表面增強(qiáng)拉曼光譜的基底設(shè)計(jì)及其血液檢測研究進(jìn)展

摘要 表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）因其獨(dú)有的快速檢測、高靈敏度、低檢測限和無損分析等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域有著廣泛的研究。 SERS增強(qiáng)基底的成功構(gòu)建是SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)以上優(yōu)點(diǎn)的前提。 本文介紹了SERS的增強(qiáng)機(jī)制，在血液檢測中，對其增強(qiáng)基底的設(shè)計(jì)進(jìn)行了分類及討論，將其分為無標(biāo)簽基底和有標(biāo)簽基底兩大類，并根據(jù)材料應(yīng)用的不同和基底設(shè)計(jì)的方式不同進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)分。 對近年來血液檢測中SERS檢測應(yīng)用相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了回顧，綜述了在血液檢驗(yàn)中不同類型增強(qiáng)基底的設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用特征。 最后，對SERS增強(qiáng)基底在血液檢驗(yàn)中的設(shè)計(jì)進(jìn)行了總結(jié)與展望。

關(guān)鍵詞 表面增強(qiáng)拉曼光譜；增強(qiáng)機(jī)制；無標(biāo)簽基底；有標(biāo)簽基底；血液檢測

中圖分類號：O657. 3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-0518（2025）01-0001-13

陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 2020TD-033）和國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心一般基金項(xiàng)目（No. LCB202209）資助

人體中存在可直接反映細(xì)胞生物狀態(tài)的生物小分子，稱為代謝物[1]。 血液中的代謝物可用于健康評估和臨床診斷。 血液作為體液的一種，占人體質(zhì)量的7%～8%，主要由血細(xì)胞與血漿組成，它們共同協(xié)作，維持身體的正常生理功能[2-4]。 通過血液檢測不僅對身體的營養(yǎng)狀況、免疫狀態(tài)有所了解，還可對感染、炎癥和腫瘤等疾病進(jìn)行判斷。 許多疾病，例如糖尿病、肝炎、菌血癥、鐮狀細(xì)胞病及癌癥等，均可以通過明顯變化的血液成分生化指標(biāo)來測定[3-5]。 目前，常用的血液檢測方法包括血常規(guī)檢測、生化檢測和腫瘤標(biāo)志物檢測等[5-6]。 但以上檢測方法存在預(yù)處理流程復(fù)雜、檢測耗時、費(fèi)用昂貴和靈敏性差等問題[7]。 在一些極端情況下，緩慢的血液檢測流程可能會增加患者的死亡率，特別是在急診、急救和重癥監(jiān)護(hù)中，血液檢測診斷的速度和準(zhǔn)確性變得至關(guān)重要[5-8]。 因此，需要能夠進(jìn)行即時血液檢測的方案，以通過更快的結(jié)果來提供更早的治療干預(yù)患者的預(yù)后。 1928年，F(xiàn)leischmann等[9]首次發(fā)現(xiàn)光通過純化的液體或蒸汽時會產(chǎn)生頻率降低的散射光。 散射光頻率的變化反映出不同種類原子團(tuán)的獨(dú)一性振動，這使得拉曼散射光譜具有“指紋”特性[10-12]。 由于水分子的拉曼響應(yīng)性較弱[13-14]，因此對于血液樣本無需脫水處理，極大簡化了此類樣品的預(yù)處理過程。 然而，拉曼光譜信號弱[15]、檢測靈敏度低[16]和熒光背景強(qiáng)[17]等缺點(diǎn)，限制了其在血液檢測中的廣泛應(yīng)用[18]。

相較于普通拉曼光譜，表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）具有信號更強(qiáng)、更準(zhǔn)確、更快及檢測限更低的優(yōu)勢，檢出限甚至可低至1×10-15～1×10-18 mol/L[19-21]。 目前，普遍公認(rèn)SERS增強(qiáng)效應(yīng)的原理主要包括電磁場增強(qiáng)（Electromagnetic enhancement， EM）和化學(xué)增強(qiáng)（Chemical enhancement， CM）[22-24]。 EM是由于光照射在金屬上時原本平衡的電子發(fā)生位移，但由于正電荷中心庫侖力的作用，電子又被牽拉至原來位置，導(dǎo)致電子在分離的正負(fù)電荷之間反復(fù)振蕩。 當(dāng)入射光的頻率與金屬表面電子的振蕩頻率相匹配時，就會產(chǎn)生共振效應(yīng)，即表面等離子體共振（Surface plasmon resonance， SPR）。貴金屬納米顆粒所產(chǎn)生的感應(yīng)電荷可被限制在顆粒表面，即產(chǎn)生局域表面等離子體共振（Localized surface plasmon resonance， LSPR）[25]，使得局部電場增強(qiáng)[26]，引起拉曼信號指數(shù)級增強(qiáng)[27-29]。 CM是由于待測物與基底之間發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移，增加了待測物分子的極化率而導(dǎo)致拉曼信號的增強(qiáng)，一般認(rèn)為CM增強(qiáng)有3種模式： 1）化學(xué)成鍵導(dǎo)致非共振增強(qiáng)（Chemical bonding enhancement， CB）；2）表面絡(luò)合物共振增強(qiáng)（Surface complexes enhancement， SC）； 3）光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移的共振增強(qiáng)（Photoninduced charge transfer enhancement， PICT）[30-32]。 化學(xué)增強(qiáng)產(chǎn)生的增強(qiáng)因子在10～100[33]。 SERS信號強(qiáng)度很大程度上取決于檢測基底的材質(zhì)、形貌、尺寸以及基底與分子之間的吸附特性[34]。 因此，SERS檢測基底的獨(dú)特性設(shè)計(jì)不僅是拉曼信號強(qiáng)度的關(guān)鍵，同樣是SERS基底研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

在生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，SERS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于血液檢測并在癌癥早期診斷中發(fā)揮重要的作用[35-37]。面對檢測成分復(fù)雜、動態(tài)變化大和個體差異明顯的血液，如何合理化地設(shè)計(jì)增強(qiáng)基底成為關(guān)鍵。 隨著納米技術(shù)和激光雕刻技術(shù)不斷進(jìn)步，各類型的納米增強(qiáng)基底不斷涌現(xiàn)，促使SERS的檢測能力大幅提升。 基于此，本文對近年來在血液檢測中所用的SERS增強(qiáng)基底按組成進(jìn)行了詳盡分類，重點(diǎn)闡述其在血液檢驗(yàn)中的設(shè)計(jì)方法及具體應(yīng)用，基于本綜述的討論，將為SERS在血液檢驗(yàn)中的基底設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供借鑒。

1 SERS基底分類

SERS的基底根據(jù)材質(zhì)分類主要包括金屬基底半導(dǎo)體基底以及非金屬基底[28]。 其中，常見的金屬材料有金銀等貴金屬、堿金屬以及過渡金屬[38-40]； 常見的半導(dǎo)體基底有二氧化鈦（TiO2）和氧化鋅（ZnO）等[32]； 非金屬材料常見有石墨烯等[41]。 根據(jù)是否使用探針標(biāo)記物，可以分為無標(biāo)簽SERS基底和有標(biāo)簽SERS基底[42]。 其中，待檢測生物分子靠近無標(biāo)簽SERS基底中納米粒子時，可以展現(xiàn)其固有指紋譜[43]。方便快捷且信息量大，但從總體分子信息中提取某些低濃度物質(zhì)的信號仍是一項(xiàng)艱巨任務(wù)。 相反，有標(biāo)簽SERS基底表面通常被抗體或其他配體功能化修飾，當(dāng)配體與待測生物分子靶向結(jié)合后，基底上攜帶的報(bào)告分子就會發(fā)出強(qiáng)烈的拉曼信號[44]，從而特異性地表達(dá)待測物信息，實(shí)現(xiàn)微量物質(zhì)的有效檢測。 因此，有標(biāo)簽的SERS基底具有特異性好和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可直接對目標(biāo)分子進(jìn)行定量檢測[14]，但其存在制作工藝復(fù)雜、合成步驟繁瑣及造價昂貴等不足。 據(jù)此可知，SERS的基底設(shè)計(jì)展現(xiàn)出高度的多樣性與豐富性，然而在目前的綜述性文獻(xiàn)中，特別是在血液檢測這一特定領(lǐng)域內(nèi)，關(guān)于SERS基底的全面而細(xì)致的分類工作尚屬空缺。 因此，基于現(xiàn)有的研究報(bào)道，將血液檢測中SERS的基底分為無標(biāo)簽基底及有標(biāo)簽基底兩大類別。 同時根據(jù)應(yīng)用材料的不同將無標(biāo)簽基底細(xì)分為貴金屬、非貴金屬、過渡金屬以及非金屬無標(biāo)簽基底，根據(jù)信號增強(qiáng)方式不同將有標(biāo)簽基底細(xì)分為特異性結(jié)合和特殊結(jié)構(gòu)的有標(biāo)簽基底，最終將SERS增強(qiáng)基底在血液檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究總結(jié)如圖1所示。

2 無標(biāo)簽SERS基底在血液檢驗(yàn)中的設(shè)計(jì)及應(yīng)用

2. 1 常規(guī)構(gòu)型材料應(yīng)用的SERS基底

2. 1. 1 貴金屬納米材料基底的設(shè)計(jì)及應(yīng)用

貴金屬納米顆粒被最早應(yīng)用于SERS增強(qiáng)基底。 貴金屬納米基底的EM增強(qiáng)主要集中在被稱為“熱點(diǎn)”的狹小空間區(qū)域，這些“熱點(diǎn)”區(qū)域內(nèi)的局部電場強(qiáng)度顯著超越外部電場，當(dāng)分子處于“熱點(diǎn)”中，會產(chǎn)生強(qiáng)烈的拉曼散射，進(jìn)而獲得大幅增強(qiáng)的拉曼光譜信號。 研究發(fā)現(xiàn)，這些“熱點(diǎn)”存在于納米顆粒尖銳的尖端、顆粒間的間隙或是其與金屬底板之間的間隙[45]。 目前，在SERS進(jìn)行血液檢測的研究中，貴金屬納米顆粒增強(qiáng)基底的設(shè)計(jì)可歸納為3種。

2.1.1.1 增強(qiáng)基底與待測物的結(jié)合程度

實(shí)驗(yàn)表明，金屬粒子電磁效應(yīng)作用范圍為1～10 nm[46]，與待測物距金屬表面距離的3次方成反比[47-48]，因此應(yīng)盡量增強(qiáng)基底與待測物結(jié)合，以減小待測物與基底的作用距離，從而提高EM效應(yīng)。Barshutin等[21]使用玫瑰花瓣作為模板，在玫瑰花瓣的硅膠復(fù)制品（PDMS）上通過順序沉積和退火工藝，制作了覆蓋有金薄膜和球形金納米顆粒（Au NPs）的微腔凹槽（圖2），該結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)紅細(xì)胞在其表面上的捕獲和固定，能夠?qū)蝹€紅細(xì)胞進(jìn)行研究并檢測細(xì)胞膜氧化的最初跡象，這有助于糖尿病、高血壓和肥胖癥等各種代謝疾病的早期診斷。 Zhang等[49]通過物理刮擦光滑的銀片制成新型銀納米片（Ag NS）基底，該方法制備的Ag NS表面形成多個納米級凹槽結(jié)構(gòu)，保證“熱點(diǎn)”數(shù)目的前提下，巧妙地通過液體的表面張力和重力捕獲葡萄糖分子，提高EM效應(yīng)，使光譜信號增強(qiáng)，在去離子水中對葡萄糖的檢出限達(dá)到0. 5 amol/L，是已報(bào)道的無標(biāo)簽基底SERS檢測的最低檢出限。 在血清中也表現(xiàn)出類似的出色靈敏度，檢出限低至0. 05 fmol/L。

2.1.1.2 增加“熱點(diǎn)”數(shù)目

Shin等[50]將小尺寸的Au NPs離心后涂覆在含有3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）涂層的玻璃板上，APTES可起到固定Au NPs作用，大量緊密排列的Au NPs之間形成了眾多細(xì)小的間隙，每個間隙均可能成為增強(qiáng)信號的“熱點(diǎn)”。 因此，該基底通過增加的“熱點(diǎn)”數(shù)目，使得EM得到提升，得到明顯且強(qiáng)烈的SERS檢測信號。 機(jī)器深度學(xué)習(xí)法分析來自Au NPs增強(qiáng)基底檢測的血漿中外泌體的SERS信號，從人群中成功鑒別出Ⅰ期肺癌的患者，為肺癌患者的早期診斷提供了一種新方法。

2.1.1.3 改變金屬納米顆粒的形狀

改變金屬納米顆粒的形狀可使納米顆粒的表面產(chǎn)生尖銳的尖端，可大幅提升“熱點(diǎn)”的EM強(qiáng)度。Xie等[51]通過種子介導(dǎo)的生長方法合成了尖端大小約為（71. 0±9. 6） nm的金納米星（Au St）（圖3），尖銳的尖端產(chǎn)生近紅外等離子體激元共振，“熱點(diǎn)”的數(shù)目和EM強(qiáng)度均得到提高，從而大幅增強(qiáng)SRES信號強(qiáng)度，利用這一增強(qiáng)基底對目標(biāo)人群的血清進(jìn)行檢測，通過主成分分析與線性判別分析（PCA-LDA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對得到的光譜信號進(jìn)行分析，可以從中精準(zhǔn)篩選乳腺癌患者，其準(zhǔn)確率高達(dá)100%。 近年來，研究人員構(gòu)建了各種形狀的貴金屬納米結(jié)構(gòu)，包括納米顆粒[52]、納米棒[53]、納米花[54]、納米格柵[55]和納米絲[56]，作為電磁場增強(qiáng)的“熱點(diǎn)”源。 這些所謂的“熱點(diǎn)”極大地增強(qiáng)了拉曼信號。

2. 1. 2 非貴金屬材料應(yīng)用的SERS基底

貴金屬對拉曼光譜增強(qiáng)效果好，但其造價昂貴，用于制備貴金屬納米材料的合成工藝（物理沉積、氧化或化學(xué)還原）多繁瑣復(fù)雜[57]。 隨著制備工藝的不斷進(jìn)步，非貴金屬材料SERS基底的設(shè)計(jì)得到了快速發(fā)展。 Premachandran等[58]采用飛秒激光燒蝕物理合成技術(shù)在鎳（Ni）基底上合成了三維鎳-鎳氧化物（Ni-NiO）納米結(jié)構(gòu)（圖4），該結(jié)構(gòu)形成具有鋒利邊緣的納米結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的眾多鋒利邊緣增加了“熱點(diǎn)”數(shù)目，提高了EM強(qiáng)度，大幅提高拉曼光譜信號。 用該納米結(jié)構(gòu)對患者血清進(jìn)行SERS檢測，通過深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)對SERS信號進(jìn)行精準(zhǔn)的分析，發(fā)現(xiàn)所制備的增強(qiáng)基底對腦腫瘤診斷的特異性和敏感性均達(dá)100%。光譜特征峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10%，表明飛秒激光燒灼技術(shù)制作的非貴金屬Ni-NiO基納米基底具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確和高效的疾病診斷能力，同時很好地克服了傳統(tǒng)貴金屬材料制備流程繁瑣及所需耗材價格昂貴的弊端[59]。

盡管非貴金屬的應(yīng)用解決了材料昂貴、制備復(fù)雜的問題，但作為金屬材料，許多情況下產(chǎn)生的局部“熱點(diǎn)”會使血液樣本中生物分子及蛋白質(zhì)降解，導(dǎo)致檢測信息不準(zhǔn)確和樣品重復(fù)差異較大的問題，同時金屬在特定環(huán)境下的催化作用可能產(chǎn)生吸附劑副反應(yīng)，對金屬材料在血液檢驗(yàn)中的應(yīng)用發(fā)起了新的挑戰(zhàn)[60]。

2. 1. 3 半導(dǎo)體材料應(yīng)用的SERS基底

為了提高材料檢測的穩(wěn)定性，生物安全性，減少材料自身對待測物的影響，研究者們正嘗試用硅基半導(dǎo)體作為一種新型增強(qiáng)基底材料來替代現(xiàn)有的金屬材料[61]。 Keshavarz等[62]通過多光子電離硅（Si）芯片制備了二氧化硅（SiO2）量子探針（Si@SiO2 Q-probe），該探針外部的SiO2層可通過化學(xué)吸附生物分子來增強(qiáng)電荷轉(zhuǎn)移，提高了CM強(qiáng)度，使其拉曼散射信號增強(qiáng)，加之其分布均勻、無細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，成為可以維持細(xì)胞活性的細(xì)胞內(nèi)探針。 Golubewa等[63]使用微核陣列在黑硅（bSi）表面形成了金字塔結(jié)構(gòu)的蝕刻硅圖案，隨后在bSi上覆蓋一層Au等離子體，在785 nm激發(fā)波長下，制備的bSi/Au基底的SERS增強(qiáng)因子高達(dá)了驚人的1×108。 Hu等[64]采用飛秒激光直寫技術(shù)在大面積硅表面誘導(dǎo)嵌套納米孔、納米溝和納米島的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，作為控制Au納米薄膜固態(tài)去濕的模板。 涂有Au納米膜的圖案化硅表面在高溫下進(jìn)行熱潤濕，從而形成分布在圖案化硅表面上的致密Au-NPs，這為Au等離子體“熱點(diǎn)”提供了更大的表面積作為載體，從而大大增強(qiáng)了局域電場強(qiáng)度，為拉曼信號增強(qiáng)提供了可能性。 目前，硅基材料在血液檢測中常作為基底材料的表層涂層使用，發(fā)揮其良好的生物相容性和檢測功能。 單純使用硅基材料用作增強(qiáng)基底的設(shè)計(jì)目前尚處于空白狀態(tài)，其原因可能與其拉曼信號EM效果不佳有關(guān)，同時也存在工藝復(fù)雜、制作器械門檻高等不足，目前仍處于探索階段。

2. 1. 4 非金屬材料應(yīng)用的SERS基底

金屬材料增強(qiáng)基底有良好的拉曼光譜信號增強(qiáng)能力，而生物安全性、生物毒性及制作成本不利于其在血液檢測中應(yīng)用，半導(dǎo)體及非金屬材料因其具有良好的生物安全性，低生物毒性及化學(xué)惰性等適合在血液復(fù)雜的環(huán)境中使用而保持穩(wěn)定，但其拉曼光譜信號的增強(qiáng)能力較低，限制了其發(fā)展。 對于非標(biāo)簽增強(qiáng)基底檢測血液生物樣品而言，任何一種金屬、半導(dǎo)體和非金屬材料的單獨(dú)使用或許均不是最佳選擇，應(yīng)將二者巧妙的結(jié)合起來，以增強(qiáng)光譜信號同時提高生物相容性。

石墨烯材料由于具有理想的二維平面結(jié)構(gòu)、芳香性、疏水性和化學(xué)惰性等性質(zhì)而成為理想的非金屬SERS基底材料[65]。 目前，常見的制備方法包括將石墨烯薄片轉(zhuǎn)移到金屬納米顆粒表面或使用石墨烯包裹納米顆粒，Li等[66]制備了一種穩(wěn)定的石墨烯包裹的金銀納米合金（GAA），其金銀核心被限制在多層石墨烯球殼中，作為細(xì)菌檢測和治療的多功能平臺。 石墨烯的封裝保證了金銀核心良好的穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步保證了其穩(wěn)定的SERS信號和光熱性能。 但石墨烯與金屬納米顆粒之間以物理結(jié)合為主，因此金屬納米顆粒和石墨烯之間很難形成緊密的結(jié)構(gòu)。 石墨烯和金屬納米顆粒之間的空間、懸浮的石墨烯及皺褶的石墨烯結(jié)構(gòu)均不可避免地導(dǎo)致EM增強(qiáng)效果的損失。 為此，Xu等[67]使用化學(xué)氣相沉積方法在銅納米顆粒（CuNPs）表面直接生長出了單層石墨烯，形成了單層石墨烯嚴(yán)密包裹的Cu納米顆粒（G/CuNPs）增強(qiáng)基底。 石墨烯提供了原子級厚度、無縫包裹且具有化學(xué)惰性的網(wǎng)，防止Cu發(fā)生氧化的同時還具有富集和固定待測物分子的作用，提高CM增強(qiáng)信號的同時不影響Cu納米顆粒的EM增強(qiáng)信號，實(shí)現(xiàn)了一舉兩得之效。 Xu等用G/CuNP增強(qiáng)基底成功從人血清中檢測到極低濃度的腺苷分子信號（血清中腺苷的最低檢測濃度低至5 nmol/L）， 這種增強(qiáng)基底的巧妙設(shè)計(jì)為與腺苷相關(guān)疾病的早期診斷提供了借鑒。 相較于多層石墨烯，單層石墨烯展現(xiàn)出更好的基底金屬顆粒吸附能力，并能夠?qū)崿F(xiàn)更強(qiáng)的信號因子增強(qiáng)效果[68-69]。 對此，Li等[70]研究表明，在傳統(tǒng)SERS基底中通過化學(xué)氣相沉積法添加高質(zhì)量單層石墨烯可將羅丹明6G的檢測限（LOD）提高到10-14 mol/L。 但石墨烯材料的具體應(yīng)用仍需借助金屬納米顆粒來增強(qiáng)光譜信號，其自身信號增強(qiáng)能力仍有不足，制作成本及制作工藝仍較復(fù)雜，這均限制了其在血液檢測中的實(shí)際應(yīng)用。

2. 2 特殊構(gòu)型材料應(yīng)用的SERS基底

無標(biāo)簽SERS基底的設(shè)計(jì)逐漸的從傳統(tǒng)貴金屬材料向金屬-非金屬材料聯(lián)合應(yīng)用上過渡，隨著創(chuàng)新性設(shè)計(jì)方案的不斷涌現(xiàn)，SERS基底從平面化設(shè)計(jì)逐漸走向了立體3D設(shè)計(jì)，這特殊設(shè)計(jì)賦予基底更多可控的變化和更加精細(xì)的篩選，從而帶來更加精準(zhǔn)、高效的檢測結(jié)果。 Xu等[71]提出的超薄熱響應(yīng)聚合物（N-異丙基丙烯酰胺）-石墨烯-Ag納米顆?；旌匣?，N-異丙基丙烯酰胺在溫和升溫至37 ℃過程中可誘導(dǎo)基底材料自折疊，石墨烯將N-異丙基丙烯酰胺與Ag納米顆粒分開，以利于Ag納米顆粒能提供更加清晰的SERS光譜信號。 該基底可以充分包裹柔軟或不規(guī)則形狀的3D生物樣品，因此對于紅細(xì)胞形態(tài)異常類疾病而言，如遺傳性鐮狀紅細(xì)胞貧血、珠蛋白生存障礙性貧血等，可通過該基底包裹紅細(xì)胞后檢測SERS信號來快速和選擇性的繪制異常紅細(xì)胞表面，為血液疾病的快速診斷提供了另一種思路。 除紅細(xì)胞形態(tài)與疾病密切相關(guān)外，血液中外泌體也是很多疾病的特征性標(biāo)志物，Dong等[72]設(shè)計(jì)了一種類似于天然蜂巢結(jié)構(gòu)的鍍Au-二氧化鈦（TiO2）大孔蛋白石（MIO）基底（Au-coated TiO2 MIO）。 在硅片上制備由多層密排聚苯乙烯（PS）球組成的PS MIO模板。 隨后，將TiO2的溶膠溶液滲透到PS模板的間隙中后退火即獲得TiO2 MIO結(jié)構(gòu)。 隨后，將Au薄膜熱蒸發(fā)到TiO2 MIO結(jié)構(gòu)的頂層，獲得蜂巢狀六邊形結(jié)構(gòu)Au-coated TiO2 MIO基底（圖5）。 其中，Au薄膜充分保證了EM強(qiáng)度，TiO2 MIO結(jié)構(gòu)中相互連接的納米級孔隙網(wǎng)絡(luò)成為分離血液中外泌體的理想陷阱，可簡單且有效的捕獲外泌體以減少血液中其他復(fù)雜成分對光譜信號的干擾并提高CM強(qiáng)度。 TiO2 MIO特殊的六邊形蜂巢結(jié)構(gòu)具有可降低光速的“慢光效應(yīng)”，這種效應(yīng)使光子與待測物質(zhì)充分作用，顯著提高了SERS信號。 該基底的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了可靠的腫瘤血液活檢，對于體外癌癥快速預(yù)篩選展現(xiàn)出巨大的臨床應(yīng)用潛力。 因此，對于特殊構(gòu)型基底而言，其獨(dú)特的孔徑、結(jié)構(gòu)等均可作為血液中不同成分的篩選器或捕獲器，在增加SERS信號強(qiáng)度同時有效避免血液中復(fù)雜成分帶來的信號干擾。

3 有標(biāo)簽SERS基底在血液檢驗(yàn)中的設(shè)計(jì)及應(yīng)用

3. 1 SERS基底特異性結(jié)合方式

血液檢驗(yàn)中，相較于無標(biāo)簽基底，有標(biāo)簽基底在基底材料的選擇及聯(lián)合應(yīng)用等方面均更加簡單，但待測物與基底發(fā)生特異性結(jié)合是有標(biāo)簽基底的關(guān)鍵所在，目前在血液檢測研究中，常見的待測物與基底發(fā)生特異性結(jié)合方式可歸納為以下3種。

3. 1. 1 抗原-抗體特異性結(jié)合

目前，鑒定傳染源的主要技術(shù)仍是微生物培養(yǎng)，但需要24～72 h才能對常見感染做出最終診斷，臨床快速診斷的需求無法滿足。 為此，Pazos-Perez等[73]在球形Ag NP上使用羧酸官能團(tuán)偶聯(lián)細(xì)菌抗體，檢測時血液中細(xì)菌能與抗體特異性結(jié)合并聚集在Ag NP上，將檢測時間縮短至13 min，為菌血癥的快速診斷提供了新的思路。 但當(dāng)血液中細(xì)菌濃度過低時，發(fā)生特異性結(jié)合的Ag NP數(shù)量較少，且散在分布，檢測限受到影響。 對此，Sebba等[74]充分利用了磁性吸附特性，將埃博拉病毒的特異性抗體VP40封裝在金-SiO2核殼材料之間，同時加入封裝VP40的磁性顆粒，埃博拉病毒可同時與該基底和磁性顆粒發(fā)生特異性結(jié)合，共同形成的磁性微粒結(jié)構(gòu)，通過磁力作用在容器的側(cè)壁發(fā)生富集（圖6）。 對側(cè)壁的磁體直接進(jìn)行SERS檢測，發(fā)現(xiàn)對埃博拉病毒檢測的靈敏度為90. 0%，特異性為97. 9%，準(zhǔn)確率為96. 6%。 該檢測方法只需加入血液即可進(jìn)行檢測，這種創(chuàng)新的磁力富集設(shè)計(jì)，可以彌補(bǔ)抗原-抗體結(jié)合能力不足問題，也為傳染性疾病的血液檢測提供了更加安全且便捷的新思路。

3. 1. 2 化學(xué)鍵特異性結(jié)合

除抗原-抗體的特異性結(jié)合外，待測物與增強(qiáng)基底還可以通過化學(xué)鍵進(jìn)行特異性結(jié)合。 Muhammad等[75]將有機(jī)氰化物分子（4-巰基苯甲腈，MBN）通過Ag—S化學(xué)鍵錨定在Ag NPs上。血紅蛋白（Hb）中的血紅素可與MBN中的—C≡≡N鍵相互作用，使得Hb聚集在基底表面，實(shí)現(xiàn)SERS信號增強(qiáng)。 該增強(qiáng)基底檢測限為0. 46 μg/mL，可用來快速診斷貧血患者。 利用化學(xué)反應(yīng)，將待測物與增強(qiáng)基底進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，既可以簡化基底制作過程又可保證SERS強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)疾病的快速特異性響應(yīng)。 但其對待測物本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有一定的要求，相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)會對結(jié)果產(chǎn)生影響，待測血液溫度、pH值等外界因素均會影響最終結(jié)果。 如何提高穩(wěn)定性，排除其他類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響是這類基底設(shè)計(jì)首要考慮的問題。

3. 1. 3 靜電吸引特異性結(jié)合

Gao等[76]用帶負(fù)電的Ag NPs和氧化石墨烯（GO）在正極電解質(zhì)聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）的作用下靜電相互作用結(jié)合，生成較強(qiáng)正電荷的GO/PDDA/Ag NPs并通過化學(xué)鍵合到微結(jié)構(gòu)中空纖維（MHF）內(nèi)特有的懸浮核上，以增強(qiáng)拉曼信號。 當(dāng)待測血液樣品流過MHF內(nèi)部的通道時，正電荷較強(qiáng)的GO/PDDA/Ag NPs基底可以將膽紅素分子從白蛋白中分離出來，并通過靜電力與膽紅素分子結(jié)合，以達(dá)到剝離和富集膽紅素分子的目的。 結(jié)果表明，白蛋白中膽紅素、人血液中膽紅素的檢測濃度范圍均在2～100 μmol/L內(nèi)，且均具有良好的線性響應(yīng)， 檢測限達(dá)到1×10-6 mol/L， 為臨床上準(zhǔn)確診斷黃疸及相關(guān)疾病提供了廣闊的前景。

3. 2 有標(biāo)簽SERS基底的特殊結(jié)構(gòu)

三明治結(jié)構(gòu)在SERS有標(biāo)簽基底中應(yīng)用廣泛。 一般由3部分組成： 1）與增強(qiáng)底物連接的捕獲探針；2）檢測目標(biāo)； 3）SERS信號報(bào)告器。 前二者與特異性結(jié)合的基底設(shè)計(jì)類似，其特點(diǎn)在于SERS信號報(bào)告器上，不僅可以放大信號，還可以在特殊區(qū)域產(chǎn)生信號，以克服血液中生物分子干擾，SERS信號報(bào)告器設(shè)計(jì)可分為以下2種。

3. 2. 1 信號增強(qiáng)的SERS信號報(bào)告器

Chen等[77]在Au核表面利用以4-巰基苯甲腈（4-MBN）為錨點(diǎn)誘導(dǎo)Ag原子均勻沉積，合成了Au@4-MBN@Ag納米粒子報(bào)告器。 該報(bào)告器不僅用4-MBN錨點(diǎn)極大地增強(qiáng)了SERS光譜信號，并且4-MBN在拉曼信號沉默窗口（1800～2800 cm？1）中具有特征峰，以克服血漿中非檢測生物分子的信號干擾（圖7）。 該增強(qiáng)基底對早期肺癌生物性標(biāo)志物miRNA-21檢測限低至0. 1 fmol/L，通過臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ⅰ期和Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者血漿中的miRNA-21水平顯著高于健康人。 這種獨(dú)特的SERS基底設(shè)計(jì)為檢測血漿中微量miRNA提供了一種超靈敏的方法。

3. 2. 2 “信號關(guān)閉”的SERS信號報(bào)告器

研究者發(fā)現(xiàn)不僅可以利用拉曼光譜的“信號出現(xiàn)”來檢測物質(zhì)，還可以利用拉曼光譜的“信號關(guān)閉”對待測物實(shí)現(xiàn)定量檢測。 亞甲基藍(lán)（MB）作為一種有機(jī)染料，具有良好的可見光吸收性能。 Zhao等[78]將前列腺特異性抗原適配子（PSA Apt）固定在基底上。 MB作為一種新穎的SERS信號報(bào)告器特異性吸附于PSA Apt上，此時形成的三明治結(jié)構(gòu)具有最強(qiáng)的SERS信號強(qiáng)度。 當(dāng)血液中存在前列腺特異性抗原（PSA）時，PSA與PSA Apt發(fā)生特異性結(jié)合，致使 PSA Apt與MB從基底脫落，SERS中MB信號強(qiáng)度降低。 最終通過降低的信號強(qiáng)度來計(jì)算待測物中PSA的量。 該增強(qiáng)基底的設(shè)計(jì)具有較高的光譜重現(xiàn)性、選擇性和靈敏度，并成功地測定了前列腺癌癥患者血清樣品中PSA的表達(dá)水平，顯示出巨大的臨床診斷潛力。 但該方法制備的增強(qiáng)基底中，SERS信號報(bào)告器最初的結(jié)合率和最終的脫離率會受到周圍環(huán)境、檢測手法及檢測時間等各種因素影響，材料自身的差異性較大，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性還有待評估。

4 結(jié)論與展望

SERS具有高靈敏、快速檢測及水分子弱拉曼響應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已在生物傳感、藥品鑒定、環(huán)境檢測和文物勘測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 面對復(fù)雜多變且個體差異較大的血液環(huán)境時，SERS的基底制備成為關(guān)鍵。基底的材料、形貌、結(jié)構(gòu)及吸附能力等均會對SERS增強(qiáng)效果產(chǎn)生影響。 本文主要對在血液檢驗(yàn)中現(xiàn)有的增強(qiáng)基底進(jìn)行歸納并分別闡述了不同類型增強(qiáng)基底的具體應(yīng)用。 盡管各類基底種類繁多，但面對復(fù)雜的血液環(huán)境，研發(fā)出具有高穩(wěn)定性、高重復(fù)性和高敏感性且生物相容性好的基底一直是熱點(diǎn)問題。無標(biāo)簽基底中，更注重材料選擇、工藝提升以及生物相容性等方面，并通過高效準(zhǔn)確的光譜數(shù)據(jù)分析算法，從龐大繁雜的生物光譜數(shù)據(jù)中，發(fā)掘潛在的信號差異。 以達(dá)到快速準(zhǔn)確的判斷出疾病狀態(tài)。 有標(biāo)簽基底使拉曼光譜分析從定性分析走向定量分析，可實(shí)現(xiàn)對疾病代表性標(biāo)志物進(jìn)行檢測，提高檢測的靈敏性及特異性。 因此，在有標(biāo)簽基底中，更注重特異性結(jié)合部分的設(shè)計(jì)以及已結(jié)合部分的充分富集，這也使得基底的制作過程更加復(fù)雜，基底存儲和臨床轉(zhuǎn)化有更高的要求。

雖然目前表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)在眾多領(lǐng)域已經(jīng)有了長足發(fā)展，但在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中更多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，基底設(shè)計(jì)作為拉曼光譜臨床應(yīng)用的短板，今后研究可將重點(diǎn)放在以下方面： 1）保證拉曼信號增強(qiáng)效果的同時尋找生物相容性更好、更穩(wěn)定的新材料來替代毒性較大、價格昂貴的貴金屬顆粒；2）發(fā)展光譜數(shù)據(jù)AI算法，雖然血液檢測中SERS信號可能有幾個明顯尖峰，但其成分復(fù)雜，目前對細(xì)微信號差異性捕捉，直接分析波長強(qiáng)度和位移仍有困難，這需要利用AI技術(shù)建立血液相關(guān)疾病診斷模型，將SERS光譜信號可以立即轉(zhuǎn)化為可讀的臨床標(biāo)準(zhǔn)； 3）降低有標(biāo)簽基底的制作難度及制作成本，明確血液檢驗(yàn)中某一疾病的特異性標(biāo)志物，在此基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化基底的特異性結(jié)合設(shè)計(jì)，達(dá)到降低成本且長期儲存的目的； 4）擴(kuò)大臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在更大的臨床實(shí)驗(yàn)中具體驗(yàn)證SERS基底的實(shí)用性能，聯(lián)合基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、光譜學(xué)研究者和臨床醫(yī)生共同合作，為疾病診斷的可靠性提供支持。 隨著技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，無標(biāo)簽基底應(yīng)聚焦于非金屬材料與金屬材料聯(lián)合應(yīng)用，提高生物安全性同時保證光譜信號強(qiáng)度。 此外，提高基底制作技術(shù)如： 飛秒技術(shù)、慢光效應(yīng)等來發(fā)展過渡金屬及非金屬基底也是值得探索的另一方向。有標(biāo)簽基底中，化學(xué)及靜電結(jié)合可能是擺脫抗體基底易失活不易長期儲存的新途徑，同時，應(yīng)注重已發(fā)生特異性結(jié)合產(chǎn)物的富集，保證SERS信號的最大化捕捉。

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Substrate Design of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy and Research Progress in the Detection of Body Fluids

CAI Yun-Fan1，2， XU Ke-Hui2， ZHAO Yao2， LI Zhi-Ting1，2， XIA Ling-Yun1， WANG Chen-Yu2，LUO Zhi-Xiao1*， NIU Li-Na2*

（1Department of Stomatology， Taihe Hospital， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China） 2（Department of Prosthodontics， School of Stomatology， Air Force Medical University， Shaanxi Key Laboratory of Stomatology， National Clinical Research Center for Oral Diseases， State Key Laboratory of Oral Maxillofacial Reconstruction and Regeneration， Xi’an 710032， China）

Abstract Surface enhanced Raman spectroscopy （SERS） has been extensively studied in the field of medical testing due to its unique advantages of rapid detection， high sensitivity， low detection limits and non-destructive analysis. The successful construction of SERS substrates is essential for realizing these benefits. In this paper，the enhancement mechanism of SERS is introduced， the design of its enhanced substrate in blood detection is categorized and discussed. It is divided into two categories： label-free substrates and label substrates， and further subdivided according to different material applications and substrate design methods. A review of relevant literature on the application of SERS detection in blood testing in recent years， summarizes the design methods and application characteristics of different types of enhanced substrates in blood testing. Finally， the design of SERS-enhanced substrate in blood examination is summarized and prospected.

Keywords Surface-enhanced Raman spectroscopy； Enhancement mechanism； Label-free substrate； Label substrate； Blood testing

Received 2024？07？01； Accepted 2024？11？20

Supported by the Shaanxi Key Scientific and Technological Innovation Team （No. 2020TD-033） and the National Clinical Research Center for Oral Diseases （No. LCB202209）