黃芪種子小蜂氣味結(jié)合蛋白基因的鑒定及表達(dá)分析

摘要

氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins， OBPs）在黃芪種子小蜂 Bruchophagus huonchili Liao et Fan 識(shí)別并為害中藥材黃芪種子的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為探明黃芪種子小蜂的嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)理， 本研究建立了黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)， 挖掘和鑒定嗅覺(jué)識(shí)別相關(guān)的氣味結(jié)合蛋白基因。采用Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析， 在COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、TrEMBL、eggNOG、Nr等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋， 根據(jù)注釋信息篩選黃芪種子小蜂OBP基因;利用DNAMAN和MEGA 11.0軟件分析OBP基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及進(jìn)化關(guān)系;通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)黃芪種子小蜂雌、雄成蟲(chóng)觸角中OBP基因的表達(dá)量及被不同揮發(fā)物誘導(dǎo)后的表達(dá)量。結(jié)果顯示， 從黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中共獲得98 655條unigenes， 其中54 670條unigenes 在公共數(shù)據(jù)庫(kù)被注釋到， 從注釋結(jié)果中篩選到25個(gè)BhuoOBPs， 序列比對(duì)結(jié)果顯示， 除BhuoOBP14、BhuoOBP19外， 其余 23個(gè)BhuoOBPs均包含6個(gè)保守的半胱氨酸殘基， 屬于classic OBPs。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明， 大部分BhuoOBPs與麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asonia vitripennis、白蛾周氏嚙小蜂Chouioia cunea、麗蚜小蜂Encarsia formosa、松毛蟲(chóng)赤眼蜂Trichogramma dendrolimi等小蜂總科昆蟲(chóng)的OBPs氨基酸序列聚到一起， 表明它們之間親緣關(guān)系較近。RT-qPCR結(jié)果顯示， 在10 μg/μL的引誘劑羅勒烯誘導(dǎo)下， 雌蟲(chóng)觸角中BhuoOBP18和雄蟲(chóng)觸角中BhuoOBP21表達(dá)上調(diào)最顯著， 分別為對(duì)照的147.4 倍和615.6倍;在100 μg/μL的驅(qū)避劑4-萜烯醇誘導(dǎo)下， 雌蟲(chóng)觸角中BhuoOBP22和雄蟲(chóng)觸角中BhuoOBP10上調(diào)最顯著， 分別為對(duì)照的742.4倍和1 684.4倍。本研究建立了黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)， 鑒定并分析了BhuoOBPs 基因在不同揮發(fā)物誘導(dǎo)下觸角中的表達(dá)量， 為進(jìn)一步研究黃芪種子小蜂嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

黃芪種子小蜂;" 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;" 氣味結(jié)合蛋白;" 觸角;" RT-qPCR

中圖分類號(hào)：

S 433

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024049

收稿日期：" 20240125""" 修訂日期：" 20240218

基金項(xiàng)目：

財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-21）

致" 謝：" 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

zxh6288@126.com

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為并列第一作者

Identification and expression analysis of odorant-binding protein gene in adult Bruchophagus huonchili （Hymenoptera： Eurytomidae）

KANG Jie1，" XUE Zhaozhuo1，" SHI Wenli1，" ZHENG Haixia1，" NIU Yanbing2，" ZHANG Xianhong1*

（1. College of Plant Protection， Shanxi Agricultural University， Taigu" 030801， China; 2. College of Life

Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu" 030801， China）

Abstract

Odorant-binding proteins （OBPs） play a crucial role in the recognition and infestation of Bruchophagus huonchili Liao et Fan to Astragalus membranaceus. To investigate the olfactory recognition mechanism， an adult antennal transcriptome database of B.huonchili was established， and OBP genes were mined and identified. Transcriptome analysis was performed using the Illumina HiSeq platform， and gene annotations were performed across multiple public databases， including COG， GO， KEGG， KOG， Pfam， Swissprot， TrEMBL， eggNOG， and Nr. OBP gene structural characteristics and evolutionary relationships were analyzed using DNAMAN and MEGA 11.0 software， while RT-qPCR was used to assess the expression of OBP genes in the antennae of female and male adult wasps and its response to different volatile inductions. A total of 98 655 unigenes were obtained from the transcriptome， with 54 670 unigenes annotated in the public databases. Among the 25 identified BhuoOBPs， all except BhuoOBP14 and BhuoOBP19 contained six conserved cysteine residues， belong to classic OBPs. Phylogenetic analysis indicated that most BhuoOBPs clustered with OBPs from other Chalcidoidea insects， such as Nasonia vitripennis， Chouioia cunea， Encarsia formosa， and Trichogramma dendrolimi， indicating that they are closely related to each other. RT-qPCR results showed significant upregulation of BhuoOBP18 in female and BhuoOBP21 in male antennae by 147.4-fold and 615.6-fold， respectively， under 10 μg/μL ocimene induction. Under 100 μg/μL terpinen-4-ol induction， BhuoOBP22 in female and BhuoOBP10 in male antennae were most significantly up-regulated， reaching 742.4-fold and 1 684.4-fold， respectively. This study provides a theoretical basis for further exploration of the olfactory recognition mechanism in B.huonchili.

Key words

Bruchophagus huonchili;" transcriptome sequencing;" odorant-binding protein;" antenna;" RT-qPCR

黃芪種子小蜂 Bruchophagus huonchili Liao et Fan屬膜翅目 Hymenoptera 廣肩蜂科 Eurytomidae 種子廣肩小蜂屬 Bruchophagus，是為害中藥材黃芪種子的單食性害蟲(chóng)［1］，廣泛分布于我國(guó)北方黃芪各產(chǎn)區(qū)［2］。當(dāng)黃芪種子處于鼓粒期時(shí)，雌成蟲(chóng)將卵產(chǎn)于豆莢內(nèi)的種皮下，幼蟲(chóng)在種子內(nèi)孵化后開(kāi)始蛀食為害并化蛹［34］。近年來(lái)，隨著中藥材黃芪產(chǎn)業(yè)在山西等省的種植區(qū)快速發(fā)展，黃芪種子小蜂的發(fā)生與為害呈現(xiàn)日趨嚴(yán)重的態(tài)勢(shì)。調(diào)查表明，包括黃芪種子小蜂在內(nèi)的黃芪籽蜂對(duì)黃芪的

一般為

害率為30%～50%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)60%以上，對(duì)中藥材黃芪種子的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，并對(duì)黃芪產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了一定的影響［5］。

嗅覺(jué)在昆蟲(chóng)與外界信息交流中發(fā)揮重要作用，是昆蟲(chóng)寄主選擇、尋找配偶、躲避不利環(huán)境等行為活動(dòng)的基礎(chǔ)［69］。昆蟲(chóng)對(duì)氣味分子的識(shí)別過(guò)程包括：親脂性氣味分子通過(guò)觸角表面感受器上的微孔進(jìn)入淋巴液，與其中的氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein， OBP）特異性結(jié)合形成OBP-氣味分子復(fù)合物，

復(fù)合物被運(yùn)送至嗅覺(jué)神經(jīng)元膜上的

氣味受體（odorant receptor， OR）并使之激活，化學(xué)信號(hào)被轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，形成神經(jīng)沖動(dòng)，從而指導(dǎo)昆蟲(chóng)作出相應(yīng)的嗅覺(jué)反應(yīng)［1012］。其中，OBPs特異性識(shí)別化學(xué)物質(zhì)的過(guò)程被認(rèn)為是氣味分子影響昆蟲(chóng)行為活動(dòng)的第一步，更是決定昆蟲(chóng)能否對(duì)氣味分子作出響應(yīng)的關(guān)鍵蛋白［1314］。根據(jù)保守半胱氨酸（Cys）殘基的數(shù)量，OBP可以分為至少5種類型：典型的OBPs（classic OBPs， C1-Xn-C2-X3-C3-Xn-C4-Xn-C5-X8-C6）、minus-C OBPs （C1-Xn-X3-C3-Xn-C4-Xn-X8-C6）、plus-C OBPs （C1-Xn-C2-X3-C3-Xn-C4-Xn-C4a-X9-C5-X8-C6-P-Xn-C6a-Xn）、二聚體OBPs（dimer OBPs，有2個(gè)保守的６個(gè)Cys位點(diǎn)）、非典型OBPs （atypical OBPs，具有9～10個(gè)Cys和較長(zhǎng)的Ｃ-末端）［15］。

近年來(lái)，有關(guān)昆蟲(chóng)OBP的分子特性、結(jié)構(gòu)和功能及對(duì)植物揮發(fā)物的識(shí)別機(jī)理的研究不斷深入［1617］。He等［18］在麗蚜小蜂 Encarsia formosa 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出39個(gè)OBP基因并構(gòu)建了組織表達(dá)譜， 為進(jìn)一步研究麗蚜小蜂EforOBPs 的功能以及EforOBPs與寄主的相互作用提供了分子基礎(chǔ);Zhang等［19］通過(guò)分析淡足側(cè)溝繭蜂 Microplitis pallidipes OBP基因的組織表達(dá)譜， 發(fā)現(xiàn)MpOBP2和MpPBP主要在雌成蟲(chóng)觸角中表達(dá)， 推測(cè)這2個(gè)基因可能是識(shí)別寄主揮發(fā)物的關(guān)鍵基因;而MpOBP3、MpOBP8和MpOBP10主要在雄成蟲(chóng)觸角中表達(dá)， 可能是檢測(cè)性信息素的關(guān)鍵基因， 這些發(fā)現(xiàn)為OBP在寄生蜂甚至其他昆蟲(chóng)中的功能提供了重要的研究基礎(chǔ)。與其他昆蟲(chóng)相比， 黃芪種子小蜂的寄主植物單一， 除黃芪外并未發(fā)現(xiàn)其他寄主， 且1頭幼蟲(chóng)僅危害1粒種子， 前期研究發(fā)現(xiàn)1粒種子被2頭幼蟲(chóng)同時(shí)寄生的概率僅為1/4 000（未發(fā)表）。黃芪種子小蜂成蟲(chóng)是如何精準(zhǔn)定位到黃芪豆莢進(jìn)行產(chǎn)卵， 其嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制如何目前還未見(jiàn)報(bào)道。為此， 本研究構(gòu)建了黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)， 從中篩選鑒定出OBP基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析， 并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析BhuoOBPs在不同植物揮發(fā)物誘導(dǎo)前后的表達(dá)量， 旨在為黃芪種子小蜂專一識(shí)別寄主植物的嗅覺(jué)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 供試材料

2022年6月下旬－7月上旬， 于山西省介休市綿山鎮(zhèn)興地村黃芪田（111.95°E， 36.88°N）采集處于鼓粒期的黃芪豆莢， 帶回實(shí)驗(yàn)室置于溫度（30±2）℃、光照周期L∥D=14 h∥10 h、相對(duì)濕度（55±5）%的人工氣候箱中。待被害豆莢內(nèi)的成蟲(chóng)羽化后， 選擇觸角完整、活躍的1～2日齡成蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和OBP基因的表達(dá)分析。

1.2" 方法

1.2.1" 總RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)

分別挑選羽化1～2 d活躍的黃芪種子小蜂雌、雄成蟲(chóng)各30頭，收集觸角，

使用微量總RNA提取試劑盒（簡(jiǎn)石生物）提取觸角總RNA， 3次生物學(xué)重復(fù)。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否存在RNA降解和DNA污染;利用超微分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)分別檢測(cè)RNA的純度、濃度，

選取OD260/OD280在1.8～2.2之間的RNA樣品備用。

1.2.2" cDNA 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

取1 μg檢測(cè)合格的RNA樣品， 使用NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit構(gòu)建cDNA文庫(kù)。具體方法： 首先用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA， 在Buffer中將mRNA隨機(jī)打成短片段， 以短片段mRNA為模板、使用隨機(jī)寡核苷酸引物在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成 cDNA 第一鏈。之后加入dNTPs、RNaseH、緩沖液與 DNA polymeraseⅠ合成 cDNA第二鏈。純化雙鏈 cDNA并進(jìn)行黏性末端修復(fù)， 在cDNA的3′末端加上堿基A并連接測(cè)序接頭。再用AMPureXP系統(tǒng) （Beckman Coulter， Beverly， USA）篩選250～300 bp的cDNA， 采用Phusion高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和Index （X）引物進(jìn)行擴(kuò)增。最后用AMPure XP系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化， 并運(yùn)用Agilent 2100 Bioanalyzer （安捷倫科技， 美國(guó)）系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估?；谶吅铣蛇厹y(cè)序（sequencing by synthesis， SBS）技術(shù)， 在 Illumina Hiseq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.3" 觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝與分析

首先對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行過(guò)濾，去掉reads中的測(cè)序接頭和引物序列， 將不確定堿基比率超過(guò)10%的reads和低質(zhì)量的reads過(guò)濾出去， 得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)（clean data）。然后計(jì)算clean data的 Q30、Q20和GC含量以及重復(fù)序列水平。采用Trinity系統(tǒng)對(duì)clean reads進(jìn)行拼接， 從而獲得高質(zhì)量的unigenes。使用 BLAST軟件， 將黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角的unigenes序列與 COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、TrEMBL、eggNOG、Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)， 應(yīng)用KOBAS 2.0軟件對(duì)獲得的unigenes進(jìn)行KEGG富集和注釋。使用HMMER軟件預(yù)測(cè)unigenes的氨基酸序列， 然后與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得unigenes的注釋信息。

1.2.4" 黃芪種子小蜂觸角OBP的鑒定及生物信息學(xué)分析

將上述測(cè)序完成的黃芪種子小蜂觸角轉(zhuǎn)錄組信息， 結(jié)合從NCBI Identical Protein Groups數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的其他昆蟲(chóng)OBP序列進(jìn)行本地BLAST比對(duì)，根據(jù)模式特征來(lái)判斷所得序列是否為OBP基因， 最后通過(guò)BLASTx和BLASTn軟件進(jìn)行人工檢驗(yàn)。對(duì)鑒定到的OBP基因進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)（http：∥www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf.html）， 并將核苷酸序列翻譯為蛋白序列;利用在線網(wǎng)站ExPASy（https：∥web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì);運(yùn)用SignalP4.1Server （http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）在線工具對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。用 DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)［20］;應(yīng)用MEGA 11.0軟件的鄰接法（1 000次重復(fù)）構(gòu)建黃芪種子小蜂與其他膜翅目昆蟲(chóng)OBP氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)［2122］。

1.2.5" 黃芪種子小蜂OBP基因在觸角中的表達(dá)分析

取質(zhì)量合格的總RNA 1 μg， 采用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）合成cDNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。雌、雄各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)， 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含30頭成蟲(chóng)的觸角。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)黃芪種子小蜂25個(gè)OBP基因的qPCR引物， 以β-actin為內(nèi)參基因（表1）。RT-qPCR在安捷倫Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行， 反應(yīng)體系（20 μL）： 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL， 上、下游引物各0.4 μL， cDNA 模板0.8 μL， ddH2O補(bǔ)足至20 μL。qPCR反應(yīng)程序： 95℃ 30 s;95℃ 10 s， 60℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s， 60℃ 60 s， 95℃ 15 s。

1.2.6" 黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角OBP基因被不同揮發(fā)物刺激后表達(dá)量分析

使用實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的具有引誘效果的10 μg/μL羅勒烯（上海麥克林生化科技有限公司）和具有驅(qū)避效果的100 μg/μL 4-萜烯醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）， 分別刺激黃芪種子小蜂成蟲(chóng)20 min后取樣， 以石蠟油［生工生物工程（上海）股份有限公司］做對(duì)照。雌、雄各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)， 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含30頭成蟲(chóng)的觸角。具體步驟參見(jiàn) 1.2.5。

1.2.7" 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCT法分析基因表達(dá)量數(shù)據(jù)， 用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析， 用 GraphPad Prism 9.5.1 軟件繪圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組序列組裝與分析

黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果如表2所示。6個(gè)樣品篩選后總堿基數(shù)基本在5～9 Gb之間， GC含量分別為41.02%、40.02%、38.59%、35.63%、36.36%、37.90%， N堿基均為0.00， Q20均大于96%， Q30均大于91%。表明本次測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，置信度高， 可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。clean reads在Trinity軟件上進(jìn)行拼接組裝， 共得到轉(zhuǎn)錄本（transcript） 167 209條， 平均長(zhǎng)度為1 447 bp， N50長(zhǎng)度值為3 200；unigenes 98 655條， 平均長(zhǎng)度為775 bp， N50長(zhǎng)度值為1 493。說(shuō)明樣品的組裝完整性良好， 可用于后續(xù)分析。

2.2" 黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋

黃芪種子小蜂成蟲(chóng)觸角unigenes序列通過(guò) BLAST 軟件（E≤10-5）與各大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在Nr、TrEMBL、COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot 和 eggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到53 491、52 872、10 585、30 674、35 998、26 038、29 553、28 969和40 849條unigenes（表3）。

2.3" 黃芪種子小蜂觸角 OBP 的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

黃芪種子小蜂觸角中共鑒定得到25個(gè)OBP， 依次命名為BhuoOBP1～BhuoOBP25， 開(kāi)放閱讀框編碼的氨基酸長(zhǎng)度均介于81～159 aa之間， 12 個(gè) BhuoOBPs具有信號(hào)肽（表4）。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)， 除BhuoOBP14缺少第6個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)、BhuoOBP19 缺少第1個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)外， 其余BhuoOBPs均含有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)， 符合classic OBPs的結(jié)構(gòu)特征（圖1）。將鑒定到的25個(gè)OBP與NCBI其他膜翅目昆蟲(chóng)OBP的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析， 結(jié)果顯示， 所有序列聚為兩大分支， 其中BhuoOBP1和BhuoOBP3， BhuoOBP2 和 BhuoOBP12， BhuoOBP8和BhuoOBP9、BhuoOBP11 和BhuoOBP21親緣關(guān)系最近。大部分OBP都與小蜂總科的OBP聚類到一起， 其中BhuoOBP6、BhuoOBP13、BhuoOBP17和BhuoOBP18與麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asonia vitripennis的OBP聚類到一起;BhuoOBP9、BhuoOBP14、BhuoOBP16和BhuoOBP20與白蛾周氏嚙小蜂Chouioia cunea的OBP聚類到一起;BhuoOBP4與麗蚜小蜂Encarsia formosa的OBP聚類到一起;BhuoOBP5和BhuoOBP24與松毛蟲(chóng)赤眼蜂Trichogramma dendrolimi的OBP聚類到一起;BhuoOBP10與孟氏胯姬小蜂Quadrastichus mendeli的OBP聚類到一起；BhuoOBP7、 BhuoOBP25分別與麗蠅蛹集金小蜂和白蛾周氏嚙小蜂的OBP聚為一小支（圖2）。

2.4" 黃芪種子小蜂OBP基因在觸角中的表達(dá)分析

BhuoOBPs 在黃芪種子小蜂觸角中的表達(dá)情況如圖3所示， 共鑒定到 25 個(gè)OBP基因， 其中 BhuoOBP1、BhuoOBP5、BhuoOBP7、BhuoOBP10、BhuoOBP13、BhuoOBP16、BhuoOBP18、BhuoOBP19、BhuoOBP24和BhuoOBP25在雄蟲(chóng)觸角的表達(dá)量高于雌蟲(chóng)觸角，而B(niǎo)huoOBP8和BhuoOBP21在雄蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量比雌蟲(chóng)觸角低。

2.5" 不同植物揮發(fā)物誘導(dǎo)后BhuoOBPs在觸角中的表達(dá)分析

不同揮發(fā)物誘導(dǎo)后， 黃芪種子小蜂觸角中OBP基因的表達(dá)如圖4所示。引誘物10 μg/μL 羅勒烯的誘導(dǎo)下， 雌蟲(chóng)觸角中有7個(gè)BhuoOBPs的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)， 其中BhuoOBP18的上調(diào)倍數(shù)最大， 為對(duì)照的147.4倍（Plt;0.000 1）， 其他上調(diào)倍數(shù)均較小， 雄蟲(chóng)觸角中14個(gè) BhuoOBPs的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)， 其中BhuoOBP21的上調(diào)倍數(shù)最大， 為對(duì)照的615.6倍（Plt;0.000 1）;驅(qū)避物100 μg/μL 4-萜烯醇的誘導(dǎo)下， 雌蟲(chóng)觸角中9個(gè)BhuoOBPs的表達(dá)量顯著上調(diào)， 其中BhuoOBP22的表達(dá)量上調(diào)最顯著， 為對(duì)照的742.4倍（Plt;0.000 1）， 雄蟲(chóng)觸角中18個(gè)BhuoOBPs的表達(dá)量顯著上調(diào)， 其中BhuoOBP10上調(diào)倍數(shù)最大， 為對(duì)照的1 684.4倍， 其他依次為BhuoOBP22上調(diào)838.9倍、BhuoOBP5上調(diào)633.7倍、BhuoOBP25上調(diào)409.3倍、BhuoOBP16上調(diào)400.9倍、BhuoOBP9上調(diào)153.9倍、BhuoOBP7上調(diào)112.2倍， 其他上調(diào)倍數(shù)均較低。

3" 結(jié)論與討論

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法從黃芪種子小蜂觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出25個(gè)OBP基因， 與大多數(shù)膜翅目昆蟲(chóng)的OBP數(shù)量相當(dāng)。例如， 白蛾周氏嚙小蜂Chouioia cunea觸角中鑒定到25個(gè)OBP基因［23］， 短翅蚜小蜂Aphelinus asychis觸角中鑒定到27個(gè)OBP基因［24］， 中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis mediator中鑒定到20個(gè)OBP基因［25］， 短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum中鑒定到22個(gè)OBP基因［26］， 麗蚜小蜂Encarsia formosa觸角中鑒定到39個(gè)OBP基因［18］， 前裂長(zhǎng)管繭蜂Diachasmimorpha longicaudata中鑒定到43個(gè)OBP基因［27］。在膜翅目昆蟲(chóng)中只有少數(shù)種類的OBP數(shù)量超過(guò)50個(gè)， 如在麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asonia vitripennis中鑒定到90個(gè)OBP基因［28］。這種數(shù)量上的差異可能是因?yàn)閺?fù)雜的外界環(huán)境變化或基因功能的多樣性造成的， 或是因?yàn)镺BP基因不僅存在于觸角中， 也存在于其他組織器官［29］。

本研究鑒定到的25個(gè)BhuoOBPs中23個(gè)含有6個(gè)保守的半胱氨酸（Cys）位點(diǎn)， 屬于classic OBP家族， 這些保守的Cys殘基可以形成6個(gè)a-螺旋結(jié)構(gòu)域來(lái)限定疏水結(jié)合腔結(jié)構(gòu)， 且保守Cys之間形成交聯(lián)的二硫鍵可以穩(wěn)固O(píng)BPs的三維結(jié)構(gòu)并形成氣味結(jié)合袋， 從而確保蛋白與外界氣味分子的特異性結(jié)合［12，3031］。

基于OBPs氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明， 多數(shù)BhuoOBPs集中分布在兩大支上， 說(shuō)明黃芪種子小蜂BhuoOBPs在種內(nèi)分化較小， 且大部分BhuoOBPs都與小蜂總科的麗蠅蛹集金小蜂、白蛾周氏嚙小蜂、麗蚜小蜂、松毛蟲(chóng)赤眼蜂聚類到一起， 表明它們的進(jìn)化程度相近， 可能具有相似的生理功能。

表達(dá)譜分析是研究基因功能的基礎(chǔ)手段［32］。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì) BhuoOBPs 在黃芪種子小蜂雌、雄成蟲(chóng)觸角中的表達(dá)情況進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)不同基因的相對(duì)表達(dá)量差異很大， 高表達(dá)的 BhuoOBPs 可能在識(shí)別寄主的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且這些基因也存在性別偏向性表達(dá)的現(xiàn)象， 這可能是由于雌、雄黃芪種子小蜂成蟲(chóng)在整個(gè)種群生活中的分工不同， 使得不同性別在特定時(shí)期承擔(dān)的角色不同， 也可能是由于這些基因除嗅覺(jué)功能外， 還能調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、免疫作用等［15］。陳聰［33］研究發(fā)現(xiàn)，香樟Cinnamomum camphora的揮發(fā)物活性組分樟腦（D（+）-camphor）可誘導(dǎo)香樟齒喙象Pagiophloeus tsushimanus雌、雄成蟲(chóng)的PtsuOBP7、PtsuOBP16、PtsuOBP24、PtsuOBP33與PtsuOBP39等5個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)， 推測(cè)這幾個(gè)OBP是結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)氣味分子的關(guān)鍵OBP。張小鳳［34］用4種寄主植物處理橘小實(shí)蠅 Bactrocera dorsalis， 均出現(xiàn)部分OBP基因顯著上調(diào)表達(dá)的情況， 其中BdorOBP1和BdorOBP5在橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)頭部顯著表達(dá)， 推測(cè)這2個(gè)OBP在橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)選擇產(chǎn)卵寄主的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。而本研究發(fā)現(xiàn)， 在具有引誘效果的寄主植物揮發(fā)物羅勒烯的誘導(dǎo)下， 黃芪種子小蜂雌蟲(chóng)觸角中BhuoOBP18和雄蟲(chóng)觸角中BhuoOBP21的表達(dá)量顯著上調(diào)， 這2個(gè)OBP可能是黃芪種子小蜂識(shí)別寄主揮發(fā)物過(guò)程中的重要OBP。而在驅(qū)避物4-萜烯醇的誘導(dǎo)下， 雌蟲(chóng)觸角中BhuoOBP22和雄蟲(chóng)觸角中BhuoOBP10的表達(dá)量上調(diào)最顯著。不同揮發(fā)物刺激后雌、雄蟲(chóng)OBP基因表達(dá)有所差異， 這可能與黃芪種子小蜂雌、雄成蟲(chóng)觸角感器數(shù)量、種類有關(guān)。

被揮發(fā)物誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)的BhuoOBPs可能在與寄主植物互作或者識(shí)別具有驅(qū)避效果的組分的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此， 后期可以對(duì)這些基因進(jìn)行克隆， 并運(yùn)用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、RNA干擾等試驗(yàn)對(duì)BhuoOBPs進(jìn)行功能驗(yàn)證。本研究為進(jìn)一步研究黃芪種子小蜂寄主定位、交配和產(chǎn)卵等重要生命活動(dòng)的嗅覺(jué)分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)， 并為今后開(kāi)展綠色防治工作提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）