改變碳輸入對亞熱帶針闊混交林土壤化學性質和微生物群落的影響

關鍵詞：土壤微生物；有機碳輸入；高通量測序；土壤化學性質；木荷與馬尾松混交林

中圖分類號：S714 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2025）01-0095-10 doi：10.11654/jaes.2024-0155

我國南方紅壤區(qū)由于特殊的成土因素和人為活動的干擾，水土流失較為嚴重，不少地區(qū)出現“空中森林”現象，這不僅會影響林地生產力、破壞當地生態(tài)環(huán)境，而且制約區(qū)域經濟發(fā)展，因而提升退化地土壤肥力進而維護生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定備受關注[1-2]。土壤微生物是土壤的重要組成部分，它不僅參與元素循環(huán)過程，同時在增強根際免疫、提高土壤肥力方面扮演關鍵的角色[2]；但微生物具有高度敏感性，易受到外部環(huán)境的影響，不同碳源輸入可能會造成微生物群落的不同，而微生物群落是驅動生態(tài)系統(tǒng)過程的主要因素[3]。因此，土壤微生物群落對土壤質量提高和生態(tài)系統(tǒng)恢復極為重要。

與農業(yè)土壤人為添加有機質不同，林地主要通過凋落物、細根和菌根等自肥方式補給有機碳，從而影響土壤微生物[4]。地上凋落物輸入是植物歸還土壤養(yǎng)分的主要途徑，也是森林生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物代謝的重要基質，其輸入量的變化會影響土壤微生物群落結構，然而關于凋落物添加與去除的影響結果仍存在爭議。例如：盧曉蓉等[5]對亞熱帶杉木人工林的研究顯示，土壤細菌和真菌含量隨凋落物量的增加而增加；而Sayer[6]通過對歐洲森林的研究發(fā)現，凋落物的去除會改變真菌的物種組成和多樣性，凋落物的添加則不會引起真菌豐度的增加。根系輸入會將根系分泌物如多糖、有機酸和氨基酸釋放到土壤中，這些分泌物可以刺激微生物生長從而增加土壤的養(yǎng)分利用[7]。前人關于根系輸入對土壤微生物影響的研究結果也存在差異，例如：Wang等[8]對中亞熱帶混交林研究發(fā)現，根溝處理使得根系分泌物減少，從而顯著影響土壤真菌生物量；Brant等[9]對溫帶3種不同林分的研究發(fā)現，根系去除會提高放線菌生物量，降低真菌生物量。菌根是土壤和植物根系中某些真菌的共生體，菌根的菌絲可以促進碳沉積到土壤孔隙和礦物質表面[10]，對土壤有機質的形成與穩(wěn)定起著重要作用。Toljander 等[11]對溫帶耕地研究發(fā)現菌根的菌絲分泌物提高了細菌的活性，并改變了細菌群落組成。

植物殘體的添加和去除實驗（DIRT）是通過改變地上、地下碳輸入來研究植物和土壤微生物群落之間反饋作用的有效方法[12]，但前人大多只關注凋落物或根系輸入對土壤微生物的單一影響[5-6，8-9，11]，關于地上、地下有機碳交互輸入對土壤微生物群落影響的研究較少，對于紅壤退化地植被恢復后土壤微生物的相關研究則更為缺乏。木荷（Schima superba）和馬尾松（Pinus massoniana）是亞熱帶常綠闊葉林中分布廣泛的優(yōu)勢樹種，在我國紅壤退化地區(qū)具有普遍適用性，并且與純林相比，針闊混交在增加微生物生物量和改善林地養(yǎng)分狀況方面更有優(yōu)勢[13]，因此，本研究以亞熱帶木荷與馬尾松針闊混交林為研究對象，以未處理的土壤（凋落物輸入+根系輸入+菌根輸入，LRM）為對照，原位設置雙倍凋落物輸入+根系輸入+菌根輸入（2LRM）、凋落物去除+ 根系輸入+ 菌根輸入（NRM）、凋落物去除+根系去除+菌根輸入（NNM）和凋落物去除+根系去除+菌根去除（NNN）處理，采用高通量測序技術比較有機碳輸入改變下土壤化學性質和土壤微生物群落的變化，旨在揭示退化恢復林地土壤細菌和真菌群落對有機碳輸入改變的響應，從而確定有機碳輸入變化影響的主要微生物類群，確定影響人工恢復林土壤微生物群落結構的關鍵土壤性質，為亞熱帶針闊混交林土壤肥力提升和生態(tài)系統(tǒng)恢復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地為亞熱帶紅壤森林恢復長期定位試驗基地，位于江西省吉安市泰和縣螺溪林場（26°44′N，115°04′E），土壤為第四紀紅色黏土發(fā)育而來的紅壤，年均降水量1726 mm，年均氣溫18.6 ℃，年均日照時間1 574.9 h，無霜期288 d，屬典型亞熱帶濕潤季風氣候。該試驗地原始植被類型為次生灌木，經過長期人為干擾退化成荒地，1991年選擇馬尾松、木荷等闊葉樹種進行生態(tài)恢復形成針闊混交林。據調查，木荷與馬尾松混交林土壤的pH值為5.1，有機質含量為22.6 g·kg^-1，全氮含量為0.7 g·kg^-1，全磷含量為0.2 g·kg^-1；林分密度為2 084 株·hm^-2，平均樹高為6.7 m，平均胸徑為11.5 cm；主要喬木樹種為木荷和馬尾松，其中木荷占比約63%，平均樹高為6.7 m，平均胸徑為11.0 cm，馬尾松占比約37%，平均樹高為6.7 m，平均胸徑為12.3 cm。林下植被主要有苔草（Carex tristachya）、芒萁（Dicranopterisdichotoma）、白檀（Symplocos paniculata）等。

1.2 樣地設計與樣品采集

2018 年12 月，隨機選取3 片木荷與馬尾松混交林，每片林分布設1塊20 m×20 m的標準地。每塊標準地采用隨機區(qū)組的方式布設5種處理，每種處理5個重復（圖1a）。每個處理小區(qū)長1 m、寬0.5 m，小區(qū)上方放置1 m×0.5 m×0.6 m尼龍網框（孔徑為1 mm）。5種處理分別如下：LRM處理（保持原狀）、2LRM處理（僅網框側面圍尼龍網，并每月將NRM處理尼龍網上面的凋落物轉移至此網框中）、NRM處理（清除樣方內凋落物，網框上面和側面均圍尼龍網，以阻止凋落物進入）、NNM處理（清除樣方內凋落物，網框上面和側面均圍尼龍網，并沿樣方四周開挖0.5 m深壕溝，填入37 μm 尼龍網以隔離根系但不影響菌根[14]）、NNN處理（清除樣方內凋落物，網框上面和側面均圍尼龍網，并沿小區(qū)周圍挖0.5 m深壕溝，填入石膏板將小區(qū)與周圍土壤隔離開，以阻止根系和菌絲長入小區(qū)）。2020年8月進行土壤樣品采集，采集前去除土壤表層的凋落物、根系和碎石，將同一標準地相同處理5個重復的0～10 cm 表層土樣均勻混合置于無菌自封袋中作為一份土壤樣品，3塊標準地共采集15份土壤樣品，將樣品置于低溫保溫箱中并盡快帶回實驗室。將采回的樣品分為兩份，一份自然風干后過篩用于土壤化學性質測定和酶活性測定，另一份保存于-80 ℃冰箱用于高通量測序。

1.3 土壤化學性質測定

土壤化學性質測定參考《土壤農業(yè)化學分析方法》[15]：采用電位法測定土壤pH值；采用重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機質；采用凱氏定氮法測定土壤全氮；采用氟化銨-鹽酸浸提法測定土壤速效磷；采用乙酸銨浸提法測定速效鉀。土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、酸性轉化酶和多酚氧化酶活性分別用脲酶試劑盒（BC0120）、蔗糖酶試劑盒（BC0240）、酸性磷酸酶試劑盒（BC0140）、酸性轉化酶試劑盒（BC3075）和多酚氧化酶試劑盒（BC0110）測定[16]。

1.4 土壤微生物高通量測序

利用基因組DNA 提取試劑盒（GENE ray）提取，使用特異引物338F（ACTCCTACGCGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行聚合酶鏈式反應（Polymerasechain reaction，PCR）擴增，使用特異引物ITS1F（CTTG?GTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2（GCTGCGTTCTT?CATCGATGC）對ITS基因的特異區(qū)間進行擴增，擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，降溫至10 ℃。利用Illumina MiSeq 對PCR 擴增產物進行測序。利用Trimmomatic 0.33軟件過濾原始序列，再利用Cutadapt 1.9.1 軟件和FLASH 1.2.7 獲取高質量序列并對其進行拼接，利用Uchime 4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列進而得到有效序列。在97.0%的相似度水平下，利用Usearch v10 軟件對序列進行聚類并與RDP classifier 數據庫已知序列對比，最終獲得每個分類操作單元（Operational taxonomic unit，OTU）的物種注釋信息。

1.5 數據處理

利用SPSS 26.0軟件對混交林不同處理土壤化學性質、酶活性、Alpha多樣性指數和土壤微生物門水平組成進行多重比較（LSD）和Pearson 相關分析（Plt;0.05）。運用Origin 2022軟件繪制土壤微生物門水平物種相對豐度堆疊圖。運用Canoco 5.0 軟件繪制冗余分析（Redundancy analysis，RDA）圖。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

與LRM 處理相比，2LRM 和NNN 處理顯著降低了土壤酸性磷酸酶的活性，NRM和NNM處理對土壤化學性質和酶活性無顯著影響（表1）。

2.2 土壤微生物Alpha多樣性

土壤微生物群落的物種豐富度可通過ACE指數和Chao1指數表示，物種多樣性可通過Simpson指數和Shannon 指數表示。與LRM 處理相比，2LRM、NRM、NNM和NNN處理顯著降低了土壤真菌的豐富度和多樣性，而對細菌的豐富度和多樣性均無顯著影響（表2）。

2.3 土壤微生物群落組成

對土壤樣品進行高通量測序，在97% 的相似度條件下進行聚類分析，細菌共獲得1 054個OTUs，隸屬于21門48綱100目142科210屬221種；真菌共獲得1 017個OTUs，隸屬于9門24綱62目115科187屬181種。5種處理的土壤樣品共檢測出21個細菌門，相對豐度較高的前10 個細菌門分別為酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）、WPS-2 門、髕骨菌門（Patescibacteria）、擬桿菌門（Bacte?roidetes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），其中酸桿菌門（15.5%～40.2%）、變形菌門（23.6%～35.5%）、放線菌門（11.2%～17.7%）均為優(yōu)勢細菌門（圖2a）。與LRM處理相比，NNM處理使酸桿菌門的相對豐度降低了57.7%，使放線菌門的相對豐度提高了57.8%；變形菌門的相對豐度在各處理間未表現出顯著差異性。

5種處理的土壤樣品共檢測出9個真菌門，分別為擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）、羅茲菌門（Rozellomyco?ta）、壺菌門（Chytridiomycota）、毛霉門（Mucoromyco?ta）、Calcarisporiellomycota 門、梳霉門（Kickxellomyco?ta）和球囊菌門（Glomeromycota），其中優(yōu)勢真菌門為擔子菌門（32.5%～47.8%）、子囊菌門（26.9%～48.8%）和被孢菌門（12.8%～34.5%），它們的相對豐度占比超80%（圖2b）。與LRM處理相比，NRM和NNM處理使擔子菌門的相對豐度分別降低了27.6%、22.7%。NRM 處理使子囊菌門的相對豐度提高了62.1%；NNM和NNN處理使被孢菌門的相對豐度分別提高了169.8%和61.0%。

2.4 土壤微生物多樣性與土壤化學性質的關系

土壤真菌群落的豐富度（ACE 指數和Chao1 指數）與土壤速效磷呈顯著負相關，與土壤多酚氧化酶呈顯著正相關；土壤細菌群落的豐富度和多樣性與土壤化學性質無顯著相關性（表3）。

2.5 土壤微生物群落組成與土壤化學性質關系分析

對土壤微生物群落與土壤化學性質進行冗余分析，結果表明土壤化學性質對微生物群落結構有較大影響。RDA的第1軸和第2軸分別解釋了細菌群落變異的60.03%和18.23%，兩軸共同解釋了78.26%的變異（圖3a）。土壤有機質、蔗糖酶、多酚氧化酶是主要的影響因子，其解釋度分別為14.9%（P=0.002）、30.4%（P=0.006）、7.4%（P=0.048）。疣微菌門、浮霉菌門、WPS-2門與土壤pH呈正相關，變形菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門與土壤有機質呈正相關（表4）。RDA的第1軸和第2 軸分別解釋了真菌群落變異的56.87% 和28.17%，兩軸共同解釋了85.04%的變異（圖3b）。土壤pH 和蔗糖酶是主要的影響因子，其解釋度分別為23.6%（P=0.014）和14.8%（P=0.044）。擔子菌門與土壤pH呈負相關，球囊菌門與酸性磷酸酶呈正相關（表4）。

3 討論

3.1 改變有機碳輸入對針闊混交林土壤化學性質的影響

改變有機碳輸入對土壤有機質含量無顯著影響（表1），可能有兩方面的原因：（1）在自然狀態(tài)下有機質的形成和積累過程比較緩慢，木荷葉片較厚且為革質，馬尾松針葉中含有木質素等難分解物質[17]，它們融入到土壤中所需時間較長；（2）有機碳輸入可能會產生激發(fā)效應，導致土壤碳的礦化速率加快[18]。由于土壤有機質是全氮的主要來源[19]，因此全氮含量也未表現出明顯差異。本研究還發(fā)現，不同處理間速效磷含量也沒有表現出顯著差異，主要原因是南方紅壤土鐵鋁氧化物對磷極強的吸附、固定作用，使得土壤中速效磷變成難溶性磷[20]。此外，2LRM處理顯著降低了土壤酸性磷酸酶活性，這與魏翠翠等[21]對亞熱帶米櫧次生林土壤酶活性研究的結果一致。NNN處理也降低了土壤酸性磷酸酶活性，這與根系和菌根分泌酸性磷酸酶有關[22]。土壤脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶和酸性轉化酶活性在不同處理間無顯著差異，體現出這幾種酶對有機碳輸入改變具有一定的適應性。

3.2 改變有機碳輸入對針闊混交林土壤微生物多樣性的影響

改變有機碳輸入降低了真菌群落的豐富度指數，降低程度由大到小依次為NNN 處理、NNM 處理、NRM處理、2LRM處理。凋落物去除會引起土壤中可溶性有機質降低，導致真菌生長所需的營養(yǎng)不足，從而降低真菌群落豐富度。凋落物和根系的同時去除抑制了多酚氧化酶的產生，而多酚氧化酶可以促進有機質中木質素等難分解組分對養(yǎng)分元素的釋放[23]，凋落物和植物根系分泌物的去除導致碳源受阻，從而降低了真菌群落豐富度。與LRM處理相比，2LRM處理反而使土壤真菌豐富度指數和多樣性指數降低，這可能是因為難分解的木質素含量相對升高，而木質素能與酚類等物質形成穩(wěn)定化合物、與芳香族化合物反應生成難分解的腐殖質從而使凋落物的分解受到抑制[24]，引起真菌群落多樣性降低。土壤細菌豐富度和多樣性指數在各處理之間無顯著差異，說明不同有機碳輸入對細菌群落的影響較小，這可能是因為土壤細菌喜中性或堿性環(huán)境，紅壤的酸性條件限制了土壤細菌的生長[25]；同時在酸性土壤中正常生長的耐酸真菌可以代替細菌分解有機物[14]，因此與細菌相比，真菌對有機碳輸入的改變更敏感。

3.3 不同有機碳輸入對針闊混交林土壤微生物群落組成的影響

土壤細菌群落中，酸桿菌門、變形菌門和放線菌門相對豐度占比較大（圖2a），這與邵亞軍等[26]對亞熱帶人工林常見造林樹種的研究結果一致。NNM處理顯著降低酸桿菌門的相對豐度，這可能是因為NNM處理引起土壤pH 升高（表1），而酸桿菌門是一種嗜酸菌，pH升高引起酸桿菌門相對豐度的降低。由于凋落物中含有低分子有機酸，且根系分泌有機酸[18]，而根系分泌的有機酸總量與放線菌門呈顯著負相關[27]，去除凋落物和根系使得土壤中有機酸含量減少，引起放線菌門相對豐度的升高。擔子菌門、子囊菌門和被孢菌門在土壤真菌群落中相對豐度占比較大（圖2b）。由相關分析可知，擔子菌門與pH呈顯著負相關，NRM和NNM處理的土壤pH相對較高，導致擔子菌門的相對豐度降低。同時擔子菌具有較高的木質素分解能力，對凋落物的分解起重要作用。因為被孢霉屬真菌為菌根真菌類益生真菌[28]，所以NNM處理顯著提高了被孢菌門的相對豐度。凋落物去除顯著提升了子囊菌門的相對豐度，這是因為凋落物去除后，子囊菌門能夠有效分解并快速利用根系分泌的有效碳素使其迅速生長，進而成為土壤真菌群落的主要種群[29]；同時子囊菌門與土壤濕度呈顯著正相關[30]，凋落物去除會促進雨水的滲透，使得土壤含水率提高[31]，這也可能使子囊菌門相對豐度得以提高，但這點還需要驗證，因為缺少對土壤水分的監(jiān)測。

3.4 影響針闊混交林土壤微生物群落特征的土壤化學性質

本研究發(fā)現有機質、蔗糖酶和多酚氧化酶是影響細菌群落的關鍵因子（圖3a）。有機質是影響土壤細菌群落的主要環(huán)境因子，地上凋落物或根系輸入引起碳有效性的變化，進而促進土壤有機碳的積累，引起細菌群落的變化，如變形菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門等均為嗜營養(yǎng)菌，富碳環(huán)境會刺激它們快速生長[32]。蔗糖酶是影響土壤微生物群落的關鍵酶，與麥淑媛[33]對岷江上游不同氣候區(qū)土壤微生物研究結果一致。蔗糖酶可以促進腐殖質、有機質等物質的轉化，促進養(yǎng)分的釋放，加速變形菌門等嗜營養(yǎng)菌對養(yǎng)分的獲取[34]。由于多酚氧化酶主要受pH 的影響[35]，亞熱帶酸性紅壤條件提高了多酚氧化酶活性，并且多酚氧化酶能夠參與木質素分解的酚類物質轉化，引起土壤有機質含量增加，進而影響土壤細菌群落[36]。pH 是影響土壤真菌群落的關鍵環(huán)境因子（圖3b）。pH與擔子菌門呈顯著負相關（表4），其變化可以直接改變擔子菌門的相對豐度從而影響真菌群落；pH的變化也會直接影響酸性磷酸酶的活性進而影響球囊菌門的豐度。凋落物和根系分泌有機酸引起pH變化，pH改變會直接影響土壤有效磷的轉化[19]，本研究發(fā)現真菌豐富度與速效磷呈顯著負相關（表3），因此pH 可以通過改變土壤養(yǎng)分的有效性間接影響土壤真菌群落，同時pH還能夠直接影響外生菌根真菌的生長和菌絲代謝從而影響真菌群落[37]。

本研究僅在微生物較為活躍的夏季進行取樣，季節(jié)變化是否會引起結果的不同還需進一步取樣驗證。由于本研究從實驗處理到樣品采集時間不到兩年，有機碳輸入改變對土壤微生物群落組成的影響是否隨處理時間的增加而發(fā)生變化，還需要通過長期實驗進一步論證。

4 結論

（1）本研究采用高通量測序技術探究了有機碳輸入改變對木荷與馬尾松混交林土壤微生物群落特征的影響，發(fā)現受有機碳輸入改變影響的細菌類群主要是酸桿菌門和放線菌門，受影響的真菌類群主要是擔子菌門、被孢菌門和子囊菌門，且真菌群落比細菌群落對碳輸入改變更敏感。

（2）凋落物加倍輸入和凋落物、根系、菌根同時去除顯著降低了土壤酸性磷酸酶的活性。影響土壤細菌群落變化的關鍵因子是土壤有機質、蔗糖酶和多酚氧化酶，影響土壤真菌群落變化的關鍵因子是pH和蔗糖酶。土壤有機質和pH是影響土壤微生物群落變化的關鍵因子。

（3）凋落物和根系同時去除對土壤微生物群落組成的影響最大，凋落物加倍輸入對土壤微生物群落組成的影響最小。