T-ALL來源的骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過FGF2-FGFR2通路促進(jìn)T-ALL增殖

摘要：目的探究骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BM-MSCs）對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）影響的作用機(jī)制，尋找靶向BM-MSCs的有效治療策略。方法構(gòu)建Notch-1過表達(dá)誘導(dǎo)的T-ALL小鼠模型，分選T-ALL中BM-MSCs，與T-ALL細(xì)胞系建立體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，檢測(cè)共培養(yǎng)后T-ALL增殖能力變化。運(yùn)用RNA測(cè)序技術(shù)尋找不同來源MSCs的差異表達(dá)基因，并用PCR驗(yàn)證。在小鼠體內(nèi)注射BGJ398，檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果與T-ALL來源的MSCs共培養(yǎng)后，T-ALL細(xì)胞的增殖能力顯著增加。RNA測(cè)序結(jié)果顯示，T-ALL來源的MSCs成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）分泌增加，與T-ALL細(xì)胞上的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2受體（FGFR2）結(jié)合可激活T-ALL細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。加入BGJ398阻斷FGF2和FGFR2之間的相互作用可以抑制小鼠T-ALL腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)論BM-MSCs可通過FGF2/FGFR2通路促進(jìn)T-ALL腫瘤生長(zhǎng)，阻斷FGF2/FGFR2通路是克服BM-MSCs介導(dǎo)T-ALL進(jìn)展的有效策略。

關(guān)鍵詞：前體細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病淋巴瘤；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2；細(xì)胞增殖；骨髓基質(zhì)細(xì)胞；BGJ398中圖分類號(hào)：R733.71文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240355

T-ALL derived bone marrow stromal stem cells promote T-ALL proliferation through"he FGF2-FGFR2 pathway

YANG Jian1，LI Min2，LI Yueyang2，TIAN Chen2△

1 Department of Surgical Oncology，Qingdao Central Cancer Hospital，Qingdao 266042，China;2 Department of Hematology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin Clinical Research Center for Cancer

△Corresponding Author E-mail：tianchen@tjmuch.com

Abstract：Objective To elucidate the mechanistic role of bone marrow mesenchymal stromal cells（BM-MSCs）in T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL），and to find effective therapeutic strategies targeting BM-MSCs.Methods A T-ALL mouse model induced by Notch-1 overexpression was constructed.An in vitro co-culture system was established to investigate the proliferative capacity of T-ALL cells upon co-culturing with leukemia-derived MSCs.RNA sequencing was performed to identify key differentially expressed genes，which were further validated by PCR.BGJ398 was injected into mice to detect tumor growth.Results Co-culturing with T-ALL-derived MSCs resulted in a significant increase in T-ALL cell proliferation.RNA sequencing results revealed that the secretion of fibroblast growth factor 2（FGF2）from T-ALL-derived MSCs was increased，which binds to fibroblast growth factor 2 receptor（FGFR2）on T-ALL cells，activating the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.Blocking the interaction between FGF2 and FGFR2 using BGJ398 inhibited the growth of T-ALL tumors in mice.Conclusion BM-MSCs can promote T-ALL tumor growth through FGF2/FGFR2 pathway，and blocking FGF2/FGFR2 pathway is an effective strategy to overcome BM-MSCS-mediated T-ALL progression.

Key words：precursor cell lymphoblastic leukemia-lymphoma;fibroblast growth factor 2;cell proliferation;bone marrow mesenchymal stromal cells;BGJ398

急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-cell acute lymphoblastic leukaemia，T-ALL）是一種極具異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。白血病細(xì)胞破壞正常骨髓（bone marrow，BM）微環(huán)境，將其轉(zhuǎn)化為異常的生態(tài)位，誘導(dǎo)微環(huán)境中的細(xì)胞群發(fā)生變化［2］。在這一過程中，微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BM-MSCs）為白血病細(xì)胞提供了庇護(hù)所，進(jìn)一步加速了T-ALL的進(jìn)展［3-4］。因此，深入了解白血病細(xì)胞與BM-MSCs間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用，并據(jù)此探尋新的治療靶點(diǎn)，對(duì)T-ALL的治療具有實(shí)踐意義。研究發(fā)現(xiàn)，在急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukaemia，B-ALL）中，BM-MSCs通過直接接觸的方式促進(jìn)B-ALL細(xì)胞的存活和增殖［5］。在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中，白血病細(xì)胞與BM-MSCs的緊密接觸能夠抑制藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［6］。盡管已有研究報(bào)道BM-MSCs介導(dǎo)的保護(hù)作用涉及可溶性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞相互作用分子等多種機(jī)制［7-8］，但BM-MSCs在T-ALL中的支持作用機(jī)制仍需深入探索。因此，本研究旨在揭示BM-MSCs對(duì)T-ALL細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為T-ALL的治療尋找新的治療策略。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及培養(yǎng)T-ALL細(xì)胞系Jurkat、人骨髓基質(zhì)細(xì)胞系HS-5、人胚胎腎細(xì)胞HEK293T均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所程濤教授課題組贈(zèng)送。Jurkat細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HS-5和HEK293T在添加10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司。FBS購自ZETA公司。慢病毒載體MSCV-ICN1-IRES-GFP購自優(yōu)寶生物公司。外周血淋巴細(xì)胞分離液購自索萊寶公司。CD45磁珠、Lineage磁珠（Microbeads）、LS磁柱（MACS Separation Columns）購自美天旎公司。流式抗體FITC-CD31/CD44/CD45/TER119、FITC-F4/80、FITC-RatIgG2a/2b，κIsotype Ctrl、APC-SCA1、PE-CD51、V450-Lineage（CD3/B220/CD11b/Gr-1/TER119）、PE/Cy7-cKit購自BioLegend公司。PE-AnnexinV凋亡試劑盒、APC-BrdU增殖試劑盒購自BD公司。TRIzol試劑購自ambion公司。Prime Script RT Master Mix、TB Green Premix Ex Taq購自TAKARA公司。兔源磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）1+AKT2+AKT3、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體及各自磷酸化抗體，GAPDH抗體及羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司。慢病毒載體pLVX-FGF2-mcherry購自優(yōu)寶生物公司。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）抑制劑BGJ398（Infigratinib）購自Selleck公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6J（簡(jiǎn)稱C57）小鼠6只、B6.SJL（簡(jiǎn)稱B6）小鼠3只、NOD/SCID小鼠10只，6～8周齡，體質(zhì)量18～25 g，所有小鼠均為雌性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（津）2017―0005。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（倫理批號(hào)：DMZF-2021050）。

1.4 Notch-1誘導(dǎo)的T-ALL小鼠模型構(gòu)建將過表達(dá)Notch-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCV-ICN1-IRES-GFP轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)293T細(xì)胞48 h后收集富含病毒原液的上清液，感染B6小鼠的骨髓細(xì)胞，構(gòu)建Notch-1誘導(dǎo)的T-ALL細(xì)胞（即原代鼠T-ALL細(xì)胞），48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光評(píng)估感染情況［9］。構(gòu)建流程見圖1。將6只C57小鼠均分為T-ALL組（尾靜脈注射原代鼠T-ALL細(xì)胞，1×106/100μL）和Control組（未作特殊處理）。注射12 d后處死2組小鼠，分離脾臟并稱質(zhì)量，RT-PCR驗(yàn)證T-ALL組BM細(xì)胞中Notch-1基因胞內(nèi)段ICN1表達(dá)，倒置熒光顯微鏡觀察GFP+T-ALL細(xì)胞表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP+細(xì)胞中CD3的表達(dá)以評(píng)估T-ALL小鼠模型構(gòu)建情況。具體驗(yàn)證方法參考本課題組前期研究［9］。

1.5流式細(xì)胞術(shù)分選小鼠BM-MSCs用PBS沖洗Control組和T-ALL組C57小鼠的髂骨、股骨和脛骨骨髓腔獲得BM細(xì)胞。用Ficoll法從BM中分離單個(gè)核細(xì)胞，用CD45磁珠去除BM細(xì)胞中的造血細(xì)胞，再使用Lineage/CD31/F4/80抗體去除其余細(xì)胞，剩余的GFP-CD45-Lin-CD31-F4/80-細(xì)胞即為目的BM-MSCs。

1.6共培養(yǎng)體系分別將Control組和T-ALL組的BM-MSCs與原代鼠T-ALL細(xì)胞以數(shù)目1∶3的比例（3×105個(gè)BM-MSCs細(xì)胞）置于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h后分離出懸浮的原代鼠T-ALL細(xì)胞，然后進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。

1.6.1細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)在上述共培養(yǎng)后分離出的原代鼠T-ALL細(xì)胞中以10μL/mL的比例加入BrdU，孵育6 h后用抗BrdU偶聯(lián)抗體標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞增殖情況；以5μL/mL的比例加入AnnexinV、7-AAD，冰上避光孵育15 min，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.6.2 RT-PCR法檢測(cè)與細(xì)胞周期、凋亡及增殖相關(guān)基因的表達(dá)收集Control組與T-ALL組細(xì)胞后采用Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×Prime Script RT Master Mix 2μL，Total RNA 350 ng，RNase Free dH2O補(bǔ)至10μL；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃保存。RT-PCR反應(yīng)體系（20μL）：上、下游引物各0.8μL，2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，50×ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4μL，cDNA溶液2μL，滅菌水6μL。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)，保存數(shù)據(jù)后采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。所有引物序列見表1。

1.6.3 Western blot檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，再將凝膠上的蛋白樣本轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，剪膜后4℃孵育兔PI3K、AKT、mTOR、一抗（1∶1 000）過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，配置化學(xué)顯色試劑，化學(xué)發(fā)光儀自動(dòng)曝光。將GAPDH作為蛋白內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6.4 RNA測(cè)序分析TRIzol法提取Control組與T-ALL組BM-MSCs的總RNA后送往上海美吉生物公司（www.majorbio.com）進(jìn)行RNA測(cè)序。

1.7慢病毒感染法敲降T-ALL組BM-MSCs的FGF2基因表達(dá)用pLVX-FGF2-mcherry感染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集富含病毒原液的上清液。以1×106/孔的密度接種T-ALL組BM-MSCs于6孔板中，每孔加入2 mL病毒原液，并加入8 mg/L Polybrene，1 800 r/min離心90 min后棄去病毒原液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光以評(píng)估感染情況。

1.8皮下成瘤及給藥取雌性NOD/SCID小鼠10只，左腋下皮下接種3∶1混合的Jurkat與HS-5細(xì)胞混懸液（1×107/200μL）。保留6只腫瘤體積在100～150 mm3的小鼠，等比例分為BGJ398組及PBS組。BGJ398組每2 d腹腔注射25μL BGJ398（30 mg/kg），給藥7次；PBS組同期腹腔注射25μLPBS。待PBS組小鼠腫瘤體積達(dá)1 000 mm3后中止實(shí)驗(yàn)，剝除各組小鼠腫瘤并稱質(zhì)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 T-ALL小鼠模型的驗(yàn)證結(jié)果建模12 d后，T-ALL組C57小鼠脾臟較Control組明顯增大（圖2A），質(zhì)量（g）增加（0.9±0.1 vs.0.1±0.0，n=3，t=45.848，Plt;0.01），Notch-1胞內(nèi)段ICN1表達(dá)升高（3.8±0.3 vs.0.6±0.1，n=3，t=17.332，P＜0.01）。沖洗四肢骨留取骨髓液，在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)T-ALL小鼠的BM中GFP+細(xì)胞占90%以上（圖2B），T-ALL組小鼠GFP+細(xì)胞高表達(dá)CD3（圖2C、D），證實(shí)T-ALL小鼠模型構(gòu)建成功。

2.2 T-ALL來源的BM-MSCs促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的增殖見圖3。與T-ALL組BM-MSCs共培養(yǎng)的T-ALL細(xì)胞數(shù)目較與Control組共培養(yǎng)的增多（單位：105個(gè)；6.7±0.4 vs.4.0±0.2，n=3，t=12.100，P＜0.01），凋亡率降低（46.7%±6.1%vs.84.3%±7.0%，n=3，t=6.568，P＜0.01），S期細(xì)胞的比例顯著增加。

2.3 T-ALL來源的BM-MSCs異常激活FGF2/FGFR2通路RNA測(cè)序顯示，T-ALL組與Control組BM-MSCs之間有74個(gè)基因存在差異表達(dá)，包括23個(gè)上調(diào)基因和51個(gè)下調(diào)基因（設(shè)置差異倍數(shù)＞2，P＜0.01，圖4A）。74種基因中有6種與細(xì)胞周期、增殖和凋亡相關(guān)，具體為Csf2、Ctf1、Fgf2、Igf2、Hgf和Lif。PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與Control組相比，T-ALL組BM-MSCs中Fgf2表達(dá)顯著上調(diào)（圖4B），與T-ALL組BM-MSCs共培養(yǎng)的T-ALL細(xì)胞Fgfr2表達(dá)顯著上調(diào)（圖4C）。

2.4 FGF2/FGFR2激活T-ALL細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR通路Western-blot結(jié)果顯示，與T-ALL組BM-MSCs共培養(yǎng)后T-ALL細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)水平較Control組升高（圖5A），加入BGJ398或敲降BM-MSCs中FGF2基因后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖5B）。

2.5阻斷FGF2/FGFR2通路可抑制T-ALL小鼠腫瘤生長(zhǎng)阻斷FGF2/FGFR2通路后，BGJ398組小鼠腫瘤體積較PBS組明顯減小，質(zhì)量明顯下降（單位：g；0.02±0.01 vs.0.44±0.13，t=18.290，P＜0.01），見圖6。

3討論

成人T-ALL異質(zhì)性強(qiáng)，存在原發(fā)耐藥或經(jīng)治療后再次復(fù)發(fā)，導(dǎo)致療效及預(yù)后欠佳。既往研究發(fā)現(xiàn)，骨髓微環(huán)境為白血病細(xì)胞的增殖、存活及黏附提供了支持和保護(hù)，促進(jìn)了白血病的發(fā)生和發(fā)展［10-11］，其中BM-MSCs的作用尤為重要。Wang等［12］發(fā)現(xiàn)，黏附分子ICAM-1介導(dǎo)Jurkat細(xì)胞與BM-MSCs的黏附，促進(jìn)Jurkat細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)移至BM-MSCs內(nèi)，誘導(dǎo)T-ALL化療耐藥。Cai等［13］也發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs可觸發(fā)Drp1激活，誘導(dǎo)線粒體動(dòng)力學(xué)變化，誘導(dǎo)T-ALL化療耐藥。然而，BM-MSCs對(duì)T-ALL的直接作用及發(fā)揮作用的機(jī)制尚不完全清楚，探尋具體機(jī)制對(duì)尋找骨髓微環(huán)境中的潛在T-ALL治療靶點(diǎn)具有重要意義。為此筆者設(shè)計(jì)了本研究進(jìn)行探索。

本研究結(jié)果顯示，T-ALL來源的BM-MSCs促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的增殖，抑制T-ALL細(xì)胞的凋亡，這與Jia等［14］的研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步證明BM-MSCs為T-ALL細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了保護(hù)作用。Jia等［14］發(fā)現(xiàn)地塞米松通過激活甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（SREBF1）促進(jìn)BM-MSCs分化為脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞通過激活Notch1信號(hào)通路保護(hù)T-ALL細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，在T-ALL微環(huán)境中，MSCs分泌大量FGF2，與T-ALL細(xì)胞上的FGFR2結(jié)合導(dǎo)致T-ALL細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR通路過度激活，進(jìn)而促進(jìn)T-ALL腫瘤生長(zhǎng)。

FGFs是一類龐大的生長(zhǎng)因子家族，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和分化［15-17］。FGFs與四種FGFRs結(jié)合，可激活包括PI3K/Akt/mTOR通路在內(nèi)的多條信號(hào)通路［18］。有證據(jù)表明，F(xiàn)GF2在血液惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［19］，如慢性髓性白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）、慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）和霍奇金淋巴瘤［20］。本研究首次證實(shí)，F(xiàn)GFs/FGF2在T-ALL的存活及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。英菲格拉替尼，也稱為BGJ398，是一種口服FGFR1-3選擇性酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）。筆者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用BGJ398可以使T-ALL細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR通路失活，抑制小鼠T-ALL腫瘤的生長(zhǎng)，BGJ398可能是靶向T-ALL中MSCs的有效藥物。

本研究為BM-MSCs對(duì)T-ALL細(xì)胞具有保護(hù)作用提供了重要的證據(jù)支持，證實(shí)BM-MSCs通過FGF2/FGFR2通路促進(jìn)T-ALL腫瘤生長(zhǎng)，為克服BM-MSCs介導(dǎo)的T-ALL進(jìn)展提供了新靶點(diǎn)。FGF抑制劑BGJ398有望為T-ALL患者提供新的治療方案，亟待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。當(dāng)然，本研究的小鼠模型是Notch-1高表達(dá)誘導(dǎo)的T-ALL模型，其發(fā)生率只占T-ALL患者的10%左右，在臨床上還有其他因素誘導(dǎo)的T-ALL［21］。因此需要臨床前及臨床階段的研究，以進(jìn)一步證實(shí)其他因素導(dǎo)致的T-ALL是否同樣存在FGF2/FGFR2通路的過度激活。

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（2024-03-23收稿2024-09-11修回）

（本文編輯胡小寧）