寒區(qū)綠豆根瘤微生物組及優(yōu)勢慢生根瘤菌的分離、結(jié)瘤活性

摘要：為探究寒區(qū)綠豆根瘤的微生物組并獲得綠豆的本地根瘤菌資源，利用高通量測序方法分析了黑龍江省大慶市安達(dá)試驗(yàn)田綠豆根瘤的微生物組，并利用平板劃線法從綠豆根瘤中分離、鑒定優(yōu)勢根瘤菌，并開展了回接結(jié)瘤試驗(yàn)，考察了結(jié)瘤植株的生長情況。結(jié)果顯示，綠豆根瘤中共檢測到113個OTU，主要微生物菌群來自變形菌門、藍(lán)藻門、放線菌門和未分類細(xì)菌門，優(yōu)勢的慢生根瘤菌屬占64.29%，其他為非根瘤菌屬。網(wǎng)絡(luò)分析顯示慢生根瘤菌屬與6種非根瘤菌存在相關(guān)性，并與假單胞菌屬存在正相關(guān)性。分離獲得的優(yōu)勢根瘤菌利用16S rDNA進(jìn)行分子鑒定結(jié)果表明，該根瘤菌與慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）的相似性為99.93%?；亟咏Y(jié)瘤后的綠豆植株根長減少5.8%，但其株高以及鮮重增加39.7%和236.1%，地下鮮重提高111.4%。

關(guān)鍵詞：綠豆；根瘤；微生物組；慢生根瘤菌；回接結(jié)瘤試驗(yàn)

綠豆[Vigna radiate （L.） Wilcaek）]為豆科（Leguminosae）、蝶形花亞科（Papilionoideae）、豇豆屬（Vigna）植物，生育期短，耐旱、耐瘠。綠豆在我國有兩千多年的栽培歷史[1]，其生長適應(yīng)性極強(qiáng)，能生存在絕大多數(shù)的環(huán)境中，在我國東北、華北等地廣泛種植[2-3]。綠豆具有非常高的營養(yǎng)價值和醫(yī)用藥用價值[4]，自古便成方入藥，據(jù)本草綱目記載，綠豆可用于治療人類皮炎麻疹、痱子丹毒等多種人體濕熱癥狀，以食入藥可輔助治療腎炎類、糖尿病、高血壓、心血管等疾病并且可有效緩解視力減退及高血脂等癥狀[5]。

我國是世界上主要的綠豆產(chǎn)出國。并且隨著全球綠豆需求的不斷提高，綠豆種植面積及產(chǎn)量也呈持續(xù)增長的趨勢。FAO數(shù)據(jù)顯示，2019年全球綠豆種植面積增長1%，綠豆產(chǎn)量增長3%?；瘜W(xué)肥料的使用雖然提高了糧食產(chǎn)量，但是也給土壤造成不可逆的損害。土壤板結(jié)問題嚴(yán)重，東北黑土地退化，土壤微生物減少，病原微生物抗性增強(qiáng)。隨著綠色農(nóng)業(yè)理念的建立以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)化發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，生物農(nóng)藥、生物肥料漸漸成為主要研究方向。利用根瘤菌制成的微生物肥料，形成植物-微生物共生系統(tǒng)，提供植物所需的氮元素等必需營養(yǎng)成分，從而提高作物產(chǎn)量[6]。

根瘤菌（Rhizobia）主要是與豆科植物互利共生的一類細(xì)菌，根瘤菌形態(tài)多樣，包含短棒狀，梨型等，有抗性較強(qiáng)的外生莢膜?？衫帽廾M(jìn)行運(yùn)動。不產(chǎn)生芽孢，通過二分裂進(jìn)行繁殖，與豆科植物結(jié)合后形成類菌體。常見根瘤菌主要分為根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬，兩者均可與豆類植物共生。根瘤菌具有纖維素酶以及固氮酶活性，可以通過固氮作用固定空氣中游離的氮為植物所用。根瘤菌分布廣泛，除了熟知的豆類植物外，花生、苜蓿等植物也具有與根瘤菌共生的能力[7]。生物固氮能夠?yàn)樽魑锷a(chǎn)提供一種可持續(xù)的、廉價且不破壞生態(tài)環(huán)境的方法。生物固氮貢獻(xiàn)了全球大約60%的固氮量，化學(xué)肥料供給占植物總需氮量的25%[8]。在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，豆科植物與根瘤菌的共生系統(tǒng)是最重要的氮肥來源。綠豆可以通過與根瘤菌建立共生關(guān)系的方式固定37～83 kg·hm-2的氮[9]。根瘤固氮共生體系具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟(jì)價值，在生態(tài)保護(hù)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的作用[10]。

豆科根瘤菌的研究在國外已開展了一百多年，基于以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的研究顯示，慢生根瘤菌菌株在綠豆根瘤中占主導(dǎo)地位[11-12]。我國從1950年開始根瘤菌的研究，以引進(jìn)國外的根瘤菌劑應(yīng)用為主。近年來我國生物固氮方面的研究有很大突破，為豆科根瘤菌的研究打下了良好基礎(chǔ)，尤其對綠豆根瘤菌固氮方向的試驗(yàn)提供了理論指導(dǎo)。根瘤菌的研究一般包括形態(tài)研究、結(jié)瘤特性、生理生化及分子鑒定等多個方面。多年來，根瘤菌的研究得益于大量先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用，包括但不限于分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等[13]。隨著研究技術(shù)手段的發(fā)展人們逐漸清楚地認(rèn)識和了解根瘤菌，為揭示高效結(jié)瘤共生固氮機(jī)理、探究進(jìn)化分類、研究系統(tǒng)發(fā)育等奠定了基礎(chǔ)。

本研究對取自黑龍江省大慶市安達(dá)試驗(yàn)田的綠豆根瘤進(jìn)行了高通量測序，分析其微生物群落結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了根瘤菌分離，從分子水平鑒定獲得的根瘤菌，隨后開展了回接結(jié)瘤試驗(yàn)，考察結(jié)瘤植株的生長情況，分析根瘤菌回接對綠豆生長的影響，以期豐富黑龍江產(chǎn)區(qū)的綠豆根瘤菌資源，進(jìn)一步為植株高效固氮應(yīng)用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年9月采集黑龍江省大慶市安達(dá)（46°01′N～47°01′N，124°53′E～125°55′E）試驗(yàn)田生長的綠豆根瘤。將采集的樣品分裝到無菌紙袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，暫存于4 ℃冰箱，并在48 h內(nèi)進(jìn)行分離?；亟釉囼?yàn)所用綠豆品種為小明綠，來自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物種質(zhì)資源研究室。

1.2 方法

1.2.1 綠豆根瘤內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺內(nèi)選取個大而飽滿的根瘤，放在清水中浸泡4～5 min，洗去雜質(zhì)，再用75%乙醇浸泡5 min后，用濃度為5%的NaClO溶液表面滅菌5 min，然后用無菌水沖洗10次。每個植株選擇3～5個根瘤加入到30%甘油中，置于-80 ℃冰箱待用。取不同的3個植株的根瘤共3個重復(fù)，編號分別為n1、n2、n3。用FastDNA SPIN Kit For Soil 試劑盒提取根瘤基因組DNA，并電泳檢測合格，測定濃度。送到百邁客生物科技有限公司（北京）進(jìn)行高通量測序分析。通過測定16S rDNA基因的v3+v4區(qū)域的序列確定微生物分類地位，分析根瘤內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)。PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行測序。下機(jī)序列經(jīng)質(zhì)量過濾和DADA2去噪得到最終有效數(shù)據(jù)（Non-chimeric Reads）。按照微生物群落結(jié)構(gòu)分析流程，在不同分類階元分析各物種的豐度及Alpha多樣性，根據(jù)各個物種在各個樣品中的豐度以及變化情況構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 根瘤菌的分離、純化與保存

綠豆根部根瘤處理方法同1.2.1。在無菌操作的情況下，將單個根瘤夾破后在YAM （酵母甘露醇瓊脂）培養(yǎng)基上劃線，在28 ℃的溫箱中培養(yǎng)3～5 d后，挑取單菌落進(jìn)行劃線純化，反復(fù)分離，直到菌落無分離為止[14]。根瘤菌在剛果紅YMA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～7 d菌落不吸色。將所有根瘤菌用甘油管保藏于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.3 根瘤菌形態(tài)觀察與分子鑒定

根瘤菌點(diǎn)接在培養(yǎng)基上，觀察菌落形狀。革蘭氏染色并拍照。將單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，離心取沉淀。用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取根瘤菌總DNA，電泳檢測合格后稀釋到2 ng·μL-1作為PCR模板DNA。利用16S rDNA基因引物27F和1492R擴(kuò)增根瘤菌的16S rDNA全長序列進(jìn)行分子鑒定。PCR反應(yīng)體系為 50 μL體系：2×PCR mix 25.0 μL，F(xiàn)orward primer 27F+Reverse primer 1492R 2 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 22.0 μL?；旌?，瞬時離心。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；再72 ℃延伸1 min 30 s，共30個反應(yīng)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳40 min，經(jīng)EB替代物染色后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。將PCR產(chǎn)物送往華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

測序得到的序列拼接后去掉上下游引物序列后，將獲得的序列在EZ BioCloud數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行同源性比對分析。通過MEGA 5.1軟件采用相鄰法（Neighbor Joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)抽樣1 000次。

1.2.4 根瘤菌回接結(jié)瘤試驗(yàn)

回接試驗(yàn)于2021年10月在實(shí)驗(yàn)室的恒溫植物溫室內(nèi)開展。采用雙層蛭石法[13]，蛭石裝袋滅菌2次，培養(yǎng)液采用Fahraeus無氮營養(yǎng)液。將分離所得菌株，在YMA液體培養(yǎng)基25～28 ℃培養(yǎng)2～3 d得到根瘤菌菌液。

種子表面滅菌及催芽：選擇大小均一飽滿、無傷殘的綠豆種子在75%酒精中消毒4～6 min，然后用無菌水沖洗2～3次至無酒精殘留后置于培養(yǎng)皿中，沸水浸種2～3 min，再放入冷水中浸種2～3 min。種子催芽采用培養(yǎng)皿法，于28 ℃條件下催芽2 d，待綠豆根長到5～6 mm時即可。

接種和幼苗的培養(yǎng)條件：將小明綠綠豆種子放入相應(yīng)根瘤菌菌液浸泡30 min，陰性對照處理加等量的無菌水浸泡30 min，然后播入滅菌后的蛭石中。每株加菌懸液1 mL，對照加等量的無菌水。將缽體放在溫室培養(yǎng)，溫度25～30 ℃，空氣相對濕度60%，光照強(qiáng)度5 000 lx，每7 d澆無氮營養(yǎng)液100 mL，生長43 d后測定每株綠豆的有效根瘤個數(shù)，根長、鮮重及根瘤大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆根瘤內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 高通量數(shù)據(jù)特征

來自綠豆根瘤的3個樣品，共獲得 239 452 對 Reads， 雙端 Reads 質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生 222 311 條Clean Reads，每個樣品至少產(chǎn)生 73 881 條 Clean Reads，平均產(chǎn)生 74 104 條 Clean Reads。由圖1可知，3個樣品測序稀釋曲線均表現(xiàn)為先急劇上升，然后隨著測序條數(shù)的增加曲線趨于平緩，表示各樣品物種并不會隨測序數(shù)量的增加而顯著增多，說明測序的結(jié)果較為合理。以97%相似性為標(biāo)準(zhǔn)，3個樣品分別檢測到64，31和18個OTU。

2.1.2 根瘤群落組成

以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫

使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，得到各水平（phylum，class，order，family，genus，species）綠豆根瘤內(nèi)生菌群落組成。

門水平：3個樣品的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢群落為變形菌門（Proteobacteria）（71.50%、57.74%和66.76%），藍(lán)藻門（Cyanobacteria） （20.95%、34.41%和27.46%），未分類細(xì)菌（unclassified Bacteria）（4.35%、7.49%和5.73%），放線菌門（Actinobacteriota）（2.77%、0.16%和0）。另外還檢測到厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、梭桿菌門（Fusobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和（Methylomirabilota），占比很少，有些門僅在一個樣品中檢測到（圖2A）。

屬水平：3個樣品的主要細(xì)菌群落主要分布在慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（69.53%、57.30%和66.04%），未分類念珠藻科（unclassified Nostocaceae）（18.24%、34.41%和27.46%），未分類細(xì)菌（unclassified Bacteria） （4.35%、7.49%和5.73%），其他菌屬占比較少，包括未分類藍(lán)細(xì)菌目（unclassified Cyanobacteriales）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、未分類微球菌科（unclassified Micrococcaceae）、泛菌屬（Pantoea）、Quadrisphaera、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Klenkia和其他（圖2B），有些屬僅在一個樣品中檢測到。

2.1.3 根瘤微生物菌群相關(guān)性分析

為獲得物種在環(huán)境樣本中的共存關(guān)系，開展了斯皮爾曼（Spearman）秩相關(guān)分析并篩選相關(guān)性大于0.1且P值小于0.05的數(shù)據(jù)構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)（圖3）。網(wǎng)絡(luò)圖顯示慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（節(jié)點(diǎn)38）與假單胞菌屬（Pseudomonas）（節(jié)點(diǎn)3）、乳桿菌（Ligilactobacillus）（節(jié)點(diǎn)6）正相關(guān)關(guān)系（P=0），與未分類念珠藻科（unclassified_Nostocaceae）（節(jié)點(diǎn)1）、未分類細(xì)菌（unclassified_Bacteria）（節(jié)點(diǎn)2）、亞硫酸桿菌（Sulfitobacter）（節(jié)點(diǎn)4）、未分類哈里菌科（unclassified_Halieaceae）（節(jié)點(diǎn)5）存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（P=0）。

2.2 根瘤菌的分離純化

從綠豆根瘤中以選擇性培養(yǎng)基利用平板劃線法分離純化根瘤菌。待菌株穩(wěn)定后進(jìn)行觀察，在YMA培養(yǎng)基上根瘤菌呈半透明乳白色，圓形且邊緣整齊、中間略有隆起、邊緣光滑，有粘性（圖4）。根瘤菌經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)出紅色桿狀，為革蘭氏陰性菌（圖5）。

2.3 基于16S rDNA的根瘤菌分子鑒定

利用16S rDNA的擴(kuò)增引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)EB替代物染色后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果如圖6所示。16S rDNA測序得到的序列在EZ BioCloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對分析，使用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。該系統(tǒng)發(fā)育樹中1為測序樣本，外類群為結(jié)核分枝桿菌H37Rv株。由系統(tǒng)發(fā)育樹及同源性比對分析結(jié)果可知該菌株與慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）具有同源關(guān)系且相似性為99.93%。該根瘤菌初步鑒定為慢生根瘤菌。

2.4 根瘤菌回接對綠豆生長的影響

將分離純化出的根瘤菌菌株進(jìn)行回接結(jié)瘤試驗(yàn)，對生長43 d后兩組綠豆植株的各項(xiàng)生長情況進(jìn)行比對，接種根瘤菌的處理組葉片即使在澆灌無氮營養(yǎng)液的情況下依然保持綠色，而對照組則葉片發(fā)黃，明顯缺氮（圖8）。試驗(yàn)組結(jié)瘤效果顯著（圖9）。另外，處理組的根長減少5.8%（圖10A），但是處理組的株高以及鮮重顯著增加39.8%和236.1%（圖10B、C），地下部鮮重顯著提高111.4%（圖10D），以此判斷回接對綠豆生長起促進(jìn)作用。

3 討論

生物固氮對豆科植物的生產(chǎn)發(fā)揮著重要作用，根瘤菌為世界農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展貢獻(xiàn)了重要作用。但是相比于其他豆科植物（大豆、花生等），關(guān)于綠豆根瘤及根瘤菌的研究卻仍然不多。本研究利用高通量測序首先解析了黑龍江省大慶市安達(dá)試驗(yàn)田中綠豆根瘤的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并通過平板劃線法從綠豆根瘤中分離根瘤菌，基于16S rDNA的序列進(jìn)行分子鑒定，該菌株與慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）具有同源關(guān)系且相似性為99.93%，初步鑒定獲得的菌株為慢生根瘤菌。該根瘤菌回接試驗(yàn)也證明了其顯著促進(jìn)綠豆結(jié)瘤和生長。

根瘤是根瘤菌與豆科植物共生固氮的場所，很多研究發(fā)現(xiàn)豆科植物根瘤內(nèi)除根瘤菌外，還存在著非根瘤內(nèi)生細(xì)菌[15]。Hakim等[13]利用16S rRNA標(biāo)簽高通量測序研究了Pakistan不同地區(qū)的綠豆根瘤的微生物組，發(fā)現(xiàn)3個地點(diǎn)82%～94%的菌為慢生根瘤菌，有4個地點(diǎn)99.9%是Ensifer （Sinorhizobium）。非根瘤菌屬包括不動桿菌屬（Acinetobacter），還分離到Microbacterium和Pseudomonas。Favero等[16]利用高通量測序研究了10種種植于巴西熱帶土壤中的2個綠豆基因型的根瘤的微生物組，發(fā)現(xiàn)除了有機(jī)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的土壤中包含B. japonicum，其他土壤中與Bradyrhizobium elkanii相近的OTUs 是優(yōu)勢根瘤菌，另外還發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬（Pseudomonas）。同樣利用高通量測序方法解析了寒區(qū)綠豆根瘤的微生物組，發(fā)現(xiàn)B. japonicum是該地區(qū)綠豆根瘤的主要根瘤菌類群，內(nèi)生細(xì)菌還包括占比較多的未分類念珠藻科unclassified Nostocaceae和未分類細(xì)菌unclassified Bacteria，也檢測到比例較低的假單胞菌屬。綠豆根瘤的形狀、 大小呈現(xiàn)多樣性，因此重復(fù)之間也表現(xiàn)出非根瘤菌的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的多樣性。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，根瘤菌屬和假單胞菌屬存在正相關(guān)關(guān)系。Dhole等[17]將根瘤菌和假單胞菌共接種證明可促進(jìn)結(jié)瘤，對綠豆生長和產(chǎn)量具有積極作用。根瘤菌菌群的分析為進(jìn)一步研究根瘤菌和非根瘤菌的相互作用和組裝機(jī)制提供了基礎(chǔ)。以根瘤菌殺菌劑為代表的微生物制劑在提高土壤肥力、節(jié)約成本、提高肥料利用率、提高作物品質(zhì)、減少作物病害等方面具有獨(dú)特的作用，已成為發(fā)展綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)不可替代的投入[18] 。

根瘤菌在豆科植物根瘤中占優(yōu)勢，我國的綠豆根瘤菌由于地理位置和品種差異導(dǎo)致具有多樣性。在我國主要生態(tài)區(qū)與綠豆共生的根瘤菌以慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）為主[19]。除了優(yōu)勢的慢生根瘤菌，也包含了部分快生根瘤菌（Rhizobium）和中華根瘤菌（Sinorhizobium）[20-21]。分離的綠豆根瘤菌也屬于Bradyrhizobium japonicum，與其他地區(qū)發(fā)現(xiàn)大部分綠豆根瘤菌類型相同。檢測到的其他內(nèi)生菌的分離將成為今后菌種資源挖掘的工作之一。

綠豆與根瘤菌互利共生形成根瘤[22]，根瘤菌與豆科植物共生體系的固氮能力最強(qiáng)[23-24]， 雖然目前分離了一些根瘤菌，但是仍缺乏對菌種耐受性、活性、持久性等方面的了解[25]。研發(fā)適合當(dāng)?shù)氐木G豆的根瘤菌接種劑對于有效減少化肥的使用與污染，改善土壤結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境質(zhì)量，提高農(nóng)業(yè)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，對我國可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展將發(fā)揮重要的作用。

本研究對于優(yōu)勢的根瘤菌進(jìn)行了分離、鑒定，并開展了該根瘤菌的回接試驗(yàn)，所得的慢生根瘤菌表現(xiàn)出了明顯的促生和促結(jié)瘤效果，但是對于篩選出適宜黑龍江省土壤條件的高效固氮的根瘤菌并開發(fā)本地適用的根瘤菌劑仍需要開展更多的工作，包括研究該根瘤菌在田間對綠豆結(jié)瘤和產(chǎn)量提升影響的大面積試驗(yàn)。另外，綠豆根瘤微生物組中發(fā)現(xiàn)的其他微生物與根瘤菌相互關(guān)系的研究也是今后重要的研究方向。

4 結(jié)論

本研究揭示了寒區(qū)綠豆根瘤微生物組的群落結(jié)構(gòu)，主要包括變形菌門、藍(lán)藻門、放線菌門和未分類細(xì)菌門，慢生根瘤菌是主要的優(yōu)勢共生固氮菌。由綠豆根瘤內(nèi)分離、鑒定的慢生根瘤菌具有明顯促生和促結(jié)瘤能力。

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Nodules Microbiome of Mung Bean in Cold Regions and Isolation， Re-Inoculate Activity of Dominant Bradyrhizobium japonicum from Mung Bean Nodules

Abstract：In order to investigate the nodules microbial community of mung bean in cold regions and obtain local rhizobium resources for mung beans， nodules microbiome of mung bean was analyzed using high-throughput sequencing methods， and a rhizobia was isolated and identified from nodules of mung bean in Anda experimental field， Daqing City， Heilongjiang Province by the plate streaking method. Moreover， we conducted a reinoculate test to investigate the growth of plants. The results showed that 113 OTUs were detected in the nodules of mung bean and the dominant phyla included Proteobacteria， Cyanobacteria， Actinobacteria， and Unclassified Bacteria; The dominant Bradyrhizobium genus accounted for 64.29%， while the others are non-rhizobia genera. The network analysis showed a correlation between Bradyrhizobium and six non-rhizobia， and a positive correlation between Bradyrhizobium and Pseudomonas. The molecular identification based on 16S rDNA showed the rhizobia had a 99.93% similarity with Bradyrhizobium japonicum. After nodulation， the root length of mung bean decreased by 5.8%， but the plant height and fresh weight increased by 39.7% and 236.1%， respectively. The underground fresh weight increased by 111.4%. This study analyzed the endophytic community structure of mung bean nodules and obtained a dominant Bradyrhizobium japonicum with growth promoting ability from the nodules.

Keywords：mung bean; nodule; Microbiome; Bradyrhizobium japonicum; reinoculate test