的抗體，口服疫苗刺激黏膜免疫器官后，迅速產(chǎn)生相應(yīng)的免疫球蛋白，只是抗體水平較低。研究報(bào)道溶藻弧菌疫苗免疫斜帶石斑魚后，頭腎、脾、胸腺和血液中IgM基因表達(dá)量從2周后開始顯著上升，4～5周時(shí)達(dá)到最高峰［11］，本實(shí)驗(yàn)中脾和頭腎中IgM基因表達(dá)量從第3周開始顯著上升，第4周達(dá)到最高值，后腸則從第2周開始顯著上升，第4周達(dá)到最高值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Cui等［11］研究結(jié)果一致。也有研究表明疫苗免疫后IgM基因表達(dá)較早，如鰻弧菌注射和浸泡免疫牙鲆后，脾、頭腎和鰓中的IgM表達(dá)量在第7天達(dá)到最高值，一直持續(xù)到14天［12］，嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫鱖魚后，皮膚和鰓中IgM基因表達(dá)量第4天達(dá)到峰值，脾和腎在第7天達(dá)到峰值［19］。IgM基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同，可能與疫苗濃度、魚種及魚體大小等有關(guān)［20］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的副溶血弧菌口服緩釋疫苗效果較好，刺激后腸免疫相關(guān)基因表達(dá)量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組；在脾和頭腎中，緩釋口服疫苗免疫組免疫相關(guān)基因表達(dá)量不如注射免疫組，但效果好于口服疫苗免疫組。通過增加口服免疫時(shí)間、利用免疫佐劑、加大免疫劑量等方式是否能更有效地引發(fā)大菱鲆的特異性免疫并增加免疫保護(hù)效果，從而達(dá)到與注射免疫相同的免疫效果還有待于進(jìn)一步的研究。

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