半夏瀉心湯含藥血清對胃癌細胞增殖影響的時效及量效關(guān)系研究

摘要：采用中藥血清藥理學(xué)方法，觀察半夏瀉心湯（Banxiaxiexin Decoction，BXD）含藥血清對不同胃癌細胞體外增殖的影響，并探討用于胃癌細胞藥效觀察的BXD含藥血清制備條件。將BXD高、中、低灌胃后30、60、90、120、150 min采血，制備含藥血清。根據(jù)灌胃劑量和采血時間對MGC803、MKN45、AGS和HGC27細胞分別設(shè)5%～50%含藥血清組，采用CCK8檢測不同灌胃劑量、不同采血時間、不同體積分數(shù)的BXD含藥血清對胃癌細胞抑制增殖的作用。實驗結(jié)果顯示，與其他時間點相比， BXD含藥血清均在采血時間120 min時對胃癌細胞的抑制增殖作用最強；與BXD低劑量組相比，BXD中劑量組對胃癌細胞的抑制增殖作用強，且與BXD高劑量組無顯著性差異。BXD中劑量組灌胃120 min后采血的含藥血清按照5%～50%的10個濃度梯度，分析對不同胃癌細胞的抑制作用其IC50值均為20%。不同灌胃劑量、不同采血時間和不同體積分數(shù)的含藥血清對不同胃癌細胞的抑制作用，均顯示BXD中劑量組，采血時間120 min和20%的體積分數(shù)對胃癌細胞的抑制作用最強。由此，BXD中劑量組灌胃，采血時間120 min，體積分數(shù)為20%的含藥血清對胃癌細胞的藥效作用最好。

關(guān)鍵詞：半夏瀉心湯含藥血清；胃癌；細胞增殖；中藥血清藥理學(xué)；時效；量效

中圖分類號：R285""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1002-4026（2025）01-0009-14

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標志碼（OSID）：

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20240035【藥理與毒理】

收稿日期：2024-03-07

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（2016CYJS08A01-6）；山東中醫(yī)藥大學(xué)首批科研創(chuàng)新優(yōu)秀團隊（220316）；國家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點學(xué)科中醫(yī)基礎(chǔ)理論學(xué)科；山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點實驗室

作者簡介：祖國秀（1994—），女，方劑學(xué)博士。研究方向為復(fù)方作用機理與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel： 13553165270，E-mail：13553165270@163.com

*通信作者，韓濤（1962—），男，博士生導(dǎo)師，研究方向為方劑臨床應(yīng)用與療效客觀化研究，復(fù)方作用機理與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel：13605318664，E-mail： ht60012002@163.com

Time-effect and dose-effect relationship study on the effect of Banxiaxiexin

Decoction-containing serum on the proliferation of gastric cancer cells

ZU Guoxiu1， LIU Xijian1， ZU Xiuli2， TANG Jiqin3， HUANG Hailiang3， HAN Tao1*

（1.Department of Traditional Chinese Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China;

2.Department of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan， 250355， China;

3. Department of Rehabilitation Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355，China）

Abstract∶The pharmacological method of traditional Chinese medicine serum was used to explore the effect of Banxiaxiexin Decoction （BXD） on the proliferation of different gastric cancer cells in vitro. Additionally，the preparation conditions of BXD drug-containing serums were examined toobserve the pharmacodynamics of gastric cancer cells. Blood was collected at intervals of 30， 60， 90， 120， and 150 minutes after high， medium， and low intragastric gavage of BXD to prepare drug-containing serums. Based on the selected gavage doses and blood collection times， MGC803， MKN45， AGS， and HGC27 cells were exposed to 5%～50% concentrations of drug-containing serum， and CCK8 assay was employed to detect the inhibitory effects of different gavage doses， blood collection times， and volume fractions of BXD drug-containing serum on the proliferation of gastric cancer cells. The test results showed that compared with other time points， all BXD drug-containing serums had the strongest inhibitory effect on gastric cancer cells at the blood collection time of 120 minutes. Compared with the low-dose BXD group， the medium-dose BXD group had a strong inhibitory effect on gastric cancer cells， and there was no significant difference between the medium-dose and high-dose BXD groups. Based on the analysis of the inhibitory effects of 10 concentrations ranging from 5% to 50% on different gastric cancer cells， the IC50 values of all drug-containing serums collected 120 minutes after gavage in the medium-dose BXD group were 20%. Analysis of the inhibitory effects of different gavage doses， blood collection times， and volume fractions on different gastric cancer cells revealed that a medium dose of BXD， blood collection time of 120 minutes，and a volume fraction of 20% had the strongest inhibitory effect on gastric cancer cells. Therefore， the medicated serum with a blood collection time of 120 minutes and a volume fraction of 20% in the medium-dose BXD group had the best pharmacodynamic effect on gastric cancer cells.

Key words∶Banxiaxiexin Decoction-containing serum; gastric cancer; cell proliferation; Chinese medicine serum pharmacology; time-effect;dose-effect

以血清藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)的體外實驗是研究中藥藥效機制最常見的研究方法，整個實驗操作對中藥的含藥血清濃度篩選是最關(guān)鍵的實驗步驟，對后續(xù)的實驗分組數(shù)量和藥效機制具有重要作用。影響中藥最佳含藥血清體積分數(shù)主要有中藥灌胃劑量、采血時間和血清濃度梯度3個方面，本研究基于中藥灌胃劑量、采血時間和含藥血清體積分數(shù)3個方面進行血清藥理學(xué)實驗，以期為臨床前中藥藥效機理研究提供指導(dǎo)方向。

既往臨床研究發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯（Banxiaxiexin decoction，BXD）能夠有效逆轉(zhuǎn)胃癌前病變發(fā)展［1-2］，促進胃癌患者術(shù)后康復(fù)［3-4］，增強胃癌化療敏感性，減輕化療不良反應(yīng)［5-6］等作用，為進一步探討B(tài)XD在胃癌中的作用機制其防治，摸索該方在體外研究中含藥血清抑制胃癌細胞增殖的最佳時效和量效關(guān)系。本研究將不同劑量的BXD藥液灌胃Wistar大鼠，不同時間點采集大鼠血清，按不同體積分數(shù)添加至胃癌細胞中，以探討B(tài)XD含藥血清對人胃癌細胞增殖影響的時效和量效關(guān)系，旨在為該方的進一步血清藥理學(xué)實驗打下基礎(chǔ)。

1" 實驗材料

1.1" 實驗動物與細胞

6周齡SPF級Wistar大鼠50只，體質(zhì)量（180～220 g），由北京維通利華動物實驗技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2021-0006。于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（26±2）℃、濕度 （50±10）%，光照明/暗周期12 h/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始動物實驗。動物實驗通過了山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查（批準號：SDUTCM20230828016）。

人胃癌細胞HGC27、MKN45和 AGS 購自于上海安為生物科技有限公司。人胃癌MGC803細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞資源中心，于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心培養(yǎng)、傳代。培養(yǎng)條件為HGC27：89% DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素；MKN45和MGC803：89%1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素；AGS：89% F12K培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素。4種培養(yǎng)基均置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2" 實驗藥物

清半夏（批號：2301002）34.5 g，黃芩（批號：230402）41.4 g，干姜（批號：230401）41.4 g，人參（批號：2305004）41.4 g，炒甘草（批號：230303）41.4 g，黃連（批號：230401）13.8 g，大棗（批號：230301）36 g。上述藥材均購自安國市安興中藥飲片有限公司，所有藥材均通過國家有關(guān)部門質(zhì)檢。

1.3" 實驗試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（批號： 11875093）、DMEM培養(yǎng)基（批號：11965118）、F12K培養(yǎng)基（批號：21127030）、青-鏈霉素溶液（批號：15140122）、0.25%胰酶（批號：25200056）均購自Gibco公司，胎牛血清（批號：13011-8611）購自杭州四季青生物有限公司，CCK8試劑盒（批號：C0038）購自碧云天生物科技有限公司。

1.4" 實驗儀器

熒光倒置顯微鏡（型號：BX43）購自O(shè)LYMPUS，CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（型號：8000水套式）購自美國Thermo公司，酶標儀（型號：LabsystemsMultiskan MS352）購自芬蘭，高速離心機（型號：Icen-24R）購自杭州奧盛，超凈工作臺（型號：SW-CJ-1D）購自蘇州凈化。

2" 實驗方法

2.1" 實驗藥物制備

將半夏瀉心湯中七味中藥飲片加水2 000 mL，煮取1 200 mL，去藥渣，再濃縮至600 mL，生藥量3.57 g/kg，按照人與大鼠體表換算后BXD低、中、高劑量組分別按照11.25、22.50、45.00 g/kg劑量灌胃，每日2次，連續(xù)3 d。

2.2" 含藥血清制備

將50只Wistar大鼠隨機分為空白組（20只），BXD低劑量組（10只），BXD中劑量組（10只），BXD高劑量組（10只），經(jīng)人-大鼠體表面積比值折算大鼠的BXD低、中、高給藥量分別是11.25、22.50、45.00 g/kg，每次2 mL，每日2次，空白組給予等量的蒸餾水，連續(xù)3 d。各組大鼠再隨機分為5組，每組2只，分別于末次給藥后的30、60、90、120、150 min，無菌條件下腹主動脈取血，4 ℃冰箱靜置2 h后3 500 r/min15 min取上清，同組混合，對血清進行56 ℃水浴，30 min滅活，經(jīng)0.22 μm針頭微孔濾器過濾除菌，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3" BXD含藥血清不同灌胃劑量對胃癌細胞增殖的影響

采用CCK8法，取對數(shù)生長期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細胞以5 000個/孔接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄舊培養(yǎng)基，按照分組設(shè)置，加入相應(yīng)的同一時間點的不同灌胃劑量（低、中、高劑量組）的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL每孔，孵育24 h后，每孔加入

10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處光密度（optical density，OD）值。細胞增殖率公式如下所示：

細胞增殖率=［（實驗組OD值-溶劑對照組OD值）／（空白組OD值-溶劑對照組OD值）］×100%。

最佳中藥含藥血清濃度篩選通過設(shè)置多組不同中藥劑量進行動物灌胃，同一時間采血，每組中藥血清濃度相同干預(yù)細胞，將動物隨機分為空白組、BXD低劑量組、BXD中劑量組、BXD高劑量組。3組中藥組分別給予人動物等效劑量的0.5倍、1倍、2倍灌胃，連續(xù)3 d后采血，離心取血清后于胃癌細胞進行細胞增殖檢測。實驗流程圖見圖1。

2.4" BXD含藥血清不同采血時間對胃癌細胞增殖的影響

采用CCK8法，取對數(shù)生長期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細胞以5 000個/孔接種于96孔板中，24 h后更換為含藥血清的培養(yǎng)基。孵育結(jié)束后棄去舊培養(yǎng)液，按照分組設(shè)置，加入相應(yīng)的同一灌胃劑量的不同采血時間（30、60、90、120、150 min）的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL/孔，孵育24 h后，其余部分同2.3。

口服中藥在體內(nèi)藥代動力學(xué)過程包括吸收、分布、代謝和排泄等方面，大部分藥物在動物體內(nèi)是按照藥物動力學(xué)消除，因此在動物灌胃后，體內(nèi)血藥濃度隨時間推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢［7］，最理想的采血時間是血藥濃度達峰值時采血，由于受動物品種、藥物及給藥次數(shù)等影響，采血時間亦不同，因此實驗選用相同中藥劑量給藥后，動物體內(nèi)在不同時間段含有不同的含藥濃度進行采血，從而篩選出最佳采血時間。本實驗將制備BXD含藥血清的動物隨機分為BXD組和空白組，中藥組分灌胃后的30、60、90、120、150 min采血，將含藥血清和空白血清以相同的體積分數(shù)干預(yù)胃癌細胞進行細胞增殖檢測。實驗流程圖見圖2。

2.5" BXD含藥血清不同體積分數(shù)對胃癌細胞的增殖的影響

以不同灌胃劑量和不同采血時間的BXD含藥血清分別干預(yù)胃癌細胞后篩選其最佳的灌胃濃度和采血時間，隨后根據(jù)選定的BXD灌胃劑量和采血時間進行BXD含藥血清半抑制濃度梯度篩選。設(shè)空白血清組、溶劑對照組、BXD給藥組，每組5復(fù)孔，重復(fù)3次。BXD組設(shè)置10個濃度梯度，分別是體積分數(shù)5%BXD＋45%空白血清，10%BXD＋40%空白血清，15%BXD＋35%空白血清，……，45%BXD＋5%空白血清，50%BXD；空白組加入50%空白血清。

取對數(shù)生長期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細胞以5 000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)液，按照分組設(shè)置，加入相應(yīng)的不同體積分數(shù)的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL/孔，分別孵育24 h、48 h和72 h后，其余部分同2.3。

最佳中藥含藥血清濃度篩選方法通過只設(shè)置1組中藥劑量進行動物灌胃，取得的含藥血清稀釋成不同體積分數(shù)進行干預(yù)細胞，將制備的BXD含藥血清分為溶劑對照組、空白對照組及體積分數(shù)為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%含藥血清溶液共10組，每組5個復(fù)孔，重復(fù)3次，干預(yù)一定時間后進行CCK8法進行檢測細胞活率，計算最佳半抑制濃度IC50，以此篩選出最佳含藥血清濃度。具體流程見圖3。

2.6" BXD不同灌胃劑量、采血時間和體積分數(shù)對胃癌細胞增殖的影響

根據(jù)實驗要求，取對數(shù)生長期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細胞以5 000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)液，按照分組設(shè)置，加入不同灌胃劑量（BXD高、中、低劑量組），不同采血時間（30、60、90、120、150 min），不同體積分數(shù)（10%和20%）的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL/孔，孵育48 h后，其余部分同2.3。

最佳中藥含藥血清濃度的篩選方法通過設(shè)置多組不同中藥劑量進行動物灌胃，再不同時間采血，每組中藥血清按照不同體積分數(shù)進行干預(yù)細胞，將制備的BXD含藥血清的動物隨機分成空白組、BXD低劑量組、BXD中劑量組、BXD高劑量組。3組BXD組又分成給藥后30、60、90、120、150 min采血，按照10%和20%的給藥血清進行分組，具體分組信息為10%給藥組：10%含藥血清＋10%空白血清；20%給藥組：20%含藥血清＋0%空白血清；20%空白血清組： 0%含藥血清＋20%空白血清，干預(yù)細胞48 h后利用酶標儀檢測450 nm處的OD值。實驗流程見圖4。

2.7" 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS21.0軟件進行處理，數(shù)據(jù)采用完全隨機區(qū)組設(shè)計的協(xié)方差分析，并利用GraphPad Prism8.0進行IC50繪制及計算。

3" 結(jié)果

3.1" 不同灌胃劑量、相同采血時間和體積分數(shù)

3.1.1" BXD不同灌胃劑量組對 MGC803細胞的抑制作用

圖5結(jié)果顯示，10%體積分數(shù)的BXD低劑量組在采血時間30 min時對MGC803細胞具有促生長作用，而在90、120、150 min中抑制細胞增殖（Plt;0.01），BXD中劑量組和高劑量組在60、90、120、150 min中均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），20%（體積分數(shù)）的細胞增殖率均低于10%的BXD含藥血清，且以BXD中劑量組的細胞抑制率最顯著，且BXD高劑量組超出人體正常用量，因此，后續(xù)的實驗采用BXD中劑量組進行研究。

3.1.2" BXD不同灌胃劑量組對AGS細胞的抑制作用

圖6結(jié)果顯示，不管10%還是20%的BXD中劑量組在采血時間60、120、150 min中均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），而BXD低劑量組僅在20%，采血時間為90 min時具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），BXD高劑量組在60 min和120 min采血時間上具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。由此， BXD中劑量組對AGS細胞的抑制作用較強，后續(xù)將采用BXD中劑量組進行研究。

3.1.3" BXD不同灌胃劑量組對MKN45細胞的抑制作用

圖7結(jié)果顯示，10%的BXD低劑量組對胃癌細胞MKN45具有促生長作用，采血時間為60、90、120 min時BXD高、中、低劑量組均對MKN45細胞具有抑制增殖作用（Plt;0.01），且BXD中劑量組和高劑量組之間無顯著性差異，由于BXD高劑量組超出人體正常用量，因此，后續(xù)的實驗采用BXD中劑量組進行研究。

3.1.4" BXD不同灌胃劑量組對HGC27細胞的抑制作用

圖8結(jié)果顯示，低劑量BXD組具有促胃癌細胞HGC27生長的作用，BXD高劑量組對維阿細胞的抑制作用無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，而20%的BXD中劑量組對在采血時間120 min時具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，因此，后續(xù)的實驗采用BXD中劑量組進行研究。

3.2" 不同采血時間，相同灌胃劑量和體積分數(shù)

3.2.1" BXD不同采血時間對MGC803細胞抑制作用

圖9結(jié)果顯示，與同組其它采血時間比較，MGC803細胞中60、90、120和150 minBXD含藥血清組的OD值與空白血清組均有顯著性差異 （Plt;0.01），且以120 min的OD值變化最大。因此，以下實驗將采血時間點定于末次灌胃后120 min。

3.2.2" BXD不同采血時間對AGS細胞抑制作用

圖10結(jié)果顯示，與同組其它采血時間比較，AGS細胞中中劑量和高劑量灌胃的120 min BXD含藥血清組的OD值與空白血清組比有顯著性差異 （Plt;0.01）。因此，以下實驗將采血時間點定于末次灌胃后120 min。

3.2.3" BXD不同采血時間對MKN45細胞抑制作用

圖11結(jié)果顯示，與同組其它采血時間比較，MKN45細胞中高、中、低劑量組的90和120 min BXD含藥血清組的OD值與空白血清組比有顯著性差異 （Plt;0.01），且以120 min的BXD含藥血清抑制細胞增殖的變化顯著。因此， 以下實驗將采血時間點定于末次灌胃后120 min。

3.2.4" BXD不同采血時間對HGC27細胞抑制作用

圖12結(jié)果顯示，與同組其它采血時間比較，HGC27細胞對BXD含藥血清的敏感性較弱，僅在中劑量灌胃的120 min BXD含藥血清組與空白血清組比較有顯著性差異 （Plt;0.01）。因此， 以下實驗將采血時間點定于末次灌胃后120 min。

3.3" 不同體積分數(shù)，相同灌胃劑量和采血時間

3.3.1" BXD不同體積分數(shù)對MGC803細胞的干預(yù)作用

圖5顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖9提示BXD含藥血清最佳的取血時間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制MGC803細胞增殖的最佳體積分數(shù)以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進行研究。經(jīng)CCK8檢測不同處理后的OD值和細胞活率變化見表1，應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.3分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細胞MGC803 24 h的IC50為23.09%，48 h的IC50為22.38%，72 h的IC50為21.46%，3個時間點的IC50的平均值為22.31%，因此，20%的含藥血清用于后續(xù)胃癌細胞MGC803的實驗。

3.3.2" BXD不同體積分數(shù)對AGS細胞的干預(yù)作用

圖6顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖10提示BXD含藥血清最佳的取血時間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制AGS細胞增殖的最佳濃度以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進行研究。經(jīng)CCK8檢測不同處理后的OD值和細胞活率變化見表2。應(yīng)用GraphPad Prism 8分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細胞AGS的24 h的IC50為25.79%，48 h的IC50為20.30%，72 h的IC50為20.58%，3個時間點的IC50的平均值為22.22%，因此，20%的半夏瀉心湯含藥血清濃度用于后續(xù)胃癌細胞AGS的實驗。

3.3.3" BXD不同體積分數(shù)對MKN45細胞的干預(yù)作用

圖7顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖11提示BXD含藥血清最佳的取血時間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制MKN45細胞增殖的最佳體積分數(shù)以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進行研究。經(jīng)CCK8檢測不同處理后的OD值和細胞活率變化見表3。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.3分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細胞MKN45的24 h的IC50為22.47%，48 h的IC50為23.02%，72 h的IC50為21.43%，3個時間點的IC50的平均值為22.30%，因此，20%的半夏瀉心湯含藥血清體積分數(shù)用于后續(xù)胃癌細胞MKN45的實驗。

3.3.4" BXD不同體積分數(shù)對HGC27細胞的干預(yù)作用

圖8顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖12提示BXD含藥血清最佳的取血時間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制HGC27細胞增殖的體積分數(shù)以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進行研究，經(jīng)CCK8檢測不同處理后的OD值和細胞活率變化見表4。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.3分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細胞AGS的24 h的IC50為20.56%，48 h的IC50為23. 49%，72 h的IC50為23.45%，3個時間點的IC50的平均值為22.5%，綜上，20%的半夏瀉心湯含藥血清體積分數(shù)用于后續(xù)胃癌細胞HGC27的實驗。

3.4" 不同灌胃劑量、采血時間、體積分數(shù)

3.4.1" BXD不同灌胃劑量、采血時間、體積分數(shù)含藥血清對MGC803細胞的抑制作用

如表5所示，BXD低、中、高灌胃劑量在不同取血時間及體積分數(shù)抑制胃癌細胞MGC803均于20%時達到峰值，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制MGC803增殖的作用。不同取血時間比較，120 min值均低于其他4個取血時間（Plt;0.05），且與空白血清組具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。不同體積分數(shù)比較，體積分數(shù)20%的含藥血清所得的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分數(shù)20%的含藥血清對胃癌MGC803細胞的抑制作用最佳。

3.4.2" BXD不同灌胃劑量、采血時間、體積分數(shù)含藥血清對AGS細胞的抑制作用

如表6所示，BXD低、中、高灌胃劑量和不同體積分數(shù)含藥血清抑制胃癌細胞AGS時均在BXD中劑量組20%體積分數(shù)時達到峰值，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制AGS增殖的作用。不同取血時間比較，120 min值均低于其他4個取血時間（Plt;0.05），且與空白血清組具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。不同體積分數(shù)比較，體積分數(shù)20%

的含藥20%血清所得的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分數(shù)20%的含藥血清對胃癌AGS細胞的抑制作用最佳。

3.4.3" BXD不同灌胃劑量、采血時間、體積分數(shù)的含藥血清對MKN45細胞的抑制作用

如表7所示，BXD低、中、高灌胃劑量和不同體積分數(shù)含藥血清抑制胃癌細胞MKN45時均在BXD中劑量組20%體積分數(shù)時達到峰值，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制MKN45增殖的作用。不同取血時間比較，120 min值均低于其他4個取血時間（Plt;0.05），且與空白血清組具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），不同體積分數(shù)比較，體積分數(shù)20%的含藥血清所得的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分數(shù)20%的劑量對胃癌MKN45細胞的抑制作用最佳。

3.4.4" BXD不同灌胃劑量、采血時間、體積分數(shù)含藥血清對HGC27細胞的抑制作用

如表8所示，BXD低、中、高灌胃劑量含藥血清抑制HGC27細胞時均在BXD中劑量組時抑制作用最強，10%和20%體積分數(shù)含藥血清干預(yù)時，20%的體積分數(shù)對HGC27的抑制作用較強，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制HGC27增殖的作用。不同取血時間比較，120 min值均低于其他4個取血時間（Plt;0.05），且與空白血清組具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。不同體積分數(shù)比較，

體積分數(shù)20%的含藥血清的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分數(shù)20%的劑量對胃癌MKN45細胞的抑制作用最佳。

4" 討論

體外細胞實驗是目前醫(yī)學(xué)研究中常見的實驗技術(shù)，被用于輔助疾病診斷、探究疾病發(fā)生發(fā)展及藥物防治的療效性和分子機制等。隨著中醫(yī)藥領(lǐng)域體外實驗技術(shù)的發(fā)展，中藥干預(yù)細胞實驗由最初的中藥粗提物直接添加，逐步發(fā)展成為基于血清藥理學(xué)的含藥血清添加方式［8］，即中藥血清藥理學(xué)，它是指將中藥或復(fù)方經(jīng)口給動物灌服一定時間后采集動物血液、分離血清，以含藥血清代替中藥粗提物作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中，從而研究其藥理作用的一種半體內(nèi)實驗方法［9］。中藥血清藥理學(xué)可以利用生物體對中藥復(fù)雜成分的選擇作用，反映中藥在體內(nèi)的消化、吸收、代謝、排泄過程，由于含藥血清在加入到體外培養(yǎng)體系中時其有效成分將被稀釋，無法做到體外培養(yǎng)體系內(nèi)藥物濃度與血藥濃度一致［10］，因此含藥血清并不是體積分數(shù)越大越好［11］；且由于細胞增殖抑制作用，高濃度的血清或高濃度的藥效成分均會導(dǎo)致細胞永久性損傷甚至死亡，影響后續(xù)實驗進展［12］，不同細胞對含藥血清的耐受性和敏感性亦不相同。因此，基于中藥血清藥理學(xué)的體外細胞實驗過程中，篩選中藥含藥血清的最佳濃度是體外細胞實驗至關(guān)重要的步驟，同時可以減少后續(xù)研究的中藥干預(yù)組數(shù)，降低因?qū)嶒灢襟E過多出現(xiàn)的操作失誤，縮短檢測時間，節(jié)省經(jīng)費。

4.1" 含藥血清的量效關(guān)系研究

含藥血清中藥量的多少取決于動物灌胃劑量和培養(yǎng)體系中含藥血清的體積分數(shù)占比，在一定條件范圍內(nèi)，動物灌胃劑量愈多，則進入血液循環(huán)的藥物愈多，血藥濃度愈高，故所取含藥血清的體外藥理效應(yīng)愈強；此外細胞培養(yǎng)體系中含藥血清體積分數(shù)與藥效成正比，在一定范圍內(nèi)，藥理效應(yīng)隨含藥血清濃度增加而增強，血清濃度過高會對細胞產(chǎn)生毒性作用，在研究含藥血清對細胞增殖作用時，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此，篩選相對固定含藥血清濃度和適宜的灌胃劑量是研究藥物含藥血清量效關(guān)系的主要方法。

血清是維持細胞生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)，血清濃度低導(dǎo)致細胞生長速度緩慢，而血清濃度太高會加速細胞分化，造成細胞老化，因此血清含量高低與藥物藥效作用強弱密切相關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，動物血清中含多種活性物質(zhì)，故在實驗過程中需嚴格設(shè)置空白血清組，以此來避免血清中所含干擾性物質(zhì)給實驗結(jié)果帶來影響［12］。本實驗中的含藥血清體積分數(shù)占比分組是利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行稀釋配置，確保每組的反應(yīng)體系中只存在動物血清，且總血清體積分數(shù)為50%，如5%含藥血清由5 μL含藥血清加45 μL空白血清配制而成；10%含藥血清由10 μL含藥血清加40 μL空白血清配制而成，空白血清組只需設(shè)置1組50%空白血清組，該方法可以減少空白血清組數(shù)的設(shè)置，減少實驗操作上的偏倚。

4.2" 含藥血清時效關(guān)系研究

在時效方面，血清藥理學(xué)一般是參照中藥的半衰期，認為5～7個半衰期，即可達到穩(wěn)態(tài)血

藥濃度。有研究通過對大量重要的藥代動力學(xué)參數(shù)進行分析后得出一種普遍且使用的給藥時間，認為每日2次，早晚各一次，連續(xù)3 d，末次給藥后30～120 min內(nèi)采血的方式稱之為“通法”［13-14］，而給藥時間和采血時間的確定是由血藥濃度確定的，多數(shù)藥物在體內(nèi)按照一級動力學(xué)消除，藥物經(jīng)過4～5個半衰期（t1/2）達到穩(wěn)態(tài)濃度，即藥物的半衰期長短決定給藥時間的長短。藥物在體內(nèi)經(jīng)吸收、分布、代謝及排泄過程，給藥后體內(nèi)的血藥濃度隨時間推移先升高后降低［7］，理想狀態(tài)下的采血時間是血藥濃度達峰值的時刻，但由于給藥劑量、給藥次數(shù)等多種因素影響，采血時間峰值亦不盡相同，因此，在研究血清藥理學(xué)之前，進行時效關(guān)系的研究是必要的，以此確定給藥后采血的最佳時間點，避免因藥效物質(zhì)被代謝減少或尚未吸收造成的假陰性結(jié)果［15］。本實驗采用每日給藥2次，連續(xù)3 d的給藥方式，末次給藥后分別在給藥后30、60、90、120、150 min采血，以尋找更準確的采血時間。

中藥含藥血清藥理學(xué)研究的規(guī)范化、標準化依賴于其方法學(xué)研究的不斷發(fā)展。近年來，在中藥含藥血清研究方法方面進行系統(tǒng)化的研究，而其中藥物血清的時效量效關(guān)系是研究的重要部分。通過對時效（不同采血時間的含藥血清藥效）和量效（不同灌胃劑量和不同體積分數(shù)的含藥血清藥效）關(guān)系進行研究，以此來確定合適的動物給藥劑量、采血時間、含藥血清體積分數(shù)等。本實驗在時效關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，最佳采血時間與給藥劑量無關(guān)，但與血藥達峰濃度密切相關(guān)。實驗采用每日2次，連續(xù)3 d的給藥方式制備BXD含藥血清，根據(jù)藥代動力學(xué)理論，以固定給藥時間間隔、相同劑量多次重復(fù)給藥使藥物在體內(nèi)蓄積，血藥濃度已近乎坪值，給藥間隔時間影響坪值的波動范圍，對坪值的平均高度無影響。

半夏瀉心湯是由清半夏、人參、炒甘草、干姜、大棗、黃芩、黃連7味藥組成，具有消痞散結(jié)，平調(diào)寒熱功效，主治虛實并見、寒熱錯雜之痞證，臨床多用于治療消化道相關(guān)病證，亦常用于腫瘤及并發(fā)癥和放化療后的不良反應(yīng)，在以往的體外實驗中發(fā)現(xiàn)，BXD對胃癌細胞具有抑制作用。本實驗通過觀察低、中、高灌胃劑量及30、60、90、120、150 min不同取血時間所得的BXD含藥血清對OD值的影響，以確定其最佳的灌胃劑量及取血時間，并在此基礎(chǔ)上探討5%～50%之間10個不同體積分數(shù)含藥血清抑制胃癌細胞增殖的最佳體積分數(shù)。結(jié)果顯示，在量效關(guān)系研究中，實驗結(jié)果顯示以中劑量組的20%時抑制胃癌細胞增殖最為明顯，添加體積分數(shù)高于20%后會造成細胞過度生長抑制，產(chǎn)生細胞毒性，影響后續(xù)實驗操作和檢測，這一結(jié)果與既往中藥藥理研究結(jié)果相吻合。在時效關(guān)系研究中，BXD高、中、低劑量組均于末次給藥后的120 min對胃癌細胞增殖影響最明顯。本研究基于血清藥理學(xué)方法，結(jié)合實驗結(jié)果分析BXD含藥血清對人胃癌細胞具有抑制細胞增殖的作用，提示我們使用中藥治療胃癌具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗首次確定了半夏瀉心湯含藥血清制備的最佳灌胃劑量、最佳采血時間和添加到體系反應(yīng)中的最佳體積分數(shù)，為今后引用血清藥理學(xué)的方法研究半夏瀉心湯的分子藥理作用機制提供了依據(jù)。

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