激素調(diào)控對(duì)椰棗體胚發(fā)生的生理響應(yīng)及體系優(yōu)化

摘""要：椰棗為棕櫚科作物，雌雄異株，基因高度雜合，性狀分離嚴(yán)重。種苗繁育依賴于無性繁殖，組織培養(yǎng)技術(shù)是目前實(shí)現(xiàn)椰棗種苗商業(yè)化生產(chǎn)的主要手段。但是，體胚發(fā)生困難、誘導(dǎo)周期長(zhǎng)導(dǎo)致體系構(gòu)建困難、組培成本高，研究激素調(diào)控對(duì)椰棗體胚內(nèi)源代謝物質(zhì)的影響，優(yōu)化體胚發(fā)生體系成為當(dāng)務(wù)之急。本研究基于前期對(duì)椰棗外植體種類的篩選、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過對(duì)MS培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度進(jìn)行篩選配比，從愈傷組織中誘導(dǎo)出體胚，計(jì)算體胚發(fā)生率、誘導(dǎo)周期及成活率，對(duì)不同激素水平下獲得的椰棗體胚進(jìn)行取樣，觀察體胚的形態(tài)變化規(guī)律；測(cè)定樣品中總蛋白（Cpr）、可溶性糖（WSS）、過氧化氫還原酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、氨基酸（AA）、生長(zhǎng)素（auxin）、細(xì)胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）等指標(biāo)的含量變化規(guī)律。結(jié)果表明：C5（MS+30"g/L蔗糖+2"mg/L"NAA+2"mg/L"6-BA+3"mg/L"2，4-D+3"mg/L"2-ip）處理的體胚發(fā)生時(shí)間最短，在C9（MS+30"g/L蔗糖+3"mg/L"NAA+3"mg/L"6-BA+2"mg/L"2，4-D+3"mg/L"2-ip）處理下，體胚中過氧化氫酶含量和氨基酸含量最高，在C5處理下，蛋白質(zhì)含量最高；變異系數(shù)最大的為谷胱甘肽還原酶含量，極差最大的是氨基酸含量；相關(guān)性分析表明，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素均與谷胱甘肽還原酶相關(guān)性最強(qiáng)，可溶性糖與蛋白質(zhì)和氨基酸的相關(guān)性最強(qiáng)；主成分分析顯示，前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到88.714%，第1個(gè)主成分的特征值為3.877，貢獻(xiàn)率為43.076%，在第1個(gè)主成分中，主要由生長(zhǎng)素含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量及赤霉素含量這4個(gè)指標(biāo)共同影響，其中生長(zhǎng)素含量的特征值最大為0.921，主要反映生長(zhǎng)素對(duì)體胚發(fā)生的影響。本研究結(jié)果為優(yōu)化椰棗體胚發(fā)生體系提供理論依據(jù)，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)椰棗高效快繁奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：椰棗；體胚；激素；愈傷組織中圖分類號(hào)：S667.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Physiological"Response"and"System"Optimization"of"Hormone"Regulation"to"Somatic"Embryogenesis"of"Date"Palm

ZHANG"Ning1，2，"ZHANG"Tingqian3，"HAN"Yujing3，"ZHANG"Xinyue3，"YANG"Liying4，"FU"Haiquan1*，"HU"Wei1*

1."Coconut"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"National"Tropical"Palm"Germplasm"Reserve，"Wenchang，"Hainan"571300，"China;"2."College"of"Horticulture，"Nanjing"Agricultural"University，"Nanjing，"Jiangsu"210095，"China;"3."College"of"Tropical"Crops，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunnan"665000，"China;"4."Yunnan"Xinxing"Greening"Engineering"Co.，"Ltd.，"Kunming，"Yunnan"650031，"China

Abstract："Date"palm"is"hermaphroditic"and"highly"heterogeneous"in"genetics，"resulting"in"severe"phenotypic"variation."Propagation"of"seedlings"depends"on"asexual"reproduction，"and"tissue"culture"technology"is"the"main"means"of"commercializing"date"seedling"production"at"present."However，"the"difficulty"in"inducing"embryogenesis"and"the"long"induction"cycle"lead"to"difficulties"in"system"construction"and"high"tissue"culture"costs."Therefore，"it"is"urgent"to"study"the"effects"of"hormone"regulation"on"the"endogenous"metabolic"substances"of"date"embryos"and"optimize"the"embryogenesis"system."This"study"is"based"on"the"selection"of"date"explants，"induction"of"callus"and"embryogenic"callus"in"the"previous"studies，"and"uses"orthogonal"experimental"design"to"screen"and"match"the"plant"growth"regulators"and"concentrations"in"the"MS"culture"medium"to"induce"embryogenesis"fromnbsp;callus."The"study"statistically"recorded"the"embryogenesis"rate，"induction"cycle，"and"survival"rate;"date"embryos"with"different"levels"of"hormone"were"sampled;"the"morphological"changes"of"date"embryos"in"a"regular"manner"were"observed;"and"the"changes"in"the"content"of"total"protein"（Cpr），"soluble"sugar"（WSS），"catalase"（CAT），"glutathione"reductase"（GR），"amino"acids"（AA），"auxin，"cytokinin"（CTK），"abscisic"acid"（ABA），"and"gibberellin"（GA）"were"measured."The"results"showed"that"the"embryogenic"rate"of"C9"was"higher"than"that"of"C5，"C4，nbsp;C6，"and"the"time"for"embryogenesis"was"the"shortest"in"the"C5"treatment."In"the"C9"treatment，"the"highest"content"of"catalase"and"amino"acids"was"found"in"the"embryos，"and"the"highest"protein"content"was"found"in"the"C5"treatment."The"coefficient"of"variation"was"the"largest"for"glutathione"reductase"content，"and"the"maximum"difference"was"found"in"amino"acid"content."The"correlation"analysis"showed"that"thiocyanate"and"gibberellin"had"the"strongest"correlation"with"glutathione"reductase，"and"soluble"sugar"had"the"strongest"correlation"with"protein"and"amino"acid."Principal"component"analysis"showed"that"the"first"four"principal"components"accounted"for"88.714%"of"the"total"variance，"with"an"eigenvalue"of"3.877"for"the"first"principal"component，"a"contribution"rate"of"43.076%，"and"the"first"principal"component"was"mainly"influenced"by"thiocyanate"content，"soluble"sugar"content，"protein"content，"and"gibberellin"content，"with"the"highest"eigenvalue"of"0.921"for"thiocyanate"content，"reflecting"the"impact"of"thiocyanate"on"embryogenesis."The"study"would"provide"theoretical"support"for"optimizing"the"embryogenesis"system"and"laying"a"technical"foundation"for"achieving"efficient"and"rapid"propagation"of"date"palm.

Keywords："date"palm;"somatic;"hormone;"callus

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.009

椰棗樹（Phoenix"dactylifera"L.）是雌雄異株的多年生植物，屬于棕櫚科刺葵屬，具有耐旱、耐堿、耐熱的特點(diǎn)，因此能夠適應(yīng)高溫干旱、鹽堿、沙漠等極端惡劣的生態(tài)環(huán)境，廣泛分布于中東和北非等干熱地區(qū)，在我國(guó)的海南、云南、廣東等地均有分布。椰棗樹和椰棗在阿拉伯人民日常生活中扮演了極為重要的角色，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，是阿拉伯一些國(guó)家重要的出口農(nóng)作物，在阿拉伯國(guó)家的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮著重要作用[1]。椰棗樹雌雄異株，且基因高度雜合，種子繁殖性狀分離嚴(yán)重，無法保持母本的優(yōu)良特性[2-3]。無性繁殖成為椰棗種苗繁育的主要手段，無性繁殖技術(shù)包括2個(gè)方面：母株分蘗苗繁殖和組織培養(yǎng)技術(shù)。其中分蘗苗繁殖是從母株上切割下分蘗苗，然后復(fù)壯生根后田間定植[4-5]。組織培養(yǎng)技術(shù)是取椰棗的器官組織通過體胚發(fā)生途徑獲得再生植株，而后壯苗生根，溫室煉苗后田間定植[6]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以蘗苗分株的方式開展，但單株母本全生命周期內(nèi)分蘗苗數(shù)量?jī)H能達(dá)到15～25株，其繁殖數(shù)量和速度受到極大限制，難以滿足栽培種植需求。目前，國(guó)際上依賴組培手段實(shí)現(xiàn)優(yōu)良母本椰棗種苗商業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)技術(shù)由發(fā)達(dá)國(guó)家壟斷，體胚發(fā)生率低，生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致組培苗價(jià)格高昂，椰棗組培苗國(guó)際售價(jià)單株高達(dá)50美元，也成為全世界椰棗育種的關(guān)鍵技術(shù)難題。

植物體細(xì)胞胎在離體培養(yǎng)中通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑形成再生植株己是極其普遍的現(xiàn)象，并認(rèn)為該發(fā)生途徑是植物體細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下的一個(gè)基本發(fā)育途徑。體細(xì)胞胚胎發(fā)生在很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，為植物細(xì)胞分化、全能性表達(dá)及其機(jī)理等理論問題研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系[7]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑是細(xì)胞全能性表達(dá)最完全的一種方式，它不僅表明植物體細(xì)胞具有全套遺傳信息，而且重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的過程[8-9]。胚狀體具有兩極性，在適宜的環(huán)境里可以直接生成小植株，快速大量產(chǎn)生種苗。細(xì)胞突變個(gè)體的選擇和育種等方面的應(yīng)用為新品種的培育提供了新的方法。此外，體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)還在雜種合子的挽救、體細(xì)胞雜種和單倍體、三倍體等植株的誘導(dǎo)培養(yǎng)等諸多方面均有廣闊的應(yīng)用前景，不僅在科研上有著極為重要的意義，而且在生產(chǎn)實(shí)踐中也有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在椰棗離體培養(yǎng)的過程中，取樣組織材料的污染、褐變、玻璃化、愈傷組織誘導(dǎo)周期長(zhǎng)、體胚發(fā)生困難、不定芽誘導(dǎo)率低等問題是困擾組織培養(yǎng)的主要難題，也是造成椰棗組培成本高、難以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的主要原因。隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究的不斷深入，大部分植物可通過篩選合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)其不同部位組織器官、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，通過直接或間接途徑，經(jīng)分裂、分化、脫分化形成完整植株。在前期的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，椰棗外植體在進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)80～90"d后會(huì)出現(xiàn)褐化，在這個(gè)階段，需要重點(diǎn)調(diào)控組織褐變，可保證后期的愈傷組織誘導(dǎo)率提高，縮短誘導(dǎo)時(shí)間[10]。體胚發(fā)生過程中愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)很難保持一致，影響培養(yǎng)基的優(yōu)化。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素異戊烯基腺嘌呤的組合，脫落酸和聚乙二醇的組合在椰棗體細(xì)胞胚的同步化和成熟化過程中起重要作用[11-12]。萘乙酸可有效促進(jìn)胚性愈傷組織的增殖，有研究表明胚性愈傷組織在含0.1"mg/L萘乙酸（NAA）的培養(yǎng)基上可以連續(xù)生長(zhǎng)，并產(chǎn)生大量重復(fù)的體細(xì)胞胚[13]。經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)，胚性愈傷組織可形成起源于愈傷組織表面的原胚[6]。酪蛋白水解物是18種氨基酸的混合物，是鈣、磷酸鹽、幾種微量元素和維生素的來源，有研究發(fā)現(xiàn)在愈傷組織培養(yǎng)基中加入酪蛋白水解物可促進(jìn)愈傷組織的產(chǎn)生[14-15]。在MS培養(yǎng)基中添加0.5"mg/L"ABA，持續(xù)4周，可促進(jìn)胚胎成熟，并促進(jìn)貯藏蛋白質(zhì)、脂類和淀粉的積累。ABA可以抑制胚異常結(jié)構(gòu)的形成，抑制體胚的早熟萌發(fā)[17]。關(guān)于椰棗體胚對(duì)激素調(diào)控的生理響應(yīng)鮮有報(bào)道，愈傷組織在誘導(dǎo)體胚過程，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)后，體胚發(fā)生率會(huì)出現(xiàn)逐代下降的趨勢(shì)，如何精準(zhǔn)地調(diào)控細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素種類和濃度、優(yōu)化培養(yǎng)基成為提高體胚發(fā)生率及體胚質(zhì)量的關(guān)鍵問題，

也是目前國(guó)內(nèi)構(gòu)建椰棗高效再生體系亟需解決的難題。

本研究通過調(diào)配培養(yǎng)基植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度，篩選出體胚發(fā)生的最佳培養(yǎng)基，并測(cè)定不同激素水平下獲得的椰棗體胚中總蛋白、可溶性糖、還原酶類（過氧化氫還原酶、谷胱甘肽還原酶）、氨基酸、內(nèi)源激素（生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素）等含量的變化規(guī)律，篩選出不同激素配比在誘導(dǎo)體胚形成過程中具有差異性變化的內(nèi)源代謝物質(zhì)。本研究結(jié)果為優(yōu)化體胚發(fā)生體系提供理論依據(jù)，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)椰棗高效快繁奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

供試品種為埃及椰棗品種Hainay，試驗(yàn)地點(diǎn)為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所（108°21′E，"19°20′N）。

首先取椰棗的莖尖生長(zhǎng)組織作為外植體，通過調(diào)控培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，具體操作參考張寧等[10]的方法。利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，體胚發(fā)生的培養(yǎng)基處理編號(hào)為C1～C9，通過對(duì)MS培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度進(jìn)行篩選配比，從愈傷組織中分化出體胚，體胚萌發(fā)后獲得不定芽，并生根獲得脫毒苗。其中選擇體胚發(fā)生率≥30%處理下的體胚作為供試材料（圖1）。

1.2""方法

1.2.1""培養(yǎng)基的配制及影響因子設(shè)置""基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MS鹽、30"g/L蔗糖、3.5"g/L植物凝膠、1"g/L活性炭、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[（萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、異戊烯腺嘌呤（2-ip）]。調(diào)整培養(yǎng)基pH"5.7，于121"℃高溫高壓下滅菌20"min。

體胚發(fā)生試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法，按照正交表L9（43）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以NAA、6-BA、2，4-D和2-ip為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平（表1）。如表2所示，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種10個(gè)愈傷組織，重復(fù)3次。

1.2.2""培養(yǎng)條件""體胚發(fā)生試驗(yàn)：選擇胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)接至體胚發(fā)生培養(yǎng)基中，每隔45"d繼代1次，28"℃黑暗下培養(yǎng)，繼代3～5次后統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)生率及誘導(dǎo)周期。體胚發(fā)生率=（體胚發(fā)生的愈傷組織數(shù)/供試愈傷組織數(shù)）×100%

1.2.3""生理生化指標(biāo)測(cè)定""取樣不同激素水平下獲得的椰棗體胚，測(cè)定樣品中總蛋白（Cpr）、可溶性糖（WSS）、還原酶類[過氧化氫還原酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）]、氨基酸（AA）、內(nèi)源激素[生長(zhǎng)素（auxin）、細(xì)胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）]等指標(biāo)的含量。

測(cè)定生理指標(biāo)：Cpr、WSS、CAT、GR、AA、POD、SOD、HP指標(biāo)檢測(cè)所使用的試劑盒為96樣微板法，試劑盒購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司，所用設(shè)備為賽默飛的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；auxin、CTK、ABA、GA指標(biāo)檢測(cè)所使用的試劑盒為雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒，96樣微板法，試劑盒購(gòu)自Mlbio公司（酶聯(lián)生物科技有限公司），所用設(shè)備為賽默飛的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

測(cè)定原理：用純化的植物激素抗體包被微孔板，制成固相抗體，在包被單抗的微孔中依次加入植物激素，再與辣根過氧化物酶（horseradish"peroxidase，"HRP）標(biāo)記的植物激素抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后底物TMB顯色。TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物激素呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450"nm下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的激素濃度。

形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)：選擇愈傷組織、胚性愈傷組織、體胚等作為供試材料，用石蠟切片技術(shù)對(duì)組織樣本進(jìn)行切片，番紅固綠染色，觀察細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；試驗(yàn)流程：脫蠟至水-固綠染色-番紅染色-脫水封片-顯微鏡鏡檢。

1.3""數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用"Excel"軟件整理，用"SPSS"22"軟件進(jìn)行單因素、多因素方差分析、LSD法多重比較檢驗(yàn)及顯著性分析，用R語(yǔ)言（3.6.2）進(jìn)行相關(guān)性分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""不同類型培養(yǎng)基對(duì)椰棗體胚發(fā)生的影響

由表3可以看出，不同試驗(yàn)因素與水平的處理對(duì)體胚發(fā)生率及發(fā)生時(shí)間產(chǎn)生不同程度的影響。在C9處理下，體胚發(fā)生數(shù)最多，達(dá)67.33%，顯著高于其他處理（Plt;0.05），體胚發(fā)生時(shí)間為41.33"d。C5與C6體胚發(fā)生時(shí)間分別為35.33"d和35.00"d，差異不顯著，其中C5的體胚發(fā)生率達(dá)到45.67%，顯著高于C6的34.33%（Plt;0.05）。

C2和C8的體胚發(fā)生時(shí)間較長(zhǎng)，分別達(dá)到56.33"d和63.00"d，且體胚發(fā)生率僅為18.00%和13.00%，顯著低于其他處理（Plt;0.05）。由此可見C9處理可以提高體胚發(fā)生率，C5處理可以縮短體胚發(fā)生時(shí)間。

2.2""供試材料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)

由圖2可以看出，經(jīng)過番紅固綠染色后，細(xì)胞呈現(xiàn)幼嫩的綠色，具備分生的活力。C6、C4的細(xì)胞排列緊密，形狀不規(guī)則，邊緣鋸齒狀，內(nèi)部液泡豐富，分生區(qū)細(xì)胞排列致密，愈傷組織表皮細(xì)胞分化，C4的分生區(qū)胚性細(xì)胞更豐富，進(jìn)入分裂狀態(tài)的更多；C5和C9的分生區(qū)誘導(dǎo)出具備子葉的體胚，C5的子葉液泡較大，細(xì)胞排列稀疏，邊緣形狀不規(guī)則，C9的體胚細(xì)胞具有典型的線形結(jié)構(gòu)，中間有一個(gè)明顯的核區(qū)域，周圍是細(xì)胞質(zhì)，這種結(jié)構(gòu)表明它可能是一個(gè)正在分裂或分化的細(xì)胞。

2.3""體胚發(fā)生階段內(nèi)源代謝物質(zhì)含量的差異性變化及變異分析

由表4可以看出，體胚發(fā)生率最高的處理組C9，其體胚中過氧化氫酶活性和氨基酸含量顯著高于C6處理（Plt;0.05），體胚發(fā)生率僅次于C9的C5處理組，其體胚中氨基酸含量與C9處理下并無顯著差異；細(xì)胞分裂素和赤霉素含量在4組處理中均無顯著差異；C4和C5處理體胚脫落酸含量均無顯著差異，C6和C9處理體胚脫落酸含量均無顯著差異；細(xì)胞生長(zhǎng)素含量在C4和C5處理下差異并不顯著，C9和C6處理下的差異不顯著；C6處理下的體胚可溶性糖含量顯著低于C4、C5和C9，C4、C5和C9處理的體胚可溶性糖含量均無顯著差異性；C6處理的體胚蛋白質(zhì)含量顯著低于C4、C5和C9，C5處理的體胚蛋白質(zhì)含量最高。由此可見，體胚內(nèi)的氨基酸含量、過氧化氫酶活性、蛋白質(zhì)含量對(duì)體胚發(fā)生影響較大。

由表5可以看出，內(nèi)源代謝物含量指標(biāo)均存在不同程度的變異。氨基酸含量的極差最大，達(dá)742.66，生長(zhǎng)素含量的極差最小，僅有1.19。在各指標(biāo)中，變異系數(shù)最大的為谷胱甘肽還原酶活性，為10.62%，變異系數(shù)最小的為赤霉素含量?jī)H有0.36%。在9個(gè)指標(biāo)中，生長(zhǎng)素含量、細(xì)胞分裂素含量、脫落酸含量、赤霉素含量的變異系數(shù)均小于1%，且只有谷胱甘肽還原酶活性的變異系數(shù)高于10%。

2.4""體胚發(fā)生階段內(nèi)源代謝物質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表6可知，9個(gè)指標(biāo)間均存在不同程度的相關(guān)性，其中谷胱甘肽還原酶活性除了與過氧化氫酶活性呈負(fù)相關(guān)外，與其他指標(biāo)均呈正相關(guān)，與生長(zhǎng)素含量的相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.730；過氧化氫酶活性除了與谷胱甘肽還原酶活性呈負(fù)相關(guān)外，與其他指標(biāo)均呈正相關(guān)，其中相關(guān)性最強(qiáng)的為可溶性糖含量，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.603；可溶性糖與所有指標(biāo)均呈正相關(guān)，相關(guān)性最強(qiáng)為蛋白質(zhì)含量，相關(guān)系數(shù)為0.844；氨基酸含量與所有指標(biāo)均呈正相關(guān)，其中相關(guān)性最強(qiáng)為可溶性糖含量，相關(guān)系數(shù)為0.788；細(xì)胞分裂素與所有指標(biāo)均呈正相關(guān)，相關(guān)性最強(qiáng)為谷胱甘肽還原酶活性，相關(guān)系數(shù)為0.451，其次為可溶性糖含量，其相關(guān)系數(shù)為0.488。脫落酸含量與其他指標(biāo)呈正相關(guān)，其中相關(guān)性最強(qiáng)為細(xì)胞分裂素含量，相關(guān)系數(shù)為0.210，除細(xì)胞分裂素含量外，與蛋白含量、可溶性糖含量和谷胱甘肽還原酶活性的相關(guān)系數(shù)均相近。

2.5""體胚發(fā)生階段內(nèi)源代謝物質(zhì)主成分分析

采用SPSS"22.0軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到體胚發(fā)生階段內(nèi)源代謝物質(zhì)的主成分的特征值、貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率和特征向量，結(jié)果如表7、表8所示。

有研究認(rèn)為，特征值≥1或者累計(jì)貢獻(xiàn)率gt;"85%的主成分具有一定代表性[16]。由表7可知，前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到88.714%，根據(jù)累計(jì)貢獻(xiàn)率gt;85%的標(biāo)準(zhǔn)，表明這4個(gè)主成分可以反映全部指標(biāo)的大部分信息，而其他成分的特征值均lt;1，且貢獻(xiàn)率趨于平緩，代表性不強(qiáng)，因此可以用前4個(gè)主成分對(duì)椰棗內(nèi)源代謝物進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

由表7和表8可知，第1主成分的特征值為3.877，貢獻(xiàn)率為43.076%；在第1主成分中，主要包含生長(zhǎng)素含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量及赤霉素含量這4個(gè)指標(biāo)，其中生長(zhǎng)素含量的特征值最大為0.921，其次為可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量及赤霉素含量，特征值分別為0.850、0.804、0.677；第2主成分的特征值為2.325，貢獻(xiàn)率為25.835%，在第2主成分中，主要包含過氧化氫酶活性與谷胱甘肽還原酶活性2個(gè)指標(biāo)的影響，特征值分別為0.953與0.820；第3主成分的特征值為1.011，貢獻(xiàn)率為11.235%，第3主成分主要是氨基酸含量、脫落酸含量及谷胱甘肽還原酶活性3個(gè)指標(biāo)影響，特征值分別為–0.502、0.463及0.426；第4主成分的特征值為0.771，貢獻(xiàn)率為8.568%，第4主成分主要是細(xì)胞分裂素含量、脫落酸含量及赤霉素含量的影響，其特征值分別為0.495、–0.483、0.437。

3""討論

由于植物組織或細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下往往缺乏合成生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的能力，細(xì)胞的分化和分裂以及形態(tài)構(gòu)成過程中必須依靠生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素2種激素的共同作用，為此在培養(yǎng)基中添加不同種類或不同濃度的外源激素誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生已受到廣泛的重視。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素不同濃度、比例不但可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，而且能控制細(xì)胞分化和形態(tài)建成，誘導(dǎo)基因的差別表達(dá)。有研究表明胚的發(fā)育主要是生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素之間的平衡改變，導(dǎo)致了細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育途徑的改變[17]。本研究通過調(diào)配培養(yǎng)基植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度，篩選出體胚發(fā)生的最佳培養(yǎng)基，并測(cè)定不同激素水平下獲得的椰棗體胚中總蛋白、可溶性糖、還原酶類（過氧化氫還原酶、谷胱甘肽還原酶）、氨基酸、內(nèi)源激素（生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素）等含量的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同激素水平的處理對(duì)椰棗體胚的內(nèi)源代謝物含量有顯著影響。

生長(zhǎng)素含量、谷胱甘肽還原酶活性和可溶性糖含量與體胚的發(fā)生關(guān)系密切。2，4-D作為生長(zhǎng)素是誘導(dǎo)多種植物離體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞的重要激素，有以下作用機(jī)制：通過激活一些基因表達(dá)特異蛋白以促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)育，也可以抑制這些基因表達(dá)以抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)育；2，4-D濃度與DNA甲基化有關(guān)；可能與培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)部因子有關(guān)（通過改變細(xì)胞內(nèi)源IAA而起作用）[18]。陳以峰等[19]研究表明內(nèi)源IAA在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用，并認(rèn)為內(nèi)源IAA含量上升或維持在較高水平是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的一個(gè)共同標(biāo)志團(tuán)。在本研究中，生長(zhǎng)素含量最高的處理組C9顯示了最高的體胚發(fā)生率和較快的體胚發(fā)生時(shí)間，這表明生長(zhǎng)素的高含量有助于提高體胚的形成效率。此外，谷胱甘肽還原酶活性也在C9處理中達(dá)到最高，這與過氧化氫酶活性的增加一致，表明高水平的生長(zhǎng)素可能促進(jìn)了體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的活性，從而有利于維持細(xì)胞的正常生理功能并促進(jìn)體胚的形成。在椰棗體胚發(fā)生過程中，激素調(diào)控對(duì)其生理響應(yīng)的影響顯著。生長(zhǎng)素作為一種關(guān)鍵的植物激素，其含量的變化直接影響體胚的發(fā)生率和生長(zhǎng)狀態(tài)。同時(shí)，本研究也揭示了可溶性糖含量在不同處理中的變化趨勢(shì)?？扇苄蕴亲鳛樘峁┠芰康闹饕獊碓矗湓贑9處理中的較高水平可能為體胚提供了足夠的能量支持，從而有助于體胚的快速發(fā)育。

從變異系數(shù)分析來看，雖然所有指標(biāo)均表現(xiàn)出一定程度的變異，但生長(zhǎng)素、谷胱甘肽還原酶和可溶性糖是影響椰棗體胚形成的主要因素。對(duì)于不同處理下椰棗體胚內(nèi)源代謝物質(zhì)含量的變化，可以看到谷胱甘肽還原酶活性的變異系數(shù)最大，達(dá)到10.62%，而生長(zhǎng)素含量的極差最小，僅為1.19。這表明谷胱甘肽還原酶活性在試驗(yàn)中表現(xiàn)出較大的變動(dòng)，可能是由于不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)或代謝途徑的差異所致。同時(shí)，谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶和可溶性糖等內(nèi)源代謝物之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，這與它們?cè)谥参飸?yīng)對(duì)環(huán)境壓力中的共同調(diào)控作用相符合。體胚發(fā)生率最高的處理組C9顯示了較高的過氧化氫酶活性和氨基酸含量，這可能暗示著在這些培養(yǎng)條件下，椰棗體胚的生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)作用最為顯著，從而促進(jìn)了細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)合成。此外，C5處理雖然體胚發(fā)生率較C9低，但其氨基酸含量與C9無顯著差異，說明在某些激素配比下，椰棗體胚發(fā)育的生理生化指標(biāo)達(dá)到一個(gè)較為理想的狀態(tài)。這提示在實(shí)際應(yīng)用中可以通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵激素的水平來優(yōu)化體胚發(fā)生體系。崔凱榮等[20]認(rèn)為外源激素通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)基因差別表達(dá)，而引起體細(xì)胞胚胎發(fā)生。生長(zhǎng)素與其結(jié)合蛋白（SABP）結(jié)合形成的“生長(zhǎng)素-受體”復(fù)合物、ABA的胞內(nèi)受體和胞外受體、細(xì)胞分裂素結(jié)合蛋白（cBPs）等均影響特定基因的表達(dá)[21]。6-BA在蘋果體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的調(diào)控主要是在翻譯水平上而不依賴于新RNA的合成[22]。除生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素外，ABA在植物體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)中也起到很重要的作用。

通過主成分分析和綜合貢獻(xiàn)率來看，本研究發(fā)現(xiàn)前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到88.714%，表明這些指標(biāo)可以綜合反映所有變量的大部分信息。其中生長(zhǎng)素、可溶性糖、蛋白質(zhì)和赤霉素這4種內(nèi)源代謝物在第1主成分中的特征值較高，顯示了它們?cè)谝瑮楏w胚發(fā)生過程中的關(guān)鍵作用。這進(jìn)一步驗(yàn)證了在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)考慮激素種類和濃度的重要性，以及其對(duì)椰棗體胚發(fā)育影響的復(fù)雜性和多因素控制的特點(diǎn)。ABA在蔗糖調(diào)控胡蘿卜體細(xì)胞胚胎發(fā)育的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中可能是一個(gè)重要的中介信號(hào)因子[23]。ABA有可能直接作為反式因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)但更可能是先與靶細(xì)胞效應(yīng)部位結(jié)合，再通過細(xì)胞的第二信使分子傳遞信號(hào)，激活反式作用與順式作用元件結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)。體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中各種內(nèi)源激素的代謝和動(dòng)態(tài)平衡起著重要而關(guān)鍵的作用。赤霉素、乙烯、多胺等在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中也有重要作用。在皇冠草體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，GA3的變化趨勢(shì)和細(xì)胞分裂素基本相同[24]。內(nèi)源激素平衡受外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用在調(diào)節(jié)植物形態(tài)發(fā)生中具有重要作用[22]。一般認(rèn)為外源ABA有利于體細(xì)胞胚胎發(fā)育和成熟。ABA處理促進(jìn)針葉樹體細(xì)胞分化、抑制早期體細(xì)胞胚胎的發(fā)生、提高體細(xì)胞胚胎分化的同步化水平[25]。GA3抑制許多植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生?但對(duì)生根與成株有促進(jìn)作用。有報(bào)道指出GA3抑制胡蘿卜體細(xì)胞胚胎的發(fā)育，GA3對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生有副作用[26]。但GA3對(duì)紅江橙幼果體細(xì)胞胚胎后期生長(zhǎng)、水母雪蓮體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)有利[27]。

本研究結(jié)果不僅為椰棗體胚發(fā)生的機(jī)理提供了新的見解，而且為實(shí)際生產(chǎn)中如何通過調(diào)整培養(yǎng)基中激素配比來提高椰棗組織培養(yǎng)的效率提供了理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探索其他環(huán)境因子如光照、溫度等對(duì)椰棗體胚發(fā)生的影響，以全面優(yōu)化椰棗的組織培養(yǎng)體系。綜上所述，通過對(duì)椰棗體胚發(fā)生及其內(nèi)源代謝物的系統(tǒng)研究，不僅揭示了激素調(diào)控在椰棗體胚發(fā)育中的關(guān)鍵作用，也為優(yōu)化椰棗組織培養(yǎng)技術(shù)和快速繁殖體系提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

[1]"NADA"A"A"A，"AMEER"A"N"A，"TAAIN"D"A，"HAMZA"H"A."Influence"of"pollen"source"in"some"qualitative"characteristics"of"date"palm"fruits"propagated"by"offshoots"and"tissue"culture"techniques[J]."Journal"of"Physics："Conference"Series，"2020，"1660（1）："012002-012018.

[2]"AL-KHAYRI"J"M，"AL-BAHRANY"A"M."Genotype-de pendent"in"vitro"response"of"date"palm"（Phoenix"dactylifera"L.）"cultivars"to"silver"nitrate[J]."Entia"Horticulturae，"2004，"99（2）："153-162.

[3]"GADALLA"EZZ"EL-DIN"G."Direct"organogenesis"from"immature"female"inflorescence"of"date"palm"by"gradual"reduction"of"2，4-d"concentration[J]."Methods"in"Molecular"Biology，"2017，"1637："27-35.

[4]"BEKHEET"SHAWKY"A."In"vitro"conservation"of"date"palm"tissue"cultures[J]."Methods"in"Molecular"Biology，"2017，"1638："15-24.

[5]"VíCTOR"J."Involvement"of"plant"hormones"and"plant"growth"regulators"on"in"vitro"somatic"embryogenesis[J]."Plant"Growth"Regulation，"2005，"47："91-110.

[6]"FKI"L，"MASMOUDI"R，"DRIRA"N，"RIVAL"A."An"optimised"protocol"for"plant"regeneration"from"embryogenic"suspension"cultures"of"date"palm，"Phoenix"dactylifera"L."cv."Deglet"Nour[J]."Plant"Cell"Reports，"2003，"21（6）："517-524.

[7]"郭鐘深，"桂耀林."植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子[M]."北京："科學(xué)出版社，"1990.GUO"Z"S，"GUI"Y"L."Somatic"embryogenesis"and"artificial"seeds"in"plants[M]."Beijing："Science"Press，"1990."（in"Chinese）

[8]"曹孜義，"劉國(guó)民."植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M]."蘭州："甘肅出版社，"1998.CAO"Z"Y，"LIU"G"M."Plant"tissue"culture"techniques"tutorial[M]."Lanzhou："Gansu"Publishing"House，"1998."（in"Chinese）

[9]"李修慶."植物人工種子研究[M]."北京："北京大學(xué)出版社，"1990.LI"X"Q."Plant"artificial"seed"research[M]."Beijing："Peking"University"Press，"1990."（in"Chinese）

[10]"張寧，"王義，"劉心語(yǔ)，"符海泉，"李東霞，"Walid"Bnbsp;A，"王富有，"徐中亮."外植體的種類及消毒方式對(duì)椰棗胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]."分子植物育種，"2022，"20（10）："3340-3346.ZHANG"N，"WANG"Y，"LIU"X"Y，"FU"H"Q，"LI"D"X，"WALID"B"A，"WANG"F"Y，"XU"Z"L."Effects"of"explants"types"and"disinfection"methods"on"embryo"callus"induction"of"date"palm[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2022，"20（10）："3340-3346."（in"Chinese）

[11]"AMMIRATO"P"V，"STEWARD"F"C."Some"effects"of"the"environment"on"development"of"embryos"from"cultured"free"cells[J]."Botanical"Gazette，"1971，"132："149-158.

[12]"AL-KHAYRI"J"M，"AL-BAHRANY"A"M."Effect"of"abscisic"acid"and"polyethylene"glycol"on"the"synchronization"of"somatic"embryo"development"in"date"palm"（Phoenix"dactylifera"L.）[J]."Biotechnology，"2012，"11（6）："318-325.

[13]"IBRAHIM"H"A，"ELDIN"A"F"M"Z."Some"biochemical"changes"and"activities"of"antioxidant"enzymes"in"developing"date"palm"somatic"and"zygotic"embryos"in"vitro[J]."Annals"of"Agricultural"Science，"2015，"60（1）："121-130.

[14]"AL-KHAYRI"J"M."Somatic"embryogenesis"of"date"palm"（Phoenix"dactylifera"L.）"improved"by"coconut"water[J]."Biotechnology"（Faisalabad），"2010，"9（4）："477-484.

[15]"HOSNY"S，"HAMMAD"G，"EL"SHARBASY"S，"ZAYED"Z."Effect"of"coconut"milk，"casein"hydrolysate"and"yeast"extract"on"the"proliferation"of"in"vitro"Barhi"date"palm"（Phoenix"dactylifera"L.）[J]."Horticultural"Science"and"Ornamental"Plants，"2016，"8（1）："46–54.

• OTHMANI"A，"BAYOUDH"C，"DRIRA"N，"MARRAKCHI"M，"TRIFI"M."Somatic"embryogenesis"and"plant"regeneration"in"date"palm"Phoenix"dactylifera"L."cv."Boufeggous"is"significantly"improved"by"fine"chopping"and"partial"desiccation"of"embryogenic"callus[J]."Plant"Cell"Tissue"amp;"Organ"Culture，"2009，"97（1）："71-79.
• 周俊彥，"郭扶興."細(xì)胞分裂素類物質(zhì)在植物體細(xì)胞胚發(fā)生中的作用[J]."植物生理學(xué)通訊，"1996（4）："247-253.ZHOU"J"Y，"GUO"F"X."Actions"of"cytokinins"and"cytokinin-like"substances"in"somatic"embryogenesis"of"plant[J]."Plant"Physiology"Journal，"1996（4）："247-253."（in"Chinese）
• RIBNICKY"D"M，"ILIC"N，"COHEN"J"D，"COOKE"T"J."The"effects"of"exogenous"auxins"on"endogenous"indole-3-acetic"acid"metabolism"（the"implications"for"carrot"somatic"embryogenesis）[J]."Plant"Physiology，"112（2）："549-558.
• 陳以峰，"湯日圣."水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中胚性細(xì)胞出現(xiàn)與IAA的關(guān)系[J]."植物學(xué)報(bào)（英文版），"1998，"40（5）："474-477.CHEN"Y"F，"TANG"R"S."Relationship"between"the"emergence"of"embryonic"cells"and"IAA"in"somatic"cell"culture"of"rice[J]."Botany"Gazette"（English"edition），"1998，"40（5）："474-"477."（in"Chinese）
• 崔凱榮，"邢更生，"周功克，"劉新民，"王亞馥."植物激素對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)[J]."遺傳，"2000，"22（5）："349-354.CUI"K"R，"XING"G"S，"ZHOU"G"K，"LIU"X"M，"WANG"Y"F."Induction"and"regulation"of"somatic"embryogenesis"by"plant"hormones[J]."Hereditas"（Beijing），"2000，"22（5）："349-354."（in"Chinese）
• 王震宇，"張春榮，"李玲."細(xì)胞分裂素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J]."植物學(xué)通報(bào)，"2000，"17（6）："520-527."WANG"Z"Y，"ZHANG"C"R，"LI"L."Research"progress"of"cytokinin"binding"proteins[J]."Chinese"Bulletin"of"Botany，"2000，"17（6）："520-527."（in"Chinese）""
• 谷瑞升，"蔣湘寧，"郭仲琛."植物離體培養(yǎng)中器官發(fā)生調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J]."植物學(xué)通報(bào)，"1996，"16（3）："238-244.GU"R"S，"JIANG"X"N，"GUO"Z"C."Advances"in"the"studies"of"the"mechanism"of"plant"organogenesis"in"vitro[J]."Chinese"Bulletin"of"Botany，"1996，"16（3）："238-244."（in"Chinese）
• 程玉蘭，"刁豐秋，"吳乃虎，"黃美娟."蔗糖調(diào)控培養(yǎng)對(duì)胡蘿卜體細(xì)胞胚內(nèi)源ABA水平的效應(yīng)[J]."植物學(xué)報(bào)，"1999（7）："88-92.CHENG"Y"L，"DIAO"F"Q，"WU"N"H，"HUANG"M"J."Effect"of"sucrose"controlled"culture"on"endogenous"ABA"levels"in"carrot"somatic"embryos[J]."Acta"Botanica"Sinica，"1999（7）："88-92."（in"Chinese）
• 邢登輝，"趙云云."皇冠草體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其體胚發(fā)生過程中內(nèi)源激素的變化[J]."生物工程學(xué)報(bào)，"1999，"15（1）："98-103.XING"D"H，"ZHAO"Y"Y."Changes"of"endogenous"hormones"in"somatic"embryogenesis"and"somatic"embryogenesis"of"Coronaria"sinensis[J]."Chinese"Journal"of"Biotechnology，"1999，"15（1）："98-103."（in"Chinese）

[25]"王穎，"劉春朝，"陳秀蘭."ABA促進(jìn)針葉樹體細(xì)胞胚胎分化[J]."植物生理學(xué)通訊，"2002，"38（3）："273-278."WANG"Y，"LIU"C"C，"CHEN"X"L."ABA"promotes"somatic"embryo"differentiation"in"conifers[J]."Plant"Physiology"Bulletin，"2002，"38（3）："273-278."（in"Chinese）

[26]"周俊彥."植物體細(xì)胞在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體Ⅰ."植物體細(xì)胞的胚狀體發(fā)生[J]."植物生理學(xué)報(bào)，"1981（4）："92-100.ZHOU"J"Y."Embryogenesis"of"plant"somatic"cells"in"tissue"cultureⅠ."Embryogenesis"of"plant"somatic"cells[J]."Plant"Physiology"Journal，"1981（4）："92-100."（in"Chinese）

[27]"楊金玲，"趙德修，"桂耀林，"郭仲琛."水母雪蓮體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其植株再生[J]."西北植物學(xué)報(bào)，nbsp;2001（2）："252-256，"391."YANG"J"L，"ZHAO"D"X，"GUI"Y"L，"GUO"Z"C."Somatic"embryogenesis"and"plant"regeneration"of"Sausselia"medusa[J]."Acta"Botanica"Boreali-Occidentalia"Sinica，"2001（2）："252-256，"391."（in"Chinese）