心腦舒通膠囊抑制鐵死亡減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的機制

關鍵詞心腦舒通膠囊；腦缺血再灌注損傷；鐵死亡；Nrf2/HO-1/GPX4信號通路

缺血性腦卒中是由大腦局部供血障礙所導致的神經功能受損、腦組織壞死的一類疾病，其發(fā)病率、致殘率、復發(fā)率、病死率均較高，給患者家庭和社會帶來沉重的經濟負擔[1]。目前，缺血性腦卒中的臨床治療以靜脈溶栓和動脈內血栓切除術為主，以恢復缺血腦組織的血液供應。然而，缺血腦組織在快速再灌注時，會發(fā)生一系列繼發(fā)性病理損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebralischemia-reperfusioninjury，CIRI），進而阻礙患者神經功能的恢復；CIRI的病理機制較為復雜，涉及炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等過程[2―3]。因此，深入研究CIRI的病理過程對于探索有效的防治策略至關重要。

鐵在腦組織內存在著動態(tài)平衡，當腦缺血再灌注時，腦組織細胞損傷，血腦屏障破壞，腦實質內的鐵水平急劇升高，從而引發(fā)鐵超載、脂質過氧化、鐵代謝紊亂等，最終導致腦細胞鐵死亡[4―5]。近年來，相關研究證實，鐵死亡是誘發(fā)CIRI的一種新機制，與腦組織細胞死亡密切相關[6―7]?？梢姡种畦F死亡逐漸成為減輕CIRI患者神經損傷的一種重要方法。

心腦舒通膠囊是由中藥蒺藜干燥的地上全草提取后制成的膠囊劑，其主要成分是蒺藜總皂苷，具有活血化瘀、舒利血脈等藥理作用[8]。藥理實驗研究顯示，心腦舒通膠囊能夠顯著提高CIRI沙鼠的成活率，減輕沙鼠海馬CA1區(qū)的神經細胞損傷[9]；心腦舒通膠囊可促進大鼠腦缺血后微血管新生和神經功能恢復[10]。研究顯示，核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2，Nrf2）/血紅素氧合酶1（hemeoxygenase1，HO-1）/谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）是鐵死亡的關鍵通路，激活Nrf2/HO-1/GPX4信號通路可抑制CIRI大鼠神經元鐵死亡[11]。基于此，本研究擬采用短暫性大腦中動脈閉塞（transientmiddlecerebralarteryocclusion，tM-CAO）法建立CIRI大鼠模型，并從Nrf2/HO-1/GPX4信號通路角度出發(fā)，探討心腦舒通膠囊是否可通過調控鐵死亡途徑改善CIRI，以期為心腦舒通膠囊的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

本研究所用實驗動物為SPF級6周齡雄性SD大鼠，共50只，體重180～200g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號為SCXK（魯）20220006。大鼠飼養(yǎng)于河南省中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物中心，溫度22～25℃、濕度50%～70%的環(huán)境中，自由進食與飲水。本實驗經河南省中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準，批準號為HNTCMDW-2024050502。

1.2 主要藥品與試劑

心腦舒通膠囊（批號2108026，規(guī)格為每粒含呋甾皂苷15mg）購自吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司；銀杏葉提取物片（批號7491222，規(guī)格為每片含銀杏葉提取物40mg）購自德國威瑪舒培博士藥廠；組織鐵、脂質過氧化物（lipidperoxide，LPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量檢測試劑盒（批號分別為2309001、2309002、1310003、2310004）均購自北京索萊寶科技有限公司；TTC染色試劑盒（批號20230630）購自南京建成科技有限公司；兔源HO-1、GPX4抗體（批號分別為ab189491、ab125066）均購自英國Abcam公司；兔源Nrf2抗體（批號16396-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體（批號AB-P-R001）購自杭州賢至生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號B42Q00103）購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；ECL化學發(fā)光底物試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（批號分別為BL520A、BL699A、BL697A）均購自北京蘭杰柯科技有限公司；引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設計、合成。

1.3 主要儀器

本研究所用主要儀器有SynergyNEO型全自動多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）、FluorChemR型凝膠成像分析儀（美國ProteinSimple公司）、TG16KK型高速低溫離心機（長沙東旺實驗儀器有限公司）、Quanstudio5型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ThermoFisherScientific公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

將大鼠隨機分為假手術組，模型組，心腦舒通低、高劑量組（220、440mg/kg，低、高劑量分別為臨床等效劑量的2、4倍），銀杏葉提取物組（陽性對照，150mg/kg，劑量根據臨床等效劑量換算而得），每組10只。各給藥組大鼠灌胃相應藥液，假手術組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，均連續(xù)7d。

2.2 造模與取材

采用tM-CAO法構建CIRI大鼠模型。術前禁食不禁水12h，各給藥組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，以仰臥位固定于手術臺，沿頸部正中間切口并進行鈍性肌肉分離，暴露出頸總動脈（commoncarotidartery，CCA），然后小心分離出右側頸內動脈（internalcarotidartery，ICA）和頸外動脈（externalcarotidartery，ECA），結扎CCA近心端和ECA，將尼龍線栓由CCA的剪口處插入ICA，緩慢向前推進約20mm，使尼龍線末端位于大腦前動脈進而堵塞大腦中動脈；缺血2h后，緩慢勻速拔出尼龍線栓實現再灌注。假手術組大鼠進行相同的手術操作，但不插入線栓。再灌注24h后，采用Zea-Longa評分法對大鼠進行神經功能評分：無明顯的神經功能缺損癥狀為0分；提尾時向左側前肢屈曲為1分；不能直行，向左側行走為2分；行走困難，站立或爬行時向左側傾倒為3分；無法自主行走伴意識障礙為4分。1～3分為造模成功；0分為造模失?。辉u分為4分的大鼠容易死亡，予以剔除[12]。造模過程中，模型組大鼠死亡3只，銀杏葉提取物組死亡1只，心腦舒通低、高劑量組均死亡2只。評分完成后，麻醉大鼠，腹主動脈采血，血樣靜置1h后以3000r/min離心10min，吸取上清液，于－80℃冰箱中保存，備用。采血后，大鼠迅速斷頭取出腦組織，生理鹽水清洗2遍，濾紙拭干后于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠腦梗死面積檢測

取“2.2”項下各組4只大鼠的腦組織，去除腦干、小腦和嗅球后于－20℃冷凍20min；用手術刀片將腦組織沿冠狀面均勻切成5片（每片厚2mm），然后用2%TTC染液于37℃水浴條件避光染色15min，再以4%多聚甲醛固定后拍照，正常部位為紅色，梗死區(qū)為白色。將TTC染色圖片導入ImageJ軟件計算梗死面積，并計算腦梗死率，腦梗死率＝梗死面積/橫切總面積×100%。

2.4 大鼠腦組織病理學變化觀察

取“2.2”項下各組3只大鼠的腦組織適量，以4%多聚甲醛固定24h后進行石蠟包埋切片，將切片脫蠟后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，然后采用光學顯微鏡觀察大鼠腦組織病理學變化。

2.5 大鼠腦組織中總鐵水平和血清中LPO、MDA、GSH水平檢測

取“2.2”項下各組大鼠血清適量以及各組3只大鼠腦組織適量，根據ELISA試劑盒方法處理，檢測大鼠腦組織中總鐵水平和血清中LPO、MDA和GSH水平。

2.6 大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表達水平檢測

取“2.2”項下各組3只大鼠缺血側腦組織（假手術組對應側腦組織）適量，加入RIPA裂解液裂解，冷凍研磨儀中研磨后，以12000r/min離心10min，吸取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性處理后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再轉移至PVDF膜，以封閉液封閉1h，加入Nrf2、HO-1、GPX4、GAPDH一抗（稀釋度分別為1∶2000、1∶2000、1∶3000、1∶1000）于4℃下孵育過夜，再加入二抗（稀釋度為1∶5000）室溫孵育1h；在暗室中加入增強型化學發(fā)光液顯色成像，采用ImageJ圖像分析系統對蛋白條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與內參蛋白GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達水平檢測

取“2.2”項下各組3只大鼠缺血側腦組織（假手術組對應側腦組織）10mg，采用Trizol法提取總RNA，測定濃度和純度后，參照試劑盒說明書逆轉錄為cDNA進行PCR擴增。PCR體系（20μL）為：PCR試劑10μL，正、反向引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ROX試劑0.4μL，ddH2O7.6μL。PCR擴增條件為：95℃預變性2min；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸10s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔCt法進行數據分析，計算Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達水平。引物序列及產物大小見表1。

2.8 統計學分析

采用SPSS軟件和GraphPadPrism軟件分別進行數據分析及作圖。計量資料x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 心腦舒通膠囊對大鼠腦梗死面積的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織出現明顯的腦梗死現象，腦梗死率為（29.10±5.94）%。與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通低、高劑量組大鼠腦梗死率[分別為（20.18±3.54）%、（20.04±3.2）%、（22.01±5.22）%]均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1。

3.2 心腦舒通膠囊對大鼠腦組織病理損傷的影響

由圖2可見，假手術組大鼠神經細胞核膜清晰完整，排列正常有序。與假手術組比較，模型組大鼠缺血核心區(qū)腦組織神經細胞呈空泡樣改變，出現大片壞死細胞，神經細胞數目減少且排列紊亂，間質水腫，細胞核固縮。銀杏葉提取物組和心腦舒通低、高劑量組大鼠的腦組織病理損傷均有不同程度減輕，神經細胞數目增多，水腫減輕，核膜平整。

3.3 心腦舒通膠囊對大鼠腦組織及血清中生化指標的影響

與假手術組[總鐵水平（2.35±0.13）μg/g]比較，模型組大鼠腦組織中總鐵水平[（3.32±0.36）μg/g]和血清中LPO、MDA水平均顯著升高（P＜0.01），GSH水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通低、高劑量組大鼠腦組織中總鐵水平[（2.64±0.42）、（2.49±0.20）、（2.64±0.26）μg/g]均顯著降低（P＜0.05），血清中GSH水平均顯著升高（P＜0.05）；心腦舒通高劑量組大鼠血清中LPO顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

3.4 心腦舒通膠囊對大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通各劑量組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖3。

3.5 心腦舒通膠囊對大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通各劑量組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

4 討論

腦卒中可分為缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中在全部腦卒中所占的比例最大，呈逐步年輕化趨勢[13]。應對缺血性卒中最主要的方法就是血管重建和限制繼發(fā)性神經細胞損傷，臨床上常運用溶栓方法恢復缺血腦組織血流，但是只有很少一部分患者能夠在有效的時間窗內接受治療，且溶栓后患者還會遭受CIRI，因此深入研究CIRI的發(fā)病機制，探索有效的防治措施來減輕CIRI尤為重要。研究表明，CIRI發(fā)生機制主要與炎癥反應、氧化應激、血腦屏障功能障礙有關，常伴隨著凋亡、焦亡、壞死等多種細胞死亡形式[14]。鐵死亡是由于細胞內鐵離子過載、脂質過氧化物過度積累引起的細胞破裂性死亡[15]，是近年來被發(fā)現的一種細胞新型死亡方式，抑制鐵死亡已成為心、腦等器官缺血再灌注損傷的防治策略[16]。

藥理實驗研究證實，心腦舒通膠囊具有提高耐缺氧能力、增強學習和記憶能力、抗炎、保護神經細胞、保護心肌、抗腦缺血等作用[17―19]。臨床上，心腦舒通膠囊對腦梗死等缺血性腦病有一定的療效，王豪杰等[20]對58例缺血性腦病患者進行研究，發(fā)現心腦舒通膠囊可顯著降低缺血性腦病患者頸動脈內中膜厚度和血清同型半胱氨酸水平，從而降低缺血性腦病發(fā)生風險。曾松等[21]對106例腦梗死患者進行研究，發(fā)現心腦舒通膠囊可促進腦梗死患者神經功能的恢復，效果顯著。

Nrf2是細胞內調節(jié)氧化應激的主要轉錄因子，也是鐵死亡過程中的關鍵負調節(jié)因子。在靜息細胞中，Nrf2與Kelch樣ECH關聯蛋白1（Kelch-likeECH-associatedprotein1，Keap1）相結合并存在細胞質內；當機體受到H2O2、MDA或某些疾病刺激時，激活的Nrf2與Keap1分離并轉移至細胞核，激活下游HO-1和GPX4等抗氧化基因的表達[22]。GPX4是一種GSH依賴性抗氧化酶，其可通過GSH的作用有效清除有毒的脂質過氧化物（如LPO等），從而抑制細胞氧化損傷[23]。本研究結果顯示，大鼠CIRI后神經功能變差，且腦梗死面積增大，腦組織發(fā)生顯著的病理學改變；腦組織中總鐵水平增加，血清中LPO、MDA水平升高，GSH水平降低；Nrf2、HO-1、GPX4等鐵死亡關鍵靶蛋白和mRNA表達水平均降低，這提示CIRI大鼠腦組織存在鐵死亡現象。經心腦舒通膠囊干預后，大鼠腦梗死面積減小，神經功能和腦組織病理損傷改善，血清中GSH水平升高，LPO水平降低，腦組織中總鐵水平降低，腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白和mRNA表達水平均升高，這提示心腦舒通膠囊能夠抑制CIRI后鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，心腦舒通膠囊可抑制鐵死亡，減輕CIRI，其作用機制可能與激活Nrf2/HO-1/GPX4信號通路有關。