黃芪皂苷Ⅱ成分對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用研究

摘 要：目的" 探究三萜皂苷黃芪皂苷Ⅱ（Astragaloside Ⅱ ， ASⅡ）對三陰乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用及可能的機制。方法" 采用MTT法檢測黃芪皂苷Ⅱ（0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM）對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響；采用Transwell法及劃痕實驗分別檢測黃芪皂苷Ⅱ?qū)DA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲的影響；采用Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表達(dá)水平，從而闡明其調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路的分子機制。結(jié)果" 25μM黃芪皂苷Ⅱ顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，選用未影響細(xì)胞增殖的藥物濃度3.12μM、6.25μM、12.5μM作為低、中、高藥物濃度；與對照組相比，黃芪皂苷Ⅱ呈濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移；同時，該成分抑制MDA-MB-231細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平。結(jié)論" 黃芪皂苷Ⅱ可能通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞：黃芪皂苷Ⅱ；三陰性乳腺癌；轉(zhuǎn)移；PI3K/AKT/mTOR通路

中圖分類號：R285.5，R737.9 " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1671-0142（2025）01-0063-04

乳腺癌作為威脅世界女性的惡性腫瘤之一，長期占據(jù)女性惡性腫瘤發(fā)病率的之首，在女性所有癌癥相關(guān)的死亡中僅次于肺癌。乳腺癌所有病理類型中，三陰性乳腺癌約占15%～20%。同其他類型乳腺癌相比，對該類型乳腺癌缺乏針對性的靶向藥物，且內(nèi)分泌治療無效。此外，三陰性乳腺癌具有強侵襲性，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，內(nèi)臟及腦易轉(zhuǎn)移等特點，因而其預(yù)后差，死亡風(fēng)險較高[1]。目前，手術(shù)和化療是臨床上治療三陰性乳腺癌治療的主要手段，但效果并不理想，尋找治療三陰性乳腺癌的有效方法勢在必行。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）是一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白激酶，參與了細(xì)胞生長、增殖、分化、運動和代謝等功能。磷酸化受體酪氨酸激酶的酪氨酸殘基可使其與PI3K調(diào)控亞基p85相互作用，激活催化亞基p110，后者能催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，而PIP3將作為第二信使通過磷酸化激活蛋白激酶B，即激活A(yù)KT。激活的AKT會介導(dǎo)下游包括mTOR、GSK3β在內(nèi)的多個靶點的激活或抑制，通過多種機制實現(xiàn)對細(xì)胞功能的調(diào)控。在大約70%的乳腺癌中，PI3K/AKT信號通路被過度激活[2]，因此該通路已成為乳腺癌治療的一個有效靶點。由于三陰性乳腺癌中抑癌基因PTEN的缺失及編碼p110亞基的PIK3CA基因的突變，PI3K被過度激活，引發(fā)下游信號激活放大，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和增殖[3]，因此，抑制PI3K/AKT信號通路可能成為三陰性乳腺癌治療的一個有希望的途徑。

我國藥用植物資源豐富，從有應(yīng)用背景的傳統(tǒng)藥用植物中尋找具有抗三陰性乳腺癌的活性物質(zhì)具有重要意義，課題組前期從藥用植物刺楸中首次發(fā)現(xiàn)了以3-羰基常春藤皂苷元和阿江欖仁酸為苷元的三萜皂苷類成分[4]，該植物中皂苷類成分具有抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病及抗真菌作用。刺楸皂苷A能夠通過線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，該細(xì)胞中被激活的PI3K/AKT信號通路受到了抑制?；谝陨涎芯?，本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，基于PI3K/AKT/mTOR信號通路探討三萜皂苷成分黃芪皂苷Ⅱ?qū)θ幮匀橄侔┘?xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，為臨床乳腺癌的治療提供新的途徑。

1 材料

1.1 MDA-MB-231細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑 黃芪皂苷Ⅱ購自江蘇永建醫(yī)藥科技有限公司（5mg/支，純度大于98%，批號：100723）；DMSO購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清分別由美國Hyclone公司和Gibco公司生產(chǎn)；RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑由北京鼎國公司生產(chǎn)（批號：89100146）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒由圣爾生物制造（批號：20180810）；BCA蛋白濃度測定試劑盒及MTT試劑均采購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PI3K抗體購自ABclonal公司（批號：4292）、p-PI3K抗體來源于CST公司（批號：17366）、AKT抗體（批號：A17909）、p-AKT抗體（批號：AP1259）、mTOR抗體（批號：A2445）、p-mTOR抗體（批號：AP0115）均購自ABclonal公司；二抗（兔二抗：ABclonal公司，批號為AS014）。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱由上海力申科學(xué)儀器有限公司供應(yīng)；酶標(biāo)儀的制造商為美國Molecular Devices公司；熒光倒置顯微鏡的生產(chǎn)商是日本奧林巴斯有限公司；化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能生命科學(xué)有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法檢測黃芪皂苷Ⅱ?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖的作用 MDA-MB-231細(xì)胞放置于一種特定的完全培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基以DMEM為基礎(chǔ)，并補充10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素。PBS清洗3遍，用胰酶處理后離心后計數(shù)，細(xì)胞計數(shù)4×104cells/mL，接種于96孔板，其中每孔被加入200 μL懸液，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12至24小時，觀察細(xì)胞形態(tài)確保正常生長。實驗分為對照組及黃芪皂苷Ⅱ0.78 μM、1.56 μM、3.12 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM、100 μM組。每組均設(shè)6個重復(fù)孔。移除各孔中的培養(yǎng)基上清液，向每個孔內(nèi)添加100μL的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10μL的MTT溶液（濃度：5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，再次移除上清液，并向每個孔中加入150μL的二甲基亞砜（DMSO）。輕輕震蕩10分鐘后，使用570 nm波長的光度計測量吸光度（A）值。細(xì)胞的相對增殖率可通過以下公式進(jìn)行計算：細(xì)胞相對增殖率（%）=給藥孔OD值/對照孔OD值×100%。

2.2 Transwell細(xì)胞遷移實驗 實驗前對MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行無血清處理促進(jìn)細(xì)胞饑餓，持續(xù)時間為24小時，選擇處于對數(shù)增長階段的細(xì)胞，按照每孔1 × 105個細(xì)胞的密度、100μL的細(xì)胞懸浮液接種于上室，向下室各孔加入600μL含有20%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基，并于上室后加入終濃度為3.12μM、6.25μM、12.5μM的MDA-MB-231細(xì)胞以及等體積DMSO溶劑對照，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，使用棉簽輕輕清除上室中的細(xì)胞，用PBS洗滌3次，每次持續(xù)5分鐘，下室細(xì)胞用0.1%甲醇結(jié)晶紫染液進(jìn)行固定染色30分鐘。染色完成后，再次用PBS溶液洗滌并晾干小室。最后，在倒置顯微鏡下，使用100倍物鏡隨機選取上下左右共5個視野，拍攝照片以觀察和評估細(xì)胞的跨膜遷移情況。

2.3 劃痕實驗 取對數(shù)增殖期的MDA-MB-231細(xì)胞，將其制備成單細(xì)胞懸浮液，按照每孔5×105個細(xì)胞的密度及每孔2mL的體積接種于六孔板，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞已生長并發(fā)生融合后，更換為不含血清的培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)24小時，以便進(jìn)行后續(xù)的劃痕測試。利用培養(yǎng)板板蓋頂住一支200 μL的無菌黃色槍頭進(jìn)行操作，垂直于板底面并沿孔板中線處迅速劃出一條細(xì)細(xì)的直線，并保證劃痕的寬度一致，于倒置顯微鏡下拍攝初始時間的細(xì)胞狀態(tài)和寬度。其后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗去細(xì)胞碎片后，加無血清培養(yǎng)基，加入3.12μM、6.25μM、12.5μM的黃芪皂苷Ⅱ以及等體積DMSO溶劑對照。24小時后，PBS洗滌3次，拍照觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及劃痕寬度。

2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔板。培養(yǎng)24小時后，各組分別給予等體積DMSO及 3.12μM、6.25μM、12.5μM黃芪皂苷Ⅱ。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，PBS清洗3遍，冰上進(jìn)行細(xì)胞裂解，裂解完成后，通過離心分離細(xì)胞碎片，收集上清液，將上清液與5倍體積的loading buffer以1：4的比例混合均勻，并將混合物在100℃條件下加熱10分鐘，以完成變性處理步驟。樣品保存于-20 ℃。蛋白樣品上樣量25 μg，電泳條件為150v，60 min，轉(zhuǎn)膜條件為320mA，200min。加入一抗（PI3K、AKT、mTOR及對應(yīng)的磷酸化蛋白），4 ℃孵育過夜，在室溫條件下，將二抗孵育2h。孵育步驟結(jié)束后，利用TBST溶液對樣本進(jìn)行洗滌處理，以有效去除未與抗原結(jié)合的抗體。洗滌后，采用ECL發(fā)光試劑對蛋白質(zhì)條帶執(zhí)行顯影操作。為了精確量化條帶的灰度值，運用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件處理分析。分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。為了比較不同組之間的差異，采用了單因素方差分析（ANOVA）。在進(jìn)行組間樣本均值的比較時，使用了LSD-t檢驗作為后續(xù)的多重比較方法。

3 結(jié)果

3.1 黃芪皂苷Ⅱ?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖作用 采用不同濃度梯度的黃芪皂苷Ⅱ干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞，對照組采用等量的DMSO溶液，培養(yǎng)24小時后，MTT結(jié)果顯示（圖1），黃芪皂苷Ⅱ濃度低于25μM對MDA-MB-231細(xì)胞增殖無影響，濃度≥25μM顯著抑制細(xì)胞增殖（Plt;0.001），故選用黃芪皂苷Ⅱ濃度3.12μM、6.25μM、12.5μM用于后續(xù)對MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用的研究。

3.2 黃芪皂苷Ⅱ?qū)DA-MB-231細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的影響 選用不抑制細(xì)胞增殖的黃芪皂苷Ⅱ濃度3.12μM、6.25μM、12.5μM干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞，劃痕實驗結(jié)果顯示（圖2A），與對照組比較，黃芪皂苷Ⅱ作用后，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著下降，（Plt;0.01或Plt;0.001）并呈濃度依賴性；Transwell實驗結(jié)果顯示（圖2B），黃芪皂苷Ⅱ作用后，MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力顯著下降（Plt;0.05或Plt;0.001），結(jié)果呈濃度依賴性。綜上可見，黃芪皂苷Ⅱ能夠在不影響細(xì)胞增殖的情況下，顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。

3.3 黃芪皂苷Ⅱ通過PI3K/AKT/mTOR通路影響MDA-MB-231細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移 Western blot結(jié)果表明（圖3），黃芪皂苷Ⅱ濃度6.25μM抑制p-PI3K、p-mTOR的表達(dá)（Plt;0.05），12.5μM顯著抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)（Plt;0.01）。因此，黃芪皂苷Ⅱ抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，從而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

4 討論

研究表明[5]，乳腺癌的發(fā)病率在全球女性癌癥中占第一位，三陰性乳腺癌作為乳腺癌的一種，對靶向和內(nèi)分泌治療不敏感，且其自身的高侵襲轉(zhuǎn)移能力，最終導(dǎo)致預(yù)后較差，死亡風(fēng)險較高。目前臨床尚無可靠的三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移的防治方法，而中醫(yī)藥憑借其獨特的辯證論治理論在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。近年來，中藥憑借多靶點優(yōu)勢、治療效果明顯、毒副作用小等優(yōu)點，備受研究者的關(guān)注。黃芪皂苷Ⅱ是傳統(tǒng)中藥黃芪中主要有效成分之一，研究發(fā)現(xiàn)[6，7]，黃芪皂苷具有升陽、固表、補中益氣的功效，能有效增強機體特異及非特異性免疫功能和抗腫瘤。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖活力隨黃芪皂苷Ⅱ的劑量而改變，黃芪皂苷Ⅱ的劑量越高，其對MDA-MB-231的增殖抑制作用就越強。劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷Ⅱ作用后，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著下降；Transwell實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予黃芪皂苷Ⅱ后，MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力顯著下降。因此，中黃芪皂苷Ⅱ能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。

PI3K/AKT/mTOR信號通路在乳腺癌疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，參與了細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過程[8，9]。PI3K脂類激酶及其下游分子AKT參與調(diào)控多種酪氨酸激酶受體激活的致癌信號通路。酪氨酸激酶在細(xì)胞內(nèi)異常高表達(dá)進(jìn)而激活下游信號通路，其基因表達(dá)水平與乳腺癌的生長及轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。本實驗結(jié)果顯示，黃芪皂苷Ⅱ濃度6.25μM抑制MDA-MB-231細(xì)胞p-PI3K、p-mTOR蛋白的表達(dá)，12.5μM顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達(dá)，說明黃芪皂苷Ⅱ能不同程度的抑制MDA-MB-231細(xì)胞PI3K/AKT/m TOR信號通路的激活。

綜上，黃芪皂苷Ⅱ可以明顯降低MDA-MB-231細(xì)胞增殖、細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，同時會明顯降低細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)，且具有劑量效應(yīng)。因此，黃芪皂苷Ⅱ抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活來發(fā)揮抗腫瘤作用，本研究將為三萜皂苷類活性物質(zhì)臨床抗腫瘤應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 劉 紅）