活性氧響應(yīng)型甲氨蝶呤修飾紫杉醇/淫羊藿苷膠束的工藝優(yōu)化與體外抗腫瘤作用評(píng)價(jià)

關(guān)鍵詞活性氧響應(yīng)型膠束；甲氨蝶呤；靶向藥物遞送；紫杉醇；淫羊藿苷

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一種廣泛使用的抗腫瘤藥物，主要通過(guò)穩(wěn)定微管、抑制細(xì)胞分裂來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；但PTX存在水溶性低、毒性強(qiáng)、多藥耐藥性突出等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用受限[1]。淫羊藿苷（icariin，ICA）是一種從傳統(tǒng)中藥淫羊藿中提取的黃酮類化合物，具有顯著的抗腫瘤、抗炎和抗氧化活性[2]。研究表明，ICA不僅能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，還能夠增強(qiáng)化療藥物的療效[3]。然而，ICA的臨床應(yīng)用面臨著水溶性差和靶向性不足等問(wèn)題。為了克服這些問(wèn)題，可考慮將ICA與其他抗腫瘤藥物（如PTX）聯(lián)合使用，并開(kāi)發(fā)合適的藥物遞送系統(tǒng)，以共同改善ICA和PTX的水溶性、靶向性及生物利用度[4]。

腫瘤細(xì)胞代謝異常和快速增殖導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）水平較高，因此ROS響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)能夠在腫瘤部位選擇性釋放藥物，從而提高療效并減少對(duì)正常組織的損傷[5―6]。ROS響應(yīng)鍵——酮縮硫醇鍵（thioketal，TK）能夠在高ROS水平環(huán)境下被氧化從而斷裂，被廣泛用于設(shè)計(jì)ROS響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)。含有TK的藥物載體可以在腫瘤部位選擇性地裂解，從而實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送，減毒增效[7―8]。此外，甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）可以通過(guò)葉酸受體介導(dǎo)的途徑顯著增強(qiáng)藥物的腫瘤靶向性，從而減少對(duì)正常組織的影響[9―10]。

基于上述背景，本研究制備了一種ROS響應(yīng)型MTX修飾PTX/ICA膠束（MTX-oxi-Ms@PTX/ICA）。該膠束利用疏水核心包載水溶性較差的PTX和ICA；膠束的最外層由聚乙二醇5000（PEG5000）形成水化層，隱藏主動(dòng)靶向配體MTX，以減少正常細(xì)胞對(duì)膠束的攝取并減輕不良反應(yīng)。本研究通過(guò)協(xié)同實(shí)驗(yàn)確定兩藥的最優(yōu)配比，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化制劑工藝，對(duì)MTX-oxi-Ms@PTX/ICA進(jìn)行表征，并考察了其體外靶向性以及體外抗腫瘤作用，旨在為抗腫瘤制劑的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

FA1004型電子天平購(gòu)自上海越平科學(xué)儀器有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；KQ3200E型超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；JY92-2D型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；2010型高效液相色譜（HPLC）儀（包含紫外檢測(cè)器）購(gòu)自日本Shimadzu公司；LITESIZER500型納米粒度及Zeta電位分析儀購(gòu)自英國(guó)Malvern公司；CKX53型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；CLARIOstar型全波長(zhǎng)熒光掃描酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)BMGLabtech公司；HBS-1096A型酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

PTX對(duì)照品（批號(hào)D1205C，純度≥98%）、ICA對(duì)照品（批號(hào)J0703A，純度≥98%）、香豆素（coumarin，Cou）原料藥（批號(hào)C104161）、4′，6-雙脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號(hào)D489987）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus?，批號(hào)50477909）購(gòu)自德國(guó)BASFSE公司；維生素E琥珀酸酯聚乙二醇1000（TPGS1000，批號(hào)MB3962）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-甲氨蝶呤（DSPEPEG2000-MTX，批號(hào)R-EL-090）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-酮縮硫醇-聚乙二醇5000（DSPEPEG2000-TK-PEG5000，批號(hào)R-EL-089）均購(gòu)自西安瑞禧生物科技有限公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)CA1210）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)11995）、1640培養(yǎng)基（批號(hào)90023）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)P903593，pH7.4）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其余常見(jiàn)溶劑均為色譜級(jí)純度。

1.3 細(xì)胞

小鼠腎癌細(xì)胞RENCA購(gòu)自億奧邦（北京）生物科技研究有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 PTX/ICA協(xié)同毒性實(shí)驗(yàn)的濃度篩選與分析

為了評(píng)估PTX和ICA的協(xié)同毒性，將RENCA細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，并在細(xì)胞貼壁后向細(xì)胞孔中加入不同濃度的PTX和ICA溶液。PTX的終濃度分別設(shè)置為0、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、15.00μmol/L，ICA的終濃度分別設(shè)置為0、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00μmol/L。根據(jù)上述濃度范圍，形成不同的PTX和ICA濃度組合，每個(gè)組合設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，每孔加入10%CCK-8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1～4h。采用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔光密度（OD）值。采用在線SynergyFinder軟件（https：//synergyfinder.fimm.fi）計(jì)算藥物協(xié)同評(píng)分（ZIPSynergyscore）。ZIPSynergyscore＞0分被認(rèn)為具有協(xié)同作用，＞10分被認(rèn)為具有強(qiáng)協(xié)同作用[11]。結(jié)果表明，在協(xié)同毒性實(shí)驗(yàn)中，PTX/ICA組合在抑制RENCA細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)出了高度的協(xié)同效應(yīng)（ZIPSynergyscore＞10分），相較于單獨(dú)用藥，聯(lián)合應(yīng)用顯著增強(qiáng)了對(duì)RENCA細(xì)胞的殺傷作用。當(dāng)PTX濃度在2.5～10μmol/L區(qū)間、ICA濃度在5～15μmol/L區(qū)間時(shí)，表現(xiàn)出最強(qiáng)的協(xié)同毒性。

2.2 MTX-oxi-Ms@PTX/ICA膠束的制備

采用薄膜水合法制備膠束。精密稱取處方量的DSPE-PEG2000-MTX、DSPE-PEG2000-TK-PEG5000、Soluplus?、TPGS1000、PTX、ICA于圓底燒瓶中，加甲醇溶解，減壓除去溶劑，此時(shí)圓底燒瓶?jī)?nèi)壁形成一層均勻的薄膜；向燒瓶中加入PBS，超聲振蕩使薄膜溶在PBS中；靜置，待溶液透明后，用0.22μm聚碳酸酯膜擠壓2次，即得MTX-oxi-Ms@PTX/ICA。

采用相同方法制備不加DSPE-PEG2000-TKPEG5000的MTX修飾的PTX/ICA膠束（MTXMs@PTX/ICA）、不加DSPE-PEG2000-MTX和DSPEPEG2000-TK-PEG5000的PTX/ICA膠束（Ms@PTX/ICA）、不加PTX和ICA的空白膠束（Blank-Ms）。

2.3 MTX-oxi-Ms@PTX/ICA工藝優(yōu)選

2.3.1 色譜條件

參考文獻(xiàn)[12―13]設(shè)置本研究中HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為AgilentC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流速為1.0mL/min，柱溫為27℃；PTX以乙腈-甲醇-水（42∶28∶30，V/V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm；ICA以乙腈-水（25∶75，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm；進(jìn)樣量為20μL。

2.3.2 包封率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行包封率測(cè)定。取0.5mL膠束溶液至5mL容量瓶中，以甲醇定容，過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，得過(guò)柱前溶液；取0.5mL膠束溶液至葡聚糖凝膠柱頂部，加入0.5mLPBS洗脫2次，合并洗脫液，以甲醇定容至5mL，過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，得過(guò)柱后溶液。采用HPLC法測(cè)定藥物含量，并參照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）相關(guān)通則要求進(jìn)行含量測(cè)定方法學(xué)考察?？疾旆弦蠛?，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄過(guò)柱前后溶液中PTX和ICA含量，根據(jù)下式計(jì)算膠束中PTX和ICA的包封率：PTX包封率（%）＝膠束中PTX的質(zhì)量/總PTX的質(zhì)量×100%，ICA包封率（%）＝膠束中ICA的質(zhì)量/總ICA的質(zhì)量×100%。

2.3.3 工藝優(yōu)化

本研究在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定以Soluplus?質(zhì)量（X1）、Soluplus?與TPGS1000的質(zhì)量比（X2，mg/mg）、水合溫度（X3）為考察因素，以PTX和ICA包封率的綜合評(píng)分Y[Y（%）＝PTX包封率×0.5+ICA包封率×0.5]為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。因素與水平表見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design-Expert8.0.6.1軟件，根據(jù)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次項(xiàng)擬合，得到擬合方程為Y＝91.61+0.042X1+9.43X2－5.42X3－15.62X1X2+2.24X1X3－12.86X2X3－12.36X12－14.44X22－28.03X32（R2＝0.9751，P＜0.05）。方差分析結(jié)果（表3）顯示，所建模型具有極高的顯著性（P＜0.01），而失擬項(xiàng)的P＞0.05，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖嚓P(guān)系數(shù)為0.9430。這提示該模型能較好地反映出響應(yīng)值的變化，可用于篩選MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的最優(yōu)工藝。

由表3可知，因素X1對(duì)Y無(wú)顯著影響（P＞0.05），因素X3對(duì)Y影響顯著（P＜0.05），因素X2、X1X2、X2X3、X12、X22、X32對(duì)Y有極顯著影響（P＜0.01）。通過(guò)Design-Expert8.0.6.1軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行效應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)圖1結(jié)果，再結(jié)合膠束制備經(jīng)驗(yàn)及膠束制備的實(shí)際情況，最終確定MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的最優(yōu)工藝如下：X1為80mg，X2為4∶1，X3為35℃，DSPE-PEG2000-TK-PEG5000為2mg，DSPE-PEG2000-MTX為2mg，PTX為1mg，ICA為1.5mg，超聲功率為500W，處方量為5mL。

2.3.4 工藝驗(yàn)證

根據(jù)最優(yōu)工藝制備3批MTX-oxi-Ms@PTX/ICA。結(jié)果顯示，3批MTX-oxi-Ms@PTX/ICA中2個(gè)藥的總包封率分別為92.36%、92.01%、93.88%，平均為92.75%，與預(yù)測(cè)值（93.90%）相近，表明所建模型具有良好的預(yù)測(cè)性，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定性與重現(xiàn)性良好。

2.4 MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的表征

2.4.1 臨界膠束濃度

采用芘作為熒光探針進(jìn)行臨界膠束濃度（criticalmicelleconcentration，CMC）測(cè)定[15]。將MTX-oxi-Ms@PTX/ICA稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/mL），然后向每個(gè)樣品中加入終濃度為6×10－7mol/L的芘，將混合物在室溫下避光孵育12h，使芘嵌入膠束的疏水核中。記錄激發(fā)波長(zhǎng)340nm和發(fā)射波長(zhǎng)300～400nm下的熒光光譜圖，并計(jì)算CMC。結(jié)果，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的CMC為0.0079mg/mL，明顯低于血液中膠束的降解濃度（約0.5mg/mL）[16]。

2.4.2 粒徑、多分散性指數(shù)和Zeta電位

使用納米粒度及Zeta電位分析儀測(cè)定MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的粒徑、多分散性指數(shù)（polydispersityindex，PDI）和Zeta電位。為進(jìn)一步評(píng)估膠束在氧化環(huán)境中的響應(yīng)性，向MTX-oxi-Ms@PTX/ICA溶液中添加0.1mmol/L的H2O2，并在37℃下孵育2h，隨后測(cè)定膠束的粒徑、PDI和Zeta電位。另外，將MTX-oxi-Ms@PTX/ICA儲(chǔ)存于4℃環(huán)境中，分別于0、10、20、30d時(shí)取樣，測(cè)定其粒徑和PDI的變化情況，評(píng)價(jià)膠束的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

結(jié)果顯示，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的粒徑為（62.09±1.68）nm；加入H2O2后，粒徑收縮至（57.78±2.14）nm。其Zeta電位為（－2.47±0.15）mV，加入H2O2后升高至（－1.60±0.10）mV。其PDI較小（0.046±0.032），表明膠束分布均一；加入H2O2后PDI略增大，但仍低于0.30。

MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在10、20和30d時(shí)的粒徑分別為（62.39±1.00）、（62.68±0.91）和（63.06±0.53）nm，相應(yīng)的PDI分別為0.071±0.031、0.069±0.034和0.070±0.023。這表明在30d內(nèi)膠束未發(fā)生明顯的聚集或沉淀，顯示出良好的穩(wěn)定性。

2.5 膠束的體外釋放特點(diǎn)考察

采用透析袋法研究膠束在2種釋放介質(zhì)中的體外釋放行為。釋放介質(zhì)1為含5%吐溫80的PBS，釋放介質(zhì)2為含5%吐溫80和1mmol/LH2O2的PBS。將1mLPTX/ICA游離藥溶液（含0.2mgPTX、0.3mgICA的甲醇溶液）和按最優(yōu)工藝制備的Ms@PTX/ICA、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA分別裝入分子截留量為8～14kDa的透析袋，浸入20mL釋放介質(zhì)1中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速100r/min條件下振蕩。同法將MTX-oxi-Ms@PTX/ICA裝入透析袋并置于釋放介質(zhì)2中，以評(píng)估其在氧化環(huán)境中的響應(yīng)性。分別在4、8、12、24、48h時(shí)采集0.5mL釋放介質(zhì)樣品（每次取樣后補(bǔ)充等體積新鮮介質(zhì)），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)取樣3次。利用HPLC法分別測(cè)定各樣品中PTX、ICA含量，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的藥物釋放率[釋放率（%）＝釋放的藥物量/總藥量×100%]，并繪制體外釋放曲線（圖2）。

結(jié)果顯示，PTX/ICA游離藥溶液在48h內(nèi)釋放了（92.66±2.87）%的PTX和（92.86±2.50）%的ICA，呈現(xiàn)出初期的突釋現(xiàn)象。48h內(nèi)，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在釋放介質(zhì)1中釋放了（61.46±3.91）%的PTX和（65.55±3.40）%的ICA，而在釋放介質(zhì)2中釋放了（90.51±4.07）%的PTX和（88.75±2.22）%的ICA，表現(xiàn)出顯著的釋放增強(qiáng)現(xiàn)象。

2.6 膠束的體外靶向性評(píng)價(jià)

2.6.1 熒光顯微鏡觀察膠束體外攝取情況

由于PTX和ICA不具有熒光，因此本研究選用具有綠色熒光信號(hào)的Cou代替藥物，按“2.2”項(xiàng)下方法制備各熒光探針膠束，以此來(lái)評(píng)價(jià)膠束的體外細(xì)胞攝取情況。將RENCA細(xì)胞按1.6×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，孵育24h。隨后，細(xì)胞被分為Blank-Ms組、Cou組、Ms@Cou組、MTX-Ms@Cou組、MTX-oxi-Ms@Cou組以及MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2組（經(jīng)0.1mmol/LH2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[16]，下同）。各藥物組中Cou的終濃度均控制在3μmol/L[15]，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入各膠束后繼續(xù)孵育2h，加入DAPI室溫避光染色15min，利用熒光顯微鏡觀察并拍照。采用ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度。使用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和Scheffé檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果見(jiàn)圖3。

結(jié)果顯示，Blank-Ms組細(xì)胞未觀察到綠色熒光信號(hào)，其余各組細(xì)胞均觀察到不同程度的熒光信號(hào)。其中，Cou組熒光強(qiáng)度（48192.00±11096.84）最低；Ms@Cou組熒光強(qiáng)度（175941.33±10509.75）較Cou組顯著升高（P＜0.05）；MTX-Ms@Cou組熒光強(qiáng)度（220732.33±23304.96）進(jìn)一步高于Ms@Cou組（P＜0.05）；MTX-oxi-Ms@Cou組熒光強(qiáng)度（179027.00±6403.55）則較MTXMs@Cou組顯著降低（P＜0.05）。此外，MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2組熒光強(qiáng)度（221047.33±12576.07）顯著高于MTX-oxi-Ms@Cou組（P＜0.05），但與MTXMs@Cou組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6.2 流式細(xì)胞術(shù)考察膠束體外攝取情況

細(xì)胞分組、培養(yǎng)、給藥同“2.6.1”項(xiàng)下。將RENCA細(xì)胞在含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h后，用冷PBS洗滌3次，隨后，消化細(xì)胞并用0.3mLPBS重懸。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定與細(xì)胞結(jié)合的Cou的熒光強(qiáng)度。按“2.6.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果顯示，Blank-Ms組的熒光強(qiáng)度（8.60±1.67）最低，Cou組熒光強(qiáng)度升高至553.00±37.80，而Ms@Cou組進(jìn)一步升高至635.33±8.50。在MTX修飾后，MTXMs@Cou組的熒光強(qiáng)度達(dá)到702.33±12.42，顯著高于Ms@Cou組（P＜0.05）。MTX-oxi-Ms@Cou組的熒光強(qiáng)度為661.33±12.86。MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2組的熒光強(qiáng)度（741.00±25.24）顯著高于MTX-oxi-Ms@Cou組（P＜0.01），且與MTX-Ms@Cou組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了MTX-Ms@Cou在RENCA細(xì)胞中表現(xiàn)出更好的穿透性，藥物更容易在給藥部位蓄積。

2.7 膠束對(duì)RENCA細(xì)胞存活率的影響

采用CCK-8法測(cè)定。按2×104個(gè)/孔的密度將RENCA細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加入不同濃度的Blank-Ms（空白對(duì)照）和Ms@PTX/ICA、MTX-Ms@PTX/ICA、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA以及MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2（總藥物終濃度均設(shè)置為0.032、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；并以DMEM培養(yǎng)基為空白對(duì)照。加入各膠束，繼續(xù)培養(yǎng)48h后棄培養(yǎng)液，向各孔中加入含10%CCK-8的培養(yǎng)液100μL，繼續(xù)孵育2h，于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（％）＝Ax/Ay×100％；式中，Ax為給藥孔細(xì)胞的A，Ay為空白對(duì)照孔細(xì)胞的A]，并計(jì)算各樣品對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）。結(jié)果顯示，Ms@PTX/ICA、MTX-Ms@PTX/ICA、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA和MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2對(duì)細(xì)胞的IC50依次為（5.990±0.032）、（3.990±0.036）、（5.170±0.036）、（2.930±0.042）μmol/L。

2.8 膠束對(duì)RENCA細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.8.1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將Transwell小室置于24孔板中，用無(wú)血清1640培養(yǎng)基重懸RENCA細(xì)胞，以1.5×103個(gè)/孔的密度接種于小室上腔室；同時(shí)，在下腔室中加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為Blank-Ms組（空白對(duì)照組）、Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組和MTXoxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組（給藥組的總藥物終濃度均為20.00μmol/L）。將對(duì)應(yīng)膠束加入各組小室的上腔室后，于37℃孵育12h。取出小室，用PBS清洗3次，并用棉簽刮除未通過(guò)膜的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定通過(guò)膜遷移的細(xì)胞30min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液在室溫下染色20min。用PBS清洗染液，晾干后在顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)算遷移細(xì)胞的平均數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按“2.6.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見(jiàn)圖4、表4。結(jié)果顯示，與Blank-Ms組相比，Ms@PTX/ICA組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與Ms@PTX/ICA組比較，MTXoxi-Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組遷移細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少（P＜0.05），但MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組與MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.8.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠（5μmol/L）在冰上融化，吸取30μL加入到Transwell小室上腔室，在37℃下孵育1h；在下腔室中加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。用無(wú)血清培養(yǎng)基將RENCA細(xì)胞重懸，并以5×104個(gè)/孔的密度接種于小室上腔室。實(shí)驗(yàn)分組、給藥、培養(yǎng)同“2.8.1”項(xiàng)下。將小室置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h。用棉簽輕輕擦拭上腔室，去除未侵襲的細(xì)胞。隨后，將小室置于4%多聚甲醛中固定20min，并用PBS清洗2次。用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min，再用PBS清洗多余染液。晾干后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過(guò)基質(zhì)膠到達(dá)下腔室的細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按“2.6.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見(jiàn)表4、圖5。結(jié)果顯示，與Blank-Ms組相比，Ms@PTX/ICA組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與Ms@PTX/ICA組相比，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組侵襲細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少（P＜0.05），但MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組與MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.8.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將RENCA細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層。用劃痕器在細(xì)胞層中央劃出一條直線形成劃痕模型，用PBS清洗2次，去除細(xì)胞碎片。實(shí)驗(yàn)分組、給藥、培養(yǎng)同“2.8.1”項(xiàng)下。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中，分別在0、12、24h時(shí)用倒置顯微鏡拍攝劃痕區(qū)域的圖片，記錄細(xì)胞愈合過(guò)程。使用ImageJ軟件分析并量化劃痕區(qū)域的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移的距離和速度，并計(jì)算各組細(xì)胞的劃痕愈合率[劃痕愈合率（%）＝（初始劃痕寬度－特定時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%]。按“2.6.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4、圖6。結(jié)果顯示，與Blank-Ms組比較，Ms@PTX/ICA組細(xì)胞在12、24h后的劃痕愈合率均顯著降低（P＜0.05）；與Ms@PTX/ICA組比較，MTXoxi-Ms@PTX/ICA組、MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組細(xì)胞在12、24h后的劃痕愈合率進(jìn)一步降低（P＜0.05），且MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2組顯著低于MTX-oxi-Ms@PTX/ICA組（P＜0.05）。

3 討論

在腫瘤治療領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)高效且具有特異性的藥物遞送系統(tǒng)一直是研究的熱點(diǎn)與挑戰(zhàn)。本研究聚焦于提高PTX和ICA在腫瘤防治中的應(yīng)用效能，通過(guò)協(xié)同毒性實(shí)驗(yàn)探究了2種藥物抑制腎癌細(xì)胞增殖的協(xié)同效果。結(jié)果表明，在特定濃度范圍內(nèi)，PTX與ICA的聯(lián)合使用能夠在低于單一藥物最大有效濃度的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞更有效的抑制，這可能源于它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)作用機(jī)制的互補(bǔ)性。這一協(xié)同作用的發(fā)現(xiàn)不僅為藥物劑量的優(yōu)化提供了科學(xué)指導(dǎo)，而且為臨床治療提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究創(chuàng)新性地制備了MTX-oxi-Ms@PTX/ICA膠束，并優(yōu)化了膠束的最優(yōu)制備工藝，在最優(yōu)工藝條件下制備的膠束中PTX和ICA的包封率均超過(guò)90%，表明該制劑能夠高效地包裹并保護(hù)活性藥物成分，有助于減少藥物在儲(chǔ)存和體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中的泄漏，從而維持藥物的穩(wěn)定性并提高其生物利用度。此外，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的CMC為0.0079mg/mL，表明該膠束具有較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，能夠在體內(nèi)避免因血液稀釋而導(dǎo)致的膠束解聚[16]。在體內(nèi)血液循環(huán)過(guò)程中，膠束不可避免地會(huì)被血液稀釋，而低CMC的膠束能夠有效抵抗這種稀釋作用，防止膠束解聚，從而確保藥物能夠穩(wěn)定存在并精準(zhǔn)地靶向遞送至腫瘤部位。這一特性對(duì)于提高藥物在腫瘤組織中的濃度，減少對(duì)正常組織的毒副作用具有關(guān)鍵意義。

粒徑、PDI以及Zeta電位的測(cè)定結(jié)果表明，MTXoxi-Ms@PTX/ICA在水溶液中呈現(xiàn)穩(wěn)定的分散狀態(tài)。這有利于膠束在體內(nèi)的循環(huán)與分布，使其能夠更好地穿越生理屏障，抵達(dá)腫瘤組織。此外，本研究所制膠束的粒徑大小處于納米級(jí)別，這有助于膠束通過(guò)增強(qiáng)的滲透與滯留效應(yīng)被動(dòng)靶向腫瘤組織。30d的穩(wěn)定性測(cè)試實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該膠束優(yōu)異的物理穩(wěn)定性，這為其長(zhǎng)期儲(chǔ)存和臨床應(yīng)用提供了可能。值得注意的是，加入H2O2后，ROS敏感鍵斷裂，最外層PEG5000脫落，表現(xiàn)為粒徑尺寸收縮。這一現(xiàn)象揭示了膠束的氧化敏感特性。在腫瘤微環(huán)境中，由于存在較高水平的ROS，這種氧化敏感特性能夠觸發(fā)膠束結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而促進(jìn)藥物的釋放。這與腫瘤組織的特殊微環(huán)境相契合，腫瘤細(xì)胞在快速增殖過(guò)程中往往伴隨著氧化應(yīng)激水平的升高，使得膠束能夠在腫瘤部位特異性地釋放藥物，提高治療效果并減少對(duì)正常組織的毒性。

本研究通過(guò)透析袋法對(duì)MTX-oxi-Ms@PTX/ICA的體外釋放行為進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模擬了2種不同的生理環(huán)境：一種是接近生理?xiàng)l件的釋放介質(zhì)1（含5%吐溫80的PBS），另一種是模擬腫瘤微環(huán)境中氧化應(yīng)激條件的釋放介質(zhì)2（含5%吐溫80和1mmol/LH2O2的PBS）。MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在釋放介質(zhì)1中表現(xiàn)出較為緩和的藥物釋放特性，這可能歸因于膠束在模擬生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性。然而，在釋放介質(zhì)2中，膠束的釋放行為顯著增強(qiáng)，這種氧化敏感性觸發(fā)了膠束結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致藥物的快速釋放，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效殺傷。

RENCA細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MTX修飾顯著增強(qiáng)了膠束的抗腫瘤活性。MTX作為一種靶向配體，能夠與腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的葉酸受體特異性結(jié)合，從而提高膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，使更多的藥物能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮殺傷作用。此外，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA+H2O2對(duì)細(xì)胞的IC50低于MTX-oxi-Ms@PTX/ICA，這進(jìn)一步證實(shí)了MTX-oxi-Ms@PTX/ICA具有ROS響應(yīng)能力。在氧化應(yīng)激條件下，膠束的外層水化層脫落，暴露出的靶向配體增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)膠束的攝取能力，同時(shí)也促進(jìn)了藥物的釋放，協(xié)同增強(qiáng)了抗腫瘤效果。體外攝取實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了與非靶向膠束Ms@PTX/ICA相比，MTX修飾的膠束MTX-Ms@PTX/ICA在RENCA細(xì)胞中的攝取量顯著增加，表明MTX修飾提高了膠束對(duì)癌細(xì)胞的靶向效果。此外，細(xì)胞對(duì)MTX-oxi-Ms@Cou+H2O2的攝取效率高于MTX-oxi-Ms@Cou，再次驗(yàn)證了ROS響應(yīng)特性在增強(qiáng)膠束靶向性和藥物釋放中的重要性。這一系列結(jié)果表明，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA通過(guò)整合靶向性、氧化敏感性和納米載體的優(yōu)勢(shì)，有望提高腫瘤治療的精準(zhǔn)性和有效性。

細(xì)胞遷移和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高ROS水平下，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA抑制RENCA細(xì)胞侵襲、遷移的能力變強(qiáng)。這一結(jié)果不僅證明了MTX-oxi-Ms@PTX/ICA能夠在高ROS環(huán)境下實(shí)現(xiàn)藥物的響應(yīng)釋放，更重要的是揭示了其在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面的潛力。本研究制備的膠束能夠在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)，有效抑制其侵襲、遷移，為腫瘤的綜合治療提供了新的思路。

綜上所述，MTX-oxi-Ms@PTX/ICA在提高藥物穩(wěn)定性、增強(qiáng)對(duì)RENCA細(xì)胞靶向性和抑制腫瘤侵襲、遷移等方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，這為腫瘤靶向治療提供了新的研究思路。本課題組后續(xù)將深入研究該膠束在動(dòng)物模型中的體內(nèi)靶向性及抗腫瘤作用機(jī)制，并進(jìn)一步評(píng)估其在臨床應(yīng)用中的可行性和安全性。