爪哇蟲草菌可濕性粉劑研制及其對介殼蟲的田間防效

摘""要：介殼蟲是重要的農(nóng)林害蟲，對農(nóng)作物、果樹、觀賞植物和林木均有不同程度的危害。爪哇蟲草菌（Cordyceps"javanica）IJID003對介殼蟲具有強致病性，在微生物農(nóng)藥開發(fā)方面具有較大潛力，對其可濕性粉劑的研發(fā)以及生產(chǎn)工藝優(yōu)化，是推進其產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化的措施之一，且對推進農(nóng)林業(yè)的綠色發(fā)展具有重要意義。本研究通過單因素試驗設計，篩選爪哇蟲草菌IJID003最優(yōu)固體發(fā)酵基質(zhì)和外源添加物；通過測定助劑與爪哇蟲草菌IJID003的相容性及其有效性能，篩選適宜菌株的最佳載體、潤濕劑、分散劑和紫外保護劑，初步研制爪哇蟲草菌的可濕性粉劑配方；在室外對白蘭捷氏吹綿蚧（Icerya"jacobsoni）雌成蟲進行田間防效試驗。結果表明：爪哇蟲草菌最優(yōu)發(fā)酵基礎基質(zhì)為大麥，最適基質(zhì)配方組合為大麥與麥麩7∶1（w/w）；最優(yōu)外源添加物組合為1%葡萄糖的碳源、1%酸水解酪蛋白的氮源、2%氯化鉀的無機鹽、1%甘氨酸的氨基酸和0.1%蜂蛹殼粉的幾丁質(zhì)成分。爪哇蟲草菌IJID003可濕性粉劑的最佳配方為20%爪哇蟲草菌純孢子粉、1%潤濕劑Morwet"EFW、5%分散劑Morwet"D-450、1%紫外保護劑熒光素鈉CBS-X和73%載體硅藻土。田間防效結果表明，用孢子濃度為6×108"CFU/mL爪哇蟲草菌制劑能有效防治捷氏吹綿蚧雌成蟲，第21天防效達92.50%，與對照藥劑25%噻蟲嗪可濕性粉劑4000倍液防效（95.50%）相比無顯著差異。綜上所述，研制爪哇蟲草菌IJID003可濕性粉劑對捷氏吹綿蚧具有較好的防效，在替代部分化學農(nóng)藥進行綠色防控中具有重要的應用前景。

關鍵詞：爪哇蟲草菌IJID003；固體發(fā)酵條件；可濕性粉劑；捷氏吹綿蚧；田間防效中圖分類號：S476.1""""""文獻標志碼：A

Development"of"Wettable"Powder"of"Cordyceps"javanica"and"Its"Toxicity"Against"Scale"Insect"Pest

DENG"Jiaru，"SUN"Longhua*，"XU"Shulan，"Zhang"Jin’ai

Guangzhou"Institute"of"Forestry"and"Landscape"Architecture"/"Guangzhou"Collaborative"Innovation"Center"on"Science-tech"of"Ecology"and"Landscape，"Guangzhou，"Guangdong"510405，"China

Abstract："The"scale"insect"pest"is"the"main"pest"in"agroforestry，"causing"varying"degrees"of"damage"to"crops，"fruit"trees，"ornamental"plants，"and"forest"trees."The"fungus"Cordyceps"javanica"IJID003"exhibits"strong"pathogenicity"against"scale"insects，"making"it"a"promising"candidate"for"the"development"of"microbial"pesticides."Research"and"development"efforts"focusing"on"its"wettable"powder"formulation"and"the"optimization"of"its"production"process"are"essential"steps"toward"its"industrialization"and"commercialization."The"efforts"are"also"crucial"for"promoting"sustainable"agricultural"practices"and"achieving"green"pest"management"strategies."In"this"study，"a"single-factor"test"was"employed"to"identify"the"optimal"solid"fermentation"substrates"and"exogenous"additives"of"strain"IJID003."This"research"screened"the"optional"carrier，"wetting"agent，"dispersing"agent"and"UV"protective"agent"of"the"C."javanica"by"measuring"the"compatibility"and"its"effective"performance，"which"developed"the"wettable"powder"formula"of"the"C."javanica"preliminarily."The"field"efficacy"of"the"C."javanica"wettable"powder"was"evaluated"against"female"adults"of"Icerya"jacobsoni"on"Michelia"alba."The"optimal"spore-producing"base"substrate"for"C."javanica"was"barley."The"best"substrate"formulation"was"a"mixture"of"barley"（7"parts）"and"wheat"bran"（1"part）"by"weight."The"optimal"exogenous"additives"included"1%"glucose"as"a"carbon"source，"1%"acid"hydrolyzed"casein"as"a"nitrogen"source，"2%"potassium"chloride"as"an"inorganic"salt，"1%"glycine"as"an"amino"acid，"and"bee"pupal"body"wall"powder"as"a"chitin"source."The"optimal"formulation"for"the"strain"IJID003"wettable"powder"was"20%"spore"powder"of"IJID003，"1%"wetting"agent"Morwet"EFW，"5%"dispersing"agent"Morwet"D-450，"1%"UV"protectant"CBS-X，"and"73%"carrier"diatomaceous"earth."Field"trials"demonstrated"that"a"spore"concentration"of"6×108"CFU/mL"of"C."javanica"wettable"powder"effectively"controlled"female"I."jacobsoni"adults"on"M."alba，"with"an"efficacy"of"92.50%"at"21"days"post-inoculation."This"efficacy"was"not"significantly"different"from"that"of"the"control"insecticide，"a"4000-fold"dilution"of"25%"thiamethoxam"wettable"powder，"which"achieved"a"control"efficiency"of"95.50%."In"conclusion，"the"strain"IJID003"wettable"powder"shows"excellent"potential"for"the"green"management"of"scale"insects"and"holds"significant"promise"as"a"sustainable"alternative"to"chemical"pesticides.

Keywords："Cordyceps"javanica"IJID003;"solid"fermentation"conditions;"wettable"powder;"Icerya"jacobsoni;"field"efficacy

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.012

介殼蟲，屬于昆蟲綱（Insecta）半翅目（Hemiptera）胸喙亞目（Sternorhyncha）的蚧次目（Coccomorpha）。根據(jù)ScaleNet估計，全世界記錄的介殼蟲有48科1144屬約7812種[1]。中國已知16科261屬1016種，大陸地區(qū)已知16科249屬830種[2]。介殼蟲個體小，對環(huán)境的適應能力很強，常聚集于寄主植物葉片背面或枝干表面，隱匿性強，不易被發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)介殼蟲通過刺吸植物汁液為食，排泄蜜露會誘發(fā)煤污病，降低植物的光合作用；少部分種類為害植物地下部分的根、塊根[3]，嚴重影響城市園林景觀和農(nóng)林生產(chǎn)效益[4-5]。目前，在城市園林維護和農(nóng)林生產(chǎn)中，針對介殼蟲的防治仍以化學防治為主。但由于介殼蟲體表分泌蠟質(zhì)，低劑量化學藥劑的藥效并不突出，而化學藥劑的頻繁、過量使用，導致介殼蟲抗藥性問題日益突出。已有研究報道有些介殼蟲對有機磷類丙溴磷、氨基甲酸酯類硫雙威和新煙堿類吡蟲啉等化學藥劑已產(chǎn)生一定的抗藥性[6]，導致介殼蟲防治難度進一步增大。因此，如何減少化學農(nóng)藥使用量、高效綠色防控農(nóng)林介殼蟲已成為植保領域關注的熱點。昆蟲病原真菌因具有廣譜殺蟲活性、環(huán)保及靶標害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，被認為是化學藥劑的安全替代品。

一直以來，介殼蟲病原真菌資源被大量挖掘，如球孢白僵菌（Beauveria"bassiana）、黃葉錐孔藻（Conoideocrella"luteorostrata）、淡紫擬青霉（Paecilomyces"lilacinus）、金龜子綠僵菌（Metarhizium"anisopliae）、爪哇蟲草菌（Cordyceps"javanica）、木賊鐮刀菌（Fusarium"equiseti）、蠟蚧輪枝菌（Lecanicillium"lecanii）等[7-12]。其中，爪哇蟲草菌（原被稱為爪哇棒束孢）屬于蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草菌屬（Cordyceps），是一類重要的生防真菌，具有廣譜殺蟲活性[9，"13-16]。

針對爪哇蟲草菌固體發(fā)酵條件優(yōu)化及可濕性粉劑研制的研究，目前國內(nèi)外均有報道。KIM等[17]研究發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草菌在大麥基質(zhì)中培養(yǎng)具有較好的產(chǎn)孢量，且在大麥中添加2%碳酸鈣+2%硫酸鈣、酵母提取物、酪蛋白或谷蛋白也會顯著增加分生孢子的產(chǎn)量。ORDAZ-HERNáNDEZ等[18]通過測定分生孢子產(chǎn)量、活力、疏水性、貨架期和對柑橘木虱（Diaphorina"citri）的致病性綜合評價了棕櫚仁粕對爪哇蟲草菌發(fā)酵水平的影響，結果發(fā)現(xiàn)在稻谷中添加5%棕櫚仁粕，使分生孢子產(chǎn)量提高了40%，并且提高了爪哇蟲草菌對柑橘木虱成蟲的致病力。陳名等[19]研制出對假眼小綠葉蟬（Empoasca"vitis）有高毒力的爪哇蟲草菌粉劑，篩選出最佳助劑配方，確定配方為10%分生孢子粉，3%濕潤劑A，5%分散劑B，1%紫外保護劑熒光素鈉，0.5%抗氧化劑C，以海泡石作為載體補足到100%，生物測定結果顯示該制劑對假眼小綠葉蟬的侵染死亡率達100%。但以上研究中的爪哇蟲草菌產(chǎn)孢率低限制了其生產(chǎn)應用。因此，提高爪哇蟲草菌的發(fā)酵水平和研制適宜的粉劑對提升爪哇蟲草菌的應用效果和加快產(chǎn)業(yè)化進程具有重要意義。

本研究從介殼蟲中分離篩選出一株優(yōu)良爪哇蟲草菌菌株IJID003（發(fā)明專利授權號：ZL201811348365.8），對捷氏吹綿蚧（Icerya"jacobsoni）、扶桑綿粉蚧（Phenacoccus"solenopsis）等多種農(nóng)林重要介殼蟲具有強侵染活性[8]，具有生防菌劑產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的潛力。由于地理環(huán)境及寄主的不同，生防菌為了適應環(huán)境會進化出不同的生理生化特性和致病性，因此需要針對菌株IJID003提升發(fā)酵水平，研制適宜制劑，最大程度地開發(fā)防控介殼蟲的微生物菌劑。本研究通過篩選固體發(fā)酵基質(zhì)組合和外源添加物組合，優(yōu)化爪哇蟲草菌的固體發(fā)酵條件；進一步篩選載體、潤濕劑、分散劑和紫外保護劑，研制可濕性粉劑配方并進行捷氏吹綿蚧田間防效試驗，以期為爪哇蟲草菌IJID003生防菌劑的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵擴培及農(nóng)林重要介殼蟲的綠色防控奠定基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料及昆蟲材料""白蘭（Michelia"alba）為2年生苗，株高80"cm，將15株白蘭盆栽苗進行地栽，日常澆水管理。在形成穩(wěn)定的生長狀態(tài)后，持續(xù)接種捷氏吹綿蚧，使每株白蘭植株的蟲口密度達20頭雌成蟲。

1.1.2""菌株""爪哇蟲草菌IJID003從廣州越秀公園白蘭植株上的捷氏吹綿蚧（I."jacobsoni）分離得到[8]。

1.1.3""主要試劑""甘露糖和D-山梨醇購自生工生物工程（上海）股份有限公司，葡萄糖、淀粉和氯化鉀購自天津市大茂化學試劑廠，蛋白胨購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，酸水解酪蛋白購自上海麥克林生化科技有限公司，酵母提取物購自卡邁舒（上海）生物科技有限公司，甘氨酸購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，硫酸鈣和碳酸鈣購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，蝦殼甲殼素購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，蟹殼甲殼素、拉開粉BX、十二烷基硫酸鈉（SDS）和十二烷基苯硫酸鈉（SDBS）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Morwet"EFW、Dispwet"WP400、Borresperse"NA、Morwet"D-25和Morwet"D-450均購自南京捷潤科技有限公司，熒光素鈉CBS-X購自武漢卡諾斯科技有限公司，腐殖酸購自阿法埃莎（中國）化學有限公司，紫外吸收劑BASF"326購自巴斯夫（中國）有限公司，25%噻蟲嗪可濕性粉劑購自瑞士先正達作物保護有限公司。

1.1.4""主要儀器""生化培養(yǎng)箱（LRH-250F），上海一恒；高壓滅菌鍋GI54TW，致微（廈門）；冷凍干燥機CoolSafe"55-4，丹麥Labogene。

1.2""方法

1.2.1""固體發(fā)酵基質(zhì)的篩選""（1）基礎發(fā)酵基質(zhì)：以廣口玻璃飯盒（17.50"cm×13.0"cm×6.50"cm）作為容器，分別裝入100"g大麥、100"g黃小米、100"g玉米渣、100"g糙米和100"g黑米，120"℃高壓滅菌60"min后備用。配制成濃度為1×106"CFU/mL的分生孢子懸浮液，按體積質(zhì)量分數(shù)為15%的接種量與基質(zhì)混合均勻。用Parafilm封口膜將玻璃飯盒封口，置于28"℃的培養(yǎng)箱中，靜置暗培養(yǎng)10"d，每組3個重復。取培養(yǎng)后的發(fā)酵基質(zhì)3"g，置于27"mL含0.02%吐溫80的無菌水中，并在振蕩器中渦旋1"min，利用無菌紗布過濾后，統(tǒng)計分生孢子數(shù)，并計算產(chǎn)孢量。

（2）輔助發(fā)酵基質(zhì)：以最優(yōu)基礎發(fā)酵基質(zhì)為載體，進一步添加輔助基質(zhì)，設置基礎基質(zhì)與輔助基質(zhì)比例為1∶1（w/w），總固體發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量為100"g，具體組合為大麥+玉米渣、大麥+糙米、大麥+黑米、大麥+黃小米、大麥+稻殼、大麥+麥麩、大麥+黃豆粉，以大麥單獨發(fā)酵作為對照，每組3個重復。參照1.2.1-（1）的方法接種培養(yǎng)并統(tǒng)計產(chǎn)孢量。

以最優(yōu)基礎基質(zhì)為載體，總固體發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量為100"g，設置基礎基質(zhì)比例（w/w）24∶1、17∶1、11∶1、7∶1、5∶1、1∶1共6種，每組3個重復。參照1.2.1-（1）的方法接種培養(yǎng)并統(tǒng)計產(chǎn)孢量。

1.2.2""固體發(fā)酵條件的優(yōu)化""（1）外源添加物的初篩。參考KIM等[17]的方法，稍作修改。以1.2.1中篩選的固體基質(zhì)組合為基礎，總固體發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量為100"g，加入不同碳源（2%甘露糖、2%D-山梨醇、2%葡萄糖、2%淀粉）、氮源（2%蛋白胨、2%酸水解酪蛋白、1.32%酵母提取物）、無機鹽（5.5%氯化鉀、2%碳酸鈣+2%硫酸鈣）和氨基酸（2%甘氨酸）等。以大麥-麥麩基質(zhì)未添加任何外源添加物作為對照（CK），每組3個重復。按體積質(zhì)量分數(shù)為10%的分生孢子接種量，料水比為4∶1（w/w）加入無菌水，與基質(zhì)混合均勻，用Parafilm封口膜將玻璃飯盒封口，置于28"℃的培養(yǎng)箱中，靜置暗培養(yǎng)10"d，每組3個重復。參照1.2.1-（1）的方法統(tǒng)計產(chǎn)孢量。

（2）外源添加物組合的篩選。進一步選用最佳碳源和氮源，篩選最優(yōu)外源添加物組合?？偣腆w發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量為100"g，設置6個組合：大麥+麥麩+2%葡萄糖（T1）、大麥+麥麩+2%酸水解酪蛋白（T2）、大麥+麥麩+2%葡萄糖+2%酸水解酪蛋白（T3）、大麥+麥麩+2%葡萄糖+2%酸水解酪蛋白+5.5%氯化鉀（T4）、大麥+麥麩+2%葡萄糖+2%酸水解酪蛋白+5.5%氯化鉀+2%甘氨酸（T5）、大麥+麥麩+2%葡萄糖+2%酸水解酪蛋白+5.5%氯化鉀+2%碳酸鈣+2%硫酸鈣（T6），以大麥-麥麩基質(zhì)未添加任何外源添加物作為對照（CK），每組3個重復，參照1.2.1-（1）的方法接種培養(yǎng)并統(tǒng)計產(chǎn)孢量。

（3）外源添加物組合比例的篩選。采用以上最佳發(fā)酵條件，進一步調(diào)整外源添加物組合比例。總固體發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量為100"g，設置4個組合：大麥+麥麩+0.1%葡萄糖+0.1%酸水解酪蛋白+0.2%氯化鉀+0.1%甘氨酸（t1）、大麥+麥麩+0.5%葡萄糖+0.5%酸水解酪蛋白+1%氯化鉀+0.5%甘氨酸（t2）、大麥+麥麩+1%葡萄糖+1%酸水解酪蛋白+2%氯化鉀+1%甘氨酸（t3）、大麥+麥麩+2%葡萄糖+2%酸水解酪蛋白+5.5%氯化鉀+2%甘氨酸（t4），以大麥-麥麩基質(zhì)未添加任何外源添加物作為對照（CK），每組3個重復，參照1.2.1-（1）的方法接種培養(yǎng)并統(tǒng)計產(chǎn)孢量。

（4）外源幾丁質(zhì)成分的篩選。保持以上最佳發(fā)酵條件，分別加入1%蝦殼粉、0.1%蜂蛹殼粉、0.1%介殼粉、1%蟹殼粉，以未添加幾丁質(zhì)作為對照，每組3個重復，參照1.2.1-（1）的方法接種培養(yǎng)并統(tǒng)計產(chǎn)孢量。

1.2.3""粉劑助劑的篩選""（1）菌株IJID003純孢子粉的制備。按1.2.2固體發(fā)酵優(yōu)化后的條件進行淺盤發(fā)酵，稱取171.43"g大麥和28.57"g麥麩，平鋪在不銹鋼淺盤（40.00"cm×30.00"cm×6.00"cm）中，用錫箔紙密封滅菌。在50"mL無菌水中加入按1.2.2篩選出的最佳添加物組合及其最佳比例，溶解后經(jīng)細菌過濾器（0.22"μm孔徑）過濾，制成營養(yǎng)溶液，備用。將20"mL濃度為1×106"CFU/mL的IJID003孢子懸浮液、50"mL營養(yǎng)溶液和0.2"g蜂蛹殼粉加入基質(zhì)中，混勻，用Parafilm封口膜封口，于28"℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)10"d。待淺盤基質(zhì)表面布滿分生孢子，利用0.02%吐溫80的無菌水洗脫過濾，用冷凍干燥機干燥24"h，收集獲得菌株IJID003的純孢粉。

（2）載體的篩選。將325目的硅藻土、凹凸棒土、蒙脫石、膨潤土、滑石粉和白炭黑按1、3、5"mg/mL的終濃度分別加入到50"mL孢子萌發(fā)液（蔗糖20"g/L、蛋白胨5"g/L、磷酸二氫鉀5"g/L）中，121"℃高溫滅菌20"min，冷卻后備用。取5"mL濃度為1×107"CFU/mL的爪哇蟲草菌的孢子懸浮液加入含有不同載體的孢子萌發(fā)液中，于120"r/min，28"℃恒溫培養(yǎng)12"h，用血球計數(shù)板對爪哇蟲草菌的孢子萌發(fā)數(shù)進行計數(shù)。進一步參照GB/T5451—2001[20]的方法測定載體的潤濕性，作為選擇載體的參考條件。

（3）潤濕劑的篩選。將拉開粉BX、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基苯硫酸鈉（SDBS）、Morwet"EFW和Dispwet"WP400按質(zhì)量分數(shù)為0.100%、0.125%和0.500%分別加入到50"mL孢子萌發(fā)液中，以未添加分散劑作為對照，于121"℃高溫滅菌20"min，冷卻后備用。取5"mL濃度為1×"107"CFU/mL的爪哇蟲草菌的孢子懸浮液加入含有不同載體的孢子萌發(fā)液中，于120"r/min，28"℃恒溫培養(yǎng)12"h，用血球計數(shù)板對爪哇蟲草菌的孢子萌發(fā)數(shù)進行計數(shù)。進一步參照GB/T5451—2001[20]的方法測定潤濕性，作為選擇潤濕劑的參考條件。

（4）分散劑的篩選。將木質(zhì)素Borresperse"NA、Morwet"D-425和Morwet"D-450分別按照1.0、2.5、5.0"mg/mL的終濃度，加入到50"mL孢子萌發(fā)液中，以未添加分散劑作為對照，于121"℃高溫滅菌20"min，冷卻后備用。取5"mL濃度為1×107"CFU/mL的爪哇蟲草菌的孢子懸浮液加入含有不同載體的孢子萌發(fā)液中，于120"r/min，28"℃恒溫培養(yǎng)12"h，用血球計數(shù)板對爪哇蟲草菌的孢子萌發(fā)數(shù)進行計數(shù)。按爪哇蟲草菌20%、潤濕劑1%、分散劑5%、以載體補足100%的配比制成供試樣品，參照GB/T"14825—2023[21]的方法測定樣品的懸浮率。

（5）紫外保護劑的篩選。分別將熒光素鈉CBS-X、腐殖酸、BASF"326按照100、500、1000"μg/mL的終濃度加入50"mL孢子萌發(fā)液中，于121"℃高溫滅菌20"min，冷卻后備用。取5"mL濃度為1×107"CFU/mL的爪哇蟲草菌孢子懸浮液加入含有不同紫外保護劑的孢子萌發(fā)液中，于120"r/min，28"℃恒溫培養(yǎng)12"h，用血球計數(shù)板對爪哇蟲草菌的孢子萌發(fā)數(shù)進行計數(shù)。分別將熒光素鈉CBS-X、腐殖酸、BASF"326按照2000"μg/mL的終濃度加入裝有10"mL濃度為1×107"CFU/mL分生孢子液的6"cm培養(yǎng)皿中，于20"W紫外燈下30"cm（約270"μW/cm2）處照射，在15、30、60"min時，分別取出3"mL分生孢子液混合物于15"mL離心管中，加入3"mL孢子萌發(fā)液，于120"r/min，28"℃恒溫培養(yǎng)12"h，用血球計數(shù)板對爪哇蟲草菌的孢子萌發(fā)數(shù)進行計數(shù)，以未加入紫外保護劑的分生孢子液作為對照。

1.2.4""田間防治試驗""于2024年4月進行防效試驗，廣州平均氣溫24.5"℃，降雨頻繁，相對濕度80%以上。稱取按本研究配方研制的可濕性粉劑和1.2.3-（1）制備的菌株IJID003純孢粉分別加入到清水中，配置成孢子濃度為6×108"CFU/mL的藥液（分別為可濕性粉劑藥液和純孢粉藥液），并加入0.2%吐溫80黏著劑，使吐溫80終濃度為0.02%。分別將50"mL上述藥液置于噴霧器中，對白蘭植株上的捷氏吹綿蚧均勻噴霧，以噴施0.02%吐溫80+清水為對照，每個處理1株白蘭，重復3次。在菌劑處理后的第7、14、21天觀察捷氏吹綿蚧蟲體的侵染情況，統(tǒng)計致死數(shù)，其中蟲體體表有菌絲覆蓋且無明顯活動能力即為有效致死，計算各處理組的防治效果。

在室外種植的6株健康白蘭上進行化學藥劑防效試驗，捷氏吹綿蚧雌成蟲的蟲口密度同上，配制25%噻蟲嗪可濕性粉劑4000倍藥液50"mL，對白蘭植株上的捷氏吹綿蚧均勻噴霧，以只噴清水為對照，每個處理1株白蘭，重復3次。分別在處理后第7、14、21天觀察并記錄捷氏吹綿蚧死亡蟲數(shù)，統(tǒng)計致死數(shù)，其中捷氏吹綿蚧體表發(fā)黑即為有效致死，并計算防治效果。

蟲口減退率=（施藥前活蟲數(shù)–施藥后活蟲數(shù)）/施藥前活蟲數(shù)×100%；防效=（處理組蟲口減退率–對照蟲口減退率）/（1–對照蟲口減退率）×100%。

2""結果與分析

2.1""固體發(fā)酵基質(zhì)的篩選

2.1.1""基礎發(fā)酵基質(zhì)的篩選""爪哇蟲草菌在不同基礎基質(zhì)中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)10"d后，在大麥中的產(chǎn)孢量最大，為131.67×9×106"CFU/g，其次是黃小米，產(chǎn)孢量為60.00×9×106"CFU/g，而在玉米渣、糙米和黑米基質(zhì)中培養(yǎng)產(chǎn)孢量最少（圖1）。因此，篩選大麥為爪哇蟲草菌的基礎發(fā)酵基質(zhì)。

2.1.2""輔助發(fā)酵基質(zhì)的篩選""爪哇蟲草菌在大麥與不同輔助基質(zhì)組合中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)10"d后，爪哇蟲草菌在大麥+麥麩組合發(fā)酵中的產(chǎn)孢量最大，為205.00×9×106"CFU/g，大麥的產(chǎn)孢量次之，為142.50×9×106"CFU/g，而其余6種組合的產(chǎn)孢量均顯著低于大麥+麥麩、大麥（圖2）。因此，篩選大麥和麥麩為爪哇蟲草菌的固體發(fā)酵基質(zhì)組合。

2.1.3""基礎與輔助發(fā)酵基質(zhì)比的篩選""爪哇蟲草菌在不同比例的大麥與麥麩中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)10"d后，爪哇蟲草菌在大麥與麥麩組合比例為7∶1時的產(chǎn)孢量最大，為243.75×9×106"CFU/g，其次為1∶1和11∶1，產(chǎn)孢量分別為192.50×9×106"CFU/g和161.75×9×106"CFU/g，其余比例的產(chǎn)孢量均顯著低于上述3個比例（圖3）。因此，爪哇蟲草菌固體發(fā)酵基礎基質(zhì)與輔助基質(zhì)的最佳基質(zhì)比例為大麥與麥麩（w/w）7∶1。

2.2""固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1""外源添加物的初篩""爪哇蟲草菌在含不同碳源、氮源、其他營養(yǎng)元素添加物的大麥與麥麩組合基質(zhì)中發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)10"d后，爪哇蟲草菌在含碳源2%葡萄糖的發(fā)酵基質(zhì)中產(chǎn)孢量最大，為413.80×9×106"CFU/g；在含氮源2%酸水解酪蛋白的發(fā)酵基質(zhì)中產(chǎn)孢量顯著低于前者，為305.25×9×"106"CFU/g。在含5.5%氯化鉀、2%甘氨酸以及2%碳酸鈣+2%硫酸鈣的發(fā)酵基質(zhì)中的產(chǎn)孢量次之，分別為193.50×9×106、190.00×9×106、183.00×9×"106"CFU/g，其余添加物的產(chǎn)孢量均較低（圖4）。因此，篩選2%葡萄糖為碳源，2%酸水解酪蛋白為氮源，而5.5%氯化鉀、2%甘氨酸以及2%碳酸鈣+2%硫酸鈣為其他營養(yǎng)元素待選。

2.2.2""外源添加物組合物的篩選""爪哇蟲草菌在含不同添加物及組合的大麥與麥麩組合基質(zhì)中發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)10"d后，爪哇蟲草菌在T5（大麥+麥麩+2%葡萄糖+2%酸水解酪蛋白+5.5%氯化鉀+2%甘氨酸）的發(fā)酵基質(zhì)中產(chǎn)孢量最大，為477.30×"9×106"CFU/g，顯著大于其他組合的產(chǎn)孢量，而CK（大麥）的發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)孢量最小，為199.68×9×"106"CFU/g（圖5）。因此，篩選酸水解酪蛋白、葡萄糖、氯化鉀和甘氨酸為最佳外源添加物組合。

2.2.3""外源添加物不同比例組合的篩選""爪哇蟲草菌在含不同外源添加物比例的大麥與麥麩組合基質(zhì)中發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)10"d后，爪哇蟲草菌在t3組合的發(fā)酵基質(zhì)中產(chǎn)孢量最大，為795.00×9×"106"CFU/g；而在t4和t2組合的產(chǎn)孢量次之，分別為600.00×9×106"CFU/g和362.50×9×106"CFU/g；而在t1組合的發(fā)酵基質(zhì)中產(chǎn)孢量最小，為142.50×9×106"CFU/g（圖6）。因此，篩選t3組合，即1%酸水解酪蛋白+1%葡萄糖+2%氯化鉀+1%甘氨酸為最佳外源添加物組合。

2.2.4""外源幾丁質(zhì)成分的篩選""基于上述固體發(fā)酵條件的優(yōu)化結果，將不同外源幾丁質(zhì)成分加入固體基質(zhì)中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)10"d后，爪哇蟲草菌在添加介殼粉的發(fā)酵基質(zhì)的產(chǎn)孢量為1320.00×9×106"CFU/g，顯著高于其他外源幾丁質(zhì)成分的基質(zhì)，蜂蛹殼粉次之，為959.50.00×9×"106"CFU/g（圖7）。由于介殼粉需從寄主上取得，成本相對較高，因此，篩選蜂蛹殼粉作為替代介殼粉的外源幾丁質(zhì)成分。

2.3""粉劑助劑的篩選

2.3.1""載體的篩選""爪哇蟲草菌在含不同載體的孢子萌發(fā)液中進行培養(yǎng)，結果表明，1、3、5"mg/mL滑石粉、硅藻土和蒙脫石與爪哇蟲草菌的相容性均較好。爪哇蟲草菌在含1"mg/mL滑石粉、硅藻土和蒙脫石的孢子萌發(fā)液中培養(yǎng)后，孢子萌發(fā)率分別為97.00%、92.50%和92.50%；在含3"mg/mL滑石粉、硅藻土和蒙脫石的孢子萌發(fā)液中，其孢子萌發(fā)率分別為92.50%、91.00%和93.00%；在含5"mg/mL滑石粉、硅藻土和蒙脫石的孢子萌發(fā)液中，其孢子萌發(fā)率分別為85.00%、87.50%和86.50%；而載體濃度為5"mg/mL時，爪哇蟲草菌在凹凸棒土、膨潤土和白炭黑孢子萌發(fā)液中的孢子萌發(fā)率分別為8.00%、5.50%和15.00%，顯著低于滑石粉、硅藻土和蒙脫石（圖8）。由此可見，滑石粉、硅藻土和蒙脫石作為載體與爪哇蟲草菌的相容性均較好。

為了篩選最佳載體，進一步測定滑石粉、硅藻土和蒙脫石的潤濕性能，結果表明，硅藻土的潤濕時間為2.75"min，顯著低于蒙脫石和滑石粉；滑石粉次之，為37.50"min；蒙脫石的潤濕時間最長，為245.00"min。因此，綜合載體相容性以及潤濕性能測定結果，篩選硅藻土為粉劑的最佳載體。

2.3.2""潤濕劑的篩選""爪哇蟲草菌在含不同潤濕劑的孢子萌發(fā)液中進行培養(yǎng)，結果表明，0.100%和0.125%潤濕劑Morwet"EFW均與爪哇蟲草菌的相容性較好，在含0.100%和0.125%潤濕劑Morwet"EFW的孢子萌發(fā)液中培養(yǎng)后，爪哇蟲草菌的孢子萌發(fā)率分別為82.50%和54.50%，顯著大于其他潤濕劑。而爪哇蟲草菌在含0.500%潤濕劑的孢子萌發(fā)液中培養(yǎng)，其孢子均不萌發(fā)（圖9）。由此可見，潤濕劑Morwet"EFW與爪哇蟲草菌的相容性較好。

進一步測定5種潤濕劑的潤濕性能，結果表明，潤濕劑Morwet"EFW的潤濕時間為7.29"s，顯著低于其他潤濕劑；十二烷基硫酸鈉（SDS）和十二烷基苯硫酸鈉（SDBS）次之，分別為9.98"s和9.51"s；拉開粉BX和Dispwet"WP400的潤濕性能較差，其潤濕時間分別為13.93、12.35"s。因此，綜合潤濕劑的潤濕性能與相容性結果，篩選Morwet"EFW為粉劑的最佳潤濕劑。

2.3.3""分散劑的篩選""爪哇蟲草菌在含不同分散劑的孢子萌發(fā)液中進行培養(yǎng)，結果表明，1.0、2.5、5.0"mg/mL分散劑Morwet"D-425與爪哇蟲草菌的相容性較好，孢子萌發(fā)率分別為93.00%、95.50%和96.50%，分散劑Morwet"D-450次之，5.0"mg/mL時，Morwet"D-450中爪哇蟲草菌的孢子萌發(fā)率顯著低于Morwet"D-425；而木質(zhì)素Borresperse中的孢子萌發(fā)率最低，相容性最差（圖10）。由此可見，分散劑Morwet"D-425、Morwet"D-450與爪哇蟲草菌的相容性均較好。

進一步測定3種分散劑的懸浮率，結果表明，分散劑Morwet"D-450的懸浮率為85.55%，顯著高于其他分散劑；Morwet"D-425的懸浮率次之，為52.73%；而木質(zhì)素Borresperse的懸浮率最差，為25.78%。因此，綜合分散劑懸浮性能與相容性結果，篩選Morwet"D-450為粉劑的最佳分散劑。

2.3.4""紫外保護劑的篩選""爪哇蟲草菌在含不同紫外保護劑的孢子萌發(fā)液中進行培養(yǎng)，結果表明，100、500、1000"μg/mL熒光素鈉CBS-X和BASF326均與爪哇蟲草菌的相容性較好，孢子萌發(fā)率分別為92.50%和85.50%、82.50%和86.50%、74.00%和79.00%，顯著高于腐殖酸（圖11）。由此可見，熒光素鈉CBS-X和BASF326與爪哇蟲草菌的相容性較好。

進一步測定3種紫外保護劑的紫外保護性能，結果表明，在紫外燈下處理15"min時，含熒光素鈉CBS-X、腐殖酸、BASF"326的爪哇蟲草菌孢子萌發(fā)率分別為90.50%、89.00%和82.50%，均與CK無顯著性差異。紫外燈下處理30、60"min時，含熒光素鈉CBS-X的爪哇蟲草菌孢子萌發(fā)率最大，紫外保護性能最好，爪哇蟲草菌孢子萌發(fā)率分別為81.00%和64.00%；BASF"326次之，分別為61.00%和47.50%；而腐殖酸的紫外保護性能最差，爪哇蟲草菌孢子萌發(fā)率分別為45.00%和27.50%（圖12）。因此，綜合紫外保護劑與爪哇蟲草菌的相容性結果以及抗紫外性能，篩選熒光素鈉CBS-X為粉劑的最佳紫外保護劑。

2.4""爪哇蟲草菌可濕性粉劑的初步制備

綜合以上粉劑助劑的篩選結果，得出爪哇蟲草菌可濕性粉劑的配方：有效成分為爪哇蟲草菌分生孢子粉，含量為20%；潤濕劑為Morwet"EFW，含量為1%；分散劑為Morwet"D-450，含量為5%；紫外保護劑為熒光素鈉CBS-X，含量為1%；載體為硅藻土，含量為73%。

2.5""爪哇蟲草菌可濕性粉劑對捷氏吹綿蚧的防治效果

爪哇蟲草菌可濕性粉劑對捷氏吹綿蚧的田間防效如表1所示。結果表明，爪哇蟲草菌可濕性粉劑在田間對捷氏吹綿蚧具有良好的防效。在處理后7"d時，爪哇蟲草菌可濕性粉劑的防效較低（7.50%），顯著低于化學藥劑25%噻蟲嗪可濕性粉劑的防效（62.50%）。隨著處理時間的延長，各處理的防效均呈上升趨勢。在處理后14"d時，爪哇蟲草菌可濕性粉劑對捷氏吹綿蚧的防效為72.50%，顯著低于25%噻蟲嗪可濕性粉劑的防效

（87.50%）；處理后21"d，爪哇蟲草菌可濕性粉劑的防效達92.50%，與25%噻蟲嗪可濕性粉劑的防效相當，顯著高于爪哇蟲草菌純孢粉的防效，而IJID003純孢粉與對照差異不顯著。由此可見，爪哇蟲草菌的劑型有助于分生孢子藥效的充分發(fā)揮，提高了菌株對捷氏吹綿蚧的防效。就侵染速率及速效性而言，爪哇蟲草菌可濕性粉劑低于25%噻蟲嗪可濕性粉劑，但其持效性更強，且在后期感染爪哇蟲草菌的低齡捷氏吹綿蚧蟲體上，會再產(chǎn)生新的分生孢子，形成新的侵染循環(huán)（圖13）。從以上結果可知，爪哇蟲草菌可濕性粉劑對捷氏吹綿蚧有較好防效，具有替代介殼蟲常用化學藥劑25%噻蟲嗪可濕性粉劑的潛力。

3""討論

近年來，因爪哇蟲草菌具有易培養(yǎng)且產(chǎn)孢量大的優(yōu)勢，有關其菌劑的研究備受國內(nèi)科研人員的關注，但市場化、產(chǎn)業(yè)化應用仍較少[15]。而影響微生物菌劑產(chǎn)業(yè)化的主要因素是符合菌種特性的發(fā)酵水平、適合的劑型配方和更低的用料成本等[15，"22]。本研究主要通過優(yōu)化符合優(yōu)良菌株爪哇蟲草菌特性的固體發(fā)酵條件，并對其適合劑型配方進行探索，進而分析研制粉劑對害蟲捷氏吹綿蚧的田間防效。

在固體發(fā)酵條件優(yōu)化方面，基礎基質(zhì)大麥因營養(yǎng)豐富、易獲得、價格便宜等特點，通常認為是大規(guī)模生產(chǎn)真菌殺蟲劑固體發(fā)酵的首選基質(zhì)[23]。KIM等[17]研究發(fā)現(xiàn)，爪哇蟲草菌在大麥中發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)孢量高于糙米，這與本研究結果一致。本研究進一步將基礎基質(zhì)大麥與輔助麥麩共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)孢量比單獨大麥培養(yǎng)的顯著提升。已有研究表明，在固體發(fā)酵過程中基質(zhì)的表面-體積比（surface-to-volume"ratio，"SVR）及其幾何形狀、均勻性對發(fā)酵效果有重要影響[24]。通過基礎基質(zhì)與輔助基質(zhì)的共培養(yǎng)，可以有效改善發(fā)酵水平，實現(xiàn)營養(yǎng)互補，提升結構與通氣性，減少純基質(zhì)培養(yǎng)產(chǎn)孢量低的弊端[23]。ORDAZ-HERNáNDEZ等[18]將低成本的輔助基質(zhì)棕櫚仁粕與大米共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)在大米中添加5%棕櫚仁粕，爪哇蟲草菌的產(chǎn)孢量提高了40%?？梢?，共培養(yǎng)可以實現(xiàn)提升產(chǎn)孢量，這與本研究結果相似。另外，除了發(fā)酵基質(zhì)，外源添加物如營養(yǎng)物質(zhì)、酶、調(diào)節(jié)劑、吸附劑等也可以顯著影響微生物生長、代謝產(chǎn)物的生成以及發(fā)酵效率。微生物在利用碳源時，會分泌糖類水解酶來分解碳源，且同一菌種可以利用多種碳源，但對不同碳源的代謝吸收有一定差異[25]。已有研究發(fā)現(xiàn)，利于爪哇蟲草菌產(chǎn)孢的最優(yōu)碳源是葡萄糖[15，"17，"22]，這與本研究結果一致。在蟲草菌屬優(yōu)質(zhì)氮源的篩選上，添加酪蛋白、酵母提取物和酸水解酪蛋白等氮源可以顯著提高爪哇蟲草菌的產(chǎn)孢量[17，"26-27]。本研究也得出類似結果，即研究發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草菌的最優(yōu)氮源是酸水解酪蛋白，其提供的氨基酸和多肽可以顯著提升爪哇蟲草菌的產(chǎn)孢量。HOANG等[28]研究發(fā)現(xiàn)，氯化鉀的高滲透脅迫會抑制蛹蟲草（Cordyceps"militaris）菌株子實體形成及產(chǎn)孢，本研究發(fā)現(xiàn)單獨添加氯化鉀和甘氨酸導致爪哇蟲草菌的產(chǎn)孢量下降，這與前人的研究結果[28]一致。另外，BORWORN等[29]發(fā)現(xiàn)甘氨酸會促進蛹蟲草蟲草素的產(chǎn)生，而蟲草素可能具有自我抑制的作用，會影響分生孢子的產(chǎn)量。然而，本研究在大麥與麥麩組合發(fā)酵基質(zhì)基礎上，添加碳源葡萄糖、氮源酸水解酪蛋白、無機鹽氯化鉀和氨基酸甘氨酸等營養(yǎng)元素共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草菌產(chǎn)孢量比對照明顯提升?？梢姡酄I養(yǎng)元素的添加對昆蟲病原真菌發(fā)酵水平的提升具有重要的協(xié)同和增效作用[30]。

生防真菌因其特殊的生長條件以及不穩(wěn)定性，開發(fā)難度遠大于化學藥劑。因此，合適的載體及助劑是決定菌株的室外定殖能力和穩(wěn)定性的主要影響因素[31]。而可濕性粉劑作為目前我國真菌制劑的主要劑型，因其具有成本低、濕潤性高、易于運輸貯存等優(yōu)點，在生物防治方面發(fā)揮著越來越重要的作用[32]。本研究通過測定配方成分與爪哇蟲草菌的相容性及其發(fā)揮性能，篩選出最優(yōu)配方成分，制得菌劑易溶于水，形成懸浮液，便于噴霧使用。其中，在載體的選擇上，發(fā)現(xiàn)硅藻土與爪哇蟲草菌的相容性最好，且具有較好的潤濕性。硅藻土與較多昆蟲病原真菌，如球孢白僵菌[33]、淡紫擬青霉[34]等均有較好的相容性。而陳名等[19]發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草菌可濕性粉劑的最佳載體是海泡石，這可能與篩選的載體、助劑范圍及菌種特性的差異等有關，今后可以通過擴大助劑篩選范圍及規(guī)?；糯笤囼?，進一步優(yōu)化可濕性粉劑質(zhì)量。在紫外保護劑的選擇上，本研究發(fā)現(xiàn)熒光素鈉的抗紫外輻射能力最強，與陳名等[19]的研究結果一致。杜丹超等[15]研究腐殖酸作為淡紫擬青霉的可濕性粉劑紫外保護劑時，發(fā)現(xiàn)腐殖酸的保護效能顯著高于熒光素鈉，能有效降低紫外線對菌株的影響。KAISER等[35]研究發(fā)現(xiàn)腐殖酸能有效提高球孢白僵菌分生孢子的抗紫外輻射能力。但本研究發(fā)現(xiàn)腐殖酸的保護性能較差，與上述二者的研究結果不一致，這可能與不同菌種的特異性有關。

在室外防效方面，李艷瓊等[36]用8000倍25%噻蟲嗪可濕性粉劑防治為害柿樹（Diospyros"kaki）的日本蠟蚧（Ceroplastes"japonicus）雌蟲，施藥20"d后的防效為83.30%，與本研究用4000倍25%噻蟲嗪可濕性粉劑對捷氏吹綿蚧雌成蟲的防效相近；而與爪哇蟲草菌可濕性粉劑相比，對捷氏吹綿蚧雌成蟲的防效無顯著差異。另外，在后期爪哇蟲草菌逐漸感染低齡捷氏吹綿蚧蟲體上，實現(xiàn)了昆蟲病原真菌的可持續(xù)性，這一結果表明爪哇蟲草菌可濕性粉劑在一定程度上可以作為安全的生物農(nóng)藥替代部分化學農(nóng)藥，減少化學農(nóng)藥的使用量，在綠色防控中具有很大的優(yōu)勢和潛力。

本研究以分離自介殼蟲的爪哇蟲草菌菌株IJID003為材料，首先優(yōu)化篩選出爪哇蟲草菌IJID003較優(yōu)的固體發(fā)酵方法，即以大麥與麥麩為發(fā)酵基質(zhì)，添加以碳源葡萄糖、氮源酸水解酪蛋白、無機鹽氯化鉀、氨基酸甘氨酸和幾丁質(zhì)源蜂蛹殼粉等營養(yǎng)元素共培養(yǎng)；以優(yōu)化的發(fā)酵條件初步研制了爪哇蟲草菌的可濕性粉劑，其最佳組成為20%爪哇蟲草菌孢子粉、1%潤濕劑Morwet"EFW、5%分散劑Morwet"D-450、1%紫外保護劑CBS-X和73%硅藻土。田間試驗結果表明，爪哇蟲草菌可濕性粉劑對捷氏吹綿蚧具有較好防效，施藥后第21天的防效達92.50%。研究結果為介殼蟲的綠色防控提供新的生防菌劑資源。

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