過(guò)度機(jī)械應(yīng)力調(diào)控Piezo1介導(dǎo)成軟骨細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制探討

摘要：目的探討過(guò)度機(jī)械應(yīng)力調(diào)控Piezo1通道誘發(fā)小鼠成軟骨細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制。方法選取小鼠ATDC5成軟骨細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用siRNA-Piezo1干擾質(zhì)粒和Piezo1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，給予機(jī)械應(yīng)力刺激（MS），構(gòu)建對(duì)照組（Control組）、MS組、MS+siRNA-Piezo1組（MS+sh組）和MS+Piezo1過(guò)表達(dá)組（MS+OV組）。用細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)法（CCK-8）檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力，透射電鏡觀察線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，生化檢測(cè)氧化應(yīng)激和亞鐵離子（Fe2+）水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂質(zhì)活性氧（ROS）水平，蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）、Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13、蛋白聚糖（Aggrecan）及p53蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與Control組比較，MS組細(xì)胞活力下降，F(xiàn)e2+、ROS、丙二醛（MDA）水平升高，還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）水平降低（均P＜0.05），電鏡示線粒體嵴減少，SLC7A11、GPX4、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白水平下降，p53和MMP-13蛋白水平則升高（均P＜0.05）。與MS組比較，MS+sh組的Fe2+、ROS、MDA水平下降，GSH、SOD水平升高（均P＜0.05），SLC7A11、GPX4、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白水平升高，MMP-13和p53蛋白水平下降（均P＜0.05）。與MS組比較，MS+OV組的細(xì)胞活力下降，F(xiàn)e2+、ROS、MDA水平升高，GSH、SOD水平降低，SLC7A11、GPX4、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白水平下降，MMP-13和p53蛋白水平上升（均P＜0.05）。結(jié)論過(guò)度機(jī)械應(yīng)力能夠通過(guò)Piezo1通道蛋白介導(dǎo)成軟骨細(xì)胞鐵死亡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；應(yīng)力，物理；鐵死亡；Piezo1

中圖分類號(hào)：R684.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20241259

The mechanism of excessive mechanical stress modulates Piezo1-mediatedferroptosis in chondrocytes

WU Bin1，LIU Zhaoxiang2，ZHANG Yuehong3，WANG Changyao4△

1 Department of Orthopedics，Qingdao University Linyi People's Hospital，Linyi 276000，China;2 Department of Orthopedics，Yishui Second People's Hospital;3 Department of Second Orthopedics，Dongming People's Hospital;4 Department of JointSurgery，the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College

△Corresponding Author E-mail：swxg.1@163.com

Abstract：Objective To explore the mechanism of excessive mechanical stress regulated ferroptosis induced by Piezo1 channel in mouse chondrocytes.Methods The experiment was performed on mouse ATDC5 chondrocytes.siRNA-Piezo1 interference plasmid and Piezo1 overexpression plasmid were used to transfect chondrocytes，and mechanical stress stimulation was given.The control group，the mechanical stress stimulation group（MS group），the MS+siRNA-Piezo1 group（MS+sh group）and the MS+Piezo1 overexpression group（MS+OV group）were constructed，respectively.The cell viability，F(xiàn)e2+，ROS levels，the expression of ferroptosis-related proteins SLC7A11 and GPX4，and the expression of CollagenⅡ，MMP-13，Aggrecan and p53 proteins were detected in each group.Results Compared with the control group，the cell viability was decreased in the MS group（P＜0.05）.Levels of Fe2+，reactive oxygen species（ROS）and malondialdehyde（MDA）were increased（P＜0.05）.Levels of reduced glutathione（GSH）and superoxide dismutase（SOD）were decreased（Plt;0.05），and the mitochondrial ridge was decreased detected by transmission electron microscopy.Protein levels of SLC7A11，GPX4，CollagenⅡand Aggrecan were decreased（P＜0.05），while protein levels of p53 and MMP-13 were increased（Plt;0.05）.Compared with the MS group，F(xiàn)e2+，ROS and MDA levels were decreased in the MS+sh group（P＜0.05），GSH andSOD levels were increased（P＜0.05），and protein levels of SLC7A11，CollagenⅡ，GPX4 and Aggrecan were increased（Plt;0.05）.The protein levels of MMP-13 and p53 were decreased（P＜0.05）.Compared with the MS group，cell viability was decreased（P＜0.05），F(xiàn)e2+，ROS and MDA levels were increased（P＜0.05），GSH and SOD levels were decreased（P＜0.05），and protein levels of SLC7A11，CollagenⅡ，GPX4 and Aggrecan were decreased in the MS+OV group（P＜0.05）.Levels of MMP-13 and p53 protein were increased（P＜0.05）.Conclusion Excessive mechanical stress can induce chondrocyte ferroptosis and promote extracellular matrix degradation via Piezo1 channel protein.

Key words：osteoarthritis;chondrocytes;stress，mechanical;ferroptosis;Piezo1

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)退行性疾病，具有較高的發(fā)病率和致殘率。OA以軟骨損傷、軟骨下骨化和骨贅形成等為主要的病理特征［1］。早期OA表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，晚期出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)畸形、晨僵，嚴(yán)重者可致殘疾。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界OA患者累計(jì)約3億人，每年相關(guān)醫(yī)療費(fèi)用支出超過(guò)3 000億美元［2］。隨著人口老齡化和肥胖問(wèn)題的加劇，OA發(fā)病率與致殘率逐年增加，已成為全世界面臨的重要公共健康問(wèn)題之一。

大量研究表明，OA的發(fā)病機(jī)制主要包括軟骨細(xì)胞死亡、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解2個(gè)方面［3-4］。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的唯一細(xì)胞類型，對(duì)機(jī)械應(yīng)力刺激敏感。生理性機(jī)械應(yīng)力對(duì)維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是必需的，而過(guò)度機(jī)械應(yīng)力負(fù)荷可激發(fā)軟骨細(xì)胞損傷和死亡，至于具體激發(fā)機(jī)制和細(xì)胞死亡機(jī)制尚不明確［5］。在細(xì)胞死亡事件中，鐵死亡是一種鐵離子依賴性的新型程序性細(xì)胞死亡方式，以脂質(zhì)活性氧（ROS）累積、線粒體皺縮為主要特征。Piezo1作為一種機(jī)械敏感性離子通道蛋白，主要分布在軟骨細(xì)胞表面，能夠把機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，調(diào)控軟骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)［6］。最近的研究表明，鐵死亡、Piezo1通道蛋白均與軟骨損傷密切相關(guān)［7-8］。關(guān)閉Piezo1通道蛋白可以起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用［9］。鐵螯合劑可抑制OA軟骨細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而減輕軟骨基質(zhì)的降解［10］。目前，關(guān)于機(jī)械應(yīng)力調(diào)控Piezo1介導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究仍相對(duì)較少。本研究旨在探討過(guò)度機(jī)械應(yīng)力調(diào)控Piezo1介導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選取小鼠ATDC5成軟骨細(xì)胞系進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)使用完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下完全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.2主要試劑和儀器細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)iCell公司。細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)法（CCK-8）試劑盒、0.25%胰蛋白酶溶液、亞鐵離子（Fe2+）含量檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、高效RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。無(wú)水乙醇、丙酮購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。電鏡固定液、Western blot一抗稀釋液、二抗稀釋液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。丙二醛（MDA）、ROS、還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。兔抗小鼠溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）4、膠原蛋白（Collagen）Ⅱ、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）?13、蛋白聚糖（Aggrecan）及p53一抗購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。羊抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司），透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickinson公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），機(jī)械牽張應(yīng)力加載模型系統(tǒng)（美國(guó)Flexcell公司）。

1.3機(jī)械應(yīng)力刺激（MS）通過(guò)周期性體外細(xì)胞機(jī)械牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞施加機(jī)械應(yīng)力，為培養(yǎng)細(xì)胞創(chuàng)建一個(gè)循環(huán)拉伸應(yīng)變的環(huán)境，模擬身體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的MS。具體操作如下：細(xì)胞接種到預(yù)涂有CollagenⅠ的6孔BioFlex培養(yǎng)板，密度為2×105/孔，暴露于參數(shù)為10%強(qiáng)度、0.5 Hz和1/2正弦波的周期性細(xì)胞機(jī)械應(yīng)力下8 h。

1.4細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1干擾質(zhì)粒和Piezo1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選由上海吉?jiǎng)P生物公司完成。使用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，構(gòu)建對(duì)照組（Control組）、MS組、MS+siRNA-Piezo1組（MS+sh組）和MS+Piezo1過(guò)表達(dá)組（MS+OV組）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟：將細(xì)胞預(yù)先接種于6孔板（5×105個(gè)/孔），根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到ATDC5成軟骨細(xì)胞中，48 h收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板（3×103/孔），過(guò)夜，按照Control組、MS組、MS+sh組、MS+OV組分組情況干預(yù)細(xì)胞24 h，向每孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃避光孵育1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞活力值。

1.6透射電子顯微鏡觀察線粒體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)離心收集細(xì)胞，去培養(yǎng)基加入電鏡固定液，4℃重懸混勻固定2～4 h，瓊脂預(yù)包埋，室溫條件下1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，812包埋劑浸脂，聚合制成透射電子顯微鏡標(biāo)本，超微切片機(jī)切割成為超薄切片（80 nm），用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色。透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和Fe2+水平測(cè)定按照每5×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL裂解液裂解細(xì)胞，并使用超聲波（功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次）破碎細(xì)胞，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH、SOD、MDA和Fe2+水平。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂質(zhì)ROS水平將細(xì)胞接種于6孔板（5×105/孔）中過(guò)夜，各組按照相應(yīng)的干預(yù)方式干預(yù)細(xì)胞24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基配制的10μmol/L DCFH-DA熒光探針，37℃孵育20 min，PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用Flow Jo軟件進(jìn)行定量分析。

1.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平將細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中過(guò)夜，按照Control組、MS組、MS+sh組、MS+OV組分組情況干預(yù)細(xì)胞24 h，裂解并收集各組細(xì)胞，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗在4℃下孵育過(guò)夜，室溫孵育二抗1 h，蛋白條帶用ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)獲取條帶圖像。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的分布，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖活力比較組間比較：與Control組比較，在相同時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h和72 h），MS組、MS+sh組和MS+OV組細(xì)胞增殖活力均降低（Plt;0.05）；與MS組比較，在相同時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h和72 h），MS+sh組細(xì)胞增殖活力均升高，而MS+OV組細(xì)胞增殖活力均降低（P＜0.05）。組內(nèi)比較：Control組、MS組和MS+sh組48 h和72 h的細(xì)胞增殖活力相比各自組24 h依次升高（P＜0.05）；而MS+OV組72 h時(shí)細(xì)胞增殖活力較24 h和48 h時(shí)升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化Control組線粒體結(jié)構(gòu)正常，線粒體嵴排布密集，呈長(zhǎng)條形或橢圓形；與Control組相比，MS+sh組、MS組和MS+OV組線粒體形態(tài)損傷依次加重，表現(xiàn)為線粒體膜發(fā)生皺縮，形態(tài)由長(zhǎng)棒形縮為圓形，線粒體嵴明顯減少，MS+sh組、MS組和MS+OV組軟骨細(xì)胞的死亡方式均為鐵死亡。見(jiàn)圖1。

2.3過(guò)度機(jī)械應(yīng)力對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激和Fe2+水平的影響與Control組相比，MS組的ROS、MDA、Fe2+水平升高，GSH、SOD水平下降（P＜0.05）；與MS組比較，MS+sh組的ROS、MDA、Fe2+水平下降，GSH、SOD水平升高（P＜0.05），MS+OV組的ROS、MDA、Fe2+水平升高，GSH、SOD水平下降（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較與Control相比，MS組SLC7A11、GPX4、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白水平降低，MMP-13、p53蛋白水平升高（P＜0.05）；與MS組比較，MS+sh組的SLC7A11、GPX4、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白水平升高，MMP-13、p53蛋白水平下降（P＜0.05）；與MS組比較，MS+OV組的SLC7A11、GPX4、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白水平降低，MMP-13、p53蛋白水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

3討論

軟骨細(xì)胞是一種機(jī)械敏感細(xì)胞，可以將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)，參與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的各種生物學(xué)過(guò)程［11］。機(jī)械應(yīng)力是一把“雙刃劍”，適度的機(jī)械應(yīng)力刺激可保護(hù)軟骨，維持軟骨穩(wěn)態(tài)，而過(guò)度的機(jī)械應(yīng)力則是OA發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一［12］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，軟骨細(xì)胞鐵死亡在OA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13-15］。然而，過(guò)度的機(jī)械應(yīng)力和鐵死亡在OA中的作用機(jī)制尚不完全明確。

Piezo1作為一種機(jī)械敏感的離子通道，能夠?qū)S轉(zhuǎn)化為電或化學(xué)信號(hào)，傳遞至胞內(nèi)引起一系列生化反應(yīng)［16］。有研究表明，Piezo1能夠介導(dǎo)軟骨細(xì)胞受到MS所形成的內(nèi)電流，從而證實(shí)Piezo1在軟骨細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［17］。另有研究發(fā)現(xiàn)，行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患者軟骨受損區(qū)的Piezo1蛋白水平顯著升高［18］。以上證據(jù)表明，Piezo1在OA的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，Piezo1與鐵死亡在OA中的關(guān)系尚不清楚。本研究通過(guò)在體外成軟骨細(xì)胞中應(yīng)用siRNA-Piezo1和Piezo1過(guò)表達(dá)以確定Piezo1在細(xì)胞發(fā)生鐵死亡中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)度MS能夠降低細(xì)胞的增殖活力，使線粒體形態(tài)發(fā)生損傷；siRNA-Piezo1能夠在過(guò)度MS的基礎(chǔ)上提高細(xì)胞的增殖活力，減輕線粒體損傷，而過(guò)表達(dá)Piezo1將在過(guò)度MS的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低細(xì)胞的增殖活力，加重線粒體損傷。此外，鐵死亡的過(guò)程中伴隨著氧化應(yīng)激水平的加劇。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度MS能夠提高細(xì)胞ROS、MDA的水平，降低GSH、SOD的水平。綜合以上研究結(jié)果說(shuō)明，過(guò)度MS能夠通過(guò)Piezo1介導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

細(xì)胞鐵死亡過(guò)程受到多種蛋白的調(diào)控。SLC7A11作為一種重要的細(xì)胞膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要通過(guò)SLC7A11/GPX4信號(hào)通路調(diào)控鐵死亡［19］。GPX4是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)消除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS來(lái)抵抗鐵死亡［20］。p53是一種典型的抑癌基因，通過(guò)轉(zhuǎn)錄的方式抑制SLC7A11的表達(dá)，導(dǎo)致胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，抑制GPX4活性，從而使細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性增加［21］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)度機(jī)械應(yīng)力刺激能夠使軟骨細(xì)胞鐵死亡通路中的相關(guān)蛋白發(fā)生明顯變化，p53表達(dá)水平升高，SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)水平降低，這證實(shí)了p53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞鐵死亡過(guò)程中的關(guān)鍵作用。軟骨細(xì)胞作為軟骨唯一的細(xì)胞成分，參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成。ECM主要由CollagenⅡ和Aggrecan構(gòu)成［22］。MMP-13在ECM降解過(guò)程中起到重要的作用［23-24］。然而，Piezo1與ECM降解之間的關(guān)系尚不清楚。本研究結(jié)果表明，過(guò)度機(jī)械應(yīng)力刺激能夠通過(guò)Piezo1通道蛋白使CollagenⅡ和Aggrecan的表達(dá)明顯降低，而MMP-13的表達(dá)明顯上升，這表明過(guò)度機(jī)械刺激能夠促進(jìn)ECM降解。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，過(guò)度機(jī)械應(yīng)力能夠通過(guò)Piezo1通道蛋白介導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡，促進(jìn)ECM降解，這對(duì)理解過(guò)度機(jī)械應(yīng)力如何導(dǎo)致OA提供了新的理論依據(jù)。

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（2024-09-03收稿2024-11-03修回）

（本文編輯李國(guó)琪）