紅陽獼猴桃SnRK1的克隆及其在果實中的表達(dá)分析

摘""要：紅陽獼猴桃屬于我國自主培育的優(yōu)良品種，具有獨特的紅色性狀和高糖低酸特性，因其香氣濃郁，味道獨特而備受歡迎。其果實的生長發(fā)育受到多種因素的影響，其中植物的蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶1（SnRK1）在調(diào)控碳水化合物代謝以及應(yīng)對生物和非生物脅迫方面起重要的開關(guān)作用。因此，本研究以紅陽獼猴桃為材料，克隆得到紅陽獼猴桃SnRK1家族2個基因的全長cDNA，分別命名為AcSnRK1.1和AcSnRK1.2，利用生物信息學(xué)方法分析AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、蛋白保守結(jié)構(gòu)域及順式作用元件等，并采用實時熒光定量檢測AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在不同組織和果實不同處理下的表達(dá)特性。結(jié)果表明：AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因分別含有1548、1545"bp的開放閱讀框，編碼515、514個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的氨基酸序列與其他植物SnRK1蛋白具有較高同源性；氨基酸序列顯示，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2包含了SnRK1家族特有的結(jié)構(gòu)STKc_AMPK_alpha、AMPK_C、UBA_SnRK1_plant；進(jìn)化樹分析表明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因?qū)儆赟nRK1家族；組織特異性分析顯示，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在紅陽獼猴桃各個組織中均有表達(dá)，在果實中表達(dá)豐度最高；在果實發(fā)育過程中，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)量均呈先下降后上升的趨勢；qRT-PCR分析表明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)受ABA、GA3、ET、CPPU的調(diào)控。隨著貯藏時間的增加，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢，推測AcSnRK1基因可能調(diào)控蔗糖合酶的表達(dá)。本研究結(jié)果表明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在紅陽獼猴桃果實發(fā)育和貯藏過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步闡述AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紅陽獼猴桃；SnRK1；基因克??；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析中圖分類號：S663.4""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"SnRK1"in"Actinidia"chinensis"var."Hongyang

JIANG"Kaixiu1，2，"LIU"Linya2，"HE"Bin2，"SONG"Shuyi2，"GONG"Xiaojian1*，"HUANG"Yacheng2*

1."Key"Laboratory"for"Information"System"of"Mountainous"Areas"and"Protection"of"Ecological"Environment，"Guizhou"Normal"University，"Guiyang，"Guizhou"550001，"China;"2."School"of"Biological"Science"and"Technology，"Liupanshui"Normal"University，"Liupanshui，"Guizhou"553004，"China

Abstract："Hongyang"kiwifruit"is"a"distinguished"variety"independently"developed"in"China."It"features"a"distinctive"red"coloration，"possesses"high"sugar"content"and"low"acidity，"and"is"favored"for"its"rich"aroma"and"unique"flavor"profile."The"growth"and"development"of"fruits"are"influenced"by"a"multitude"of"factors，"among"which"sucrose"non-fermenta tion-1-associated"protein"kinase"1"（SnRK1）"plays"a"pivotal"role"in"the"regulation"of"carbohydrate"metabolism"and"the"response"to"both"biotic"and"abiotic"stresses."Therefore，"in"this"study，"we"cloned"the"full-length"cDNA"of"2"genes"in"the"SnRK1"family"of"Hongyang"kiwifruit，"named"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2."The"physical"and"chemical"properties，"gene"structure，"conserved"motifs，"protein"conserved"domains，"and"cis-acting"elements"of"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"were"systematically"analyzed"using"bioinformatics"approaches."The"expression"characteristics"of"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"genes"in"different"tissues"and"fruits"were"quantitatively"detected"by"real-time"fluorescence."AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"genes"contained"an"open"reading"frame"of"1548"bp"and"1545"bp，"respectively，"encoding"proteins"containing"515"and"514"amino"acids"with"highly"consistent"sequences"（96.31%）"respectively."Both"genes"contained"10"exons"and"2"introns."Bioinformatics"analysis"showed"that"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"had"high"homology"with"other"plant"SnRK1"proteins."The"amino"acid"sequence"showed"that"STKc_AMPK_alpha，"AMPK_C"and"UBA_SnRK1_plant"were"unique"to"the"SnRK1"family."Evolutionary"tree"analysis"showed"that"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"belonged"to"the"SnRK1"family."Tissue"specific"analysis"showed"that"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"were"expressed"in"all"tissues"of"Hongyang"Kiwifruit，"but"the"expression"abundance"was"the"highest"in"fruit."During"fruit"development，"the"expression"levels"of"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"decreased"first"and"then"increased."qRT-PCR"analysis"showed"that"the"expression"of"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"was"responsive"to"ABA，"GA3，"ET"and"CPPU."With"the"increase"of"storage"time，"the"expression"levels"of"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"showed"a"downward"trend"first"and"then"an"upward"trend，"suggesting"that"AcSnRK1"gene"might"regulate"the"expression"of"sucrose"synthase."The"results"of"this"study"indicate"that"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"genes"play"an"important"role"in"the"development"and"storage"of"Hongyang"kiwifruit，"which"would"lay"a"foundation"for"further"elucidation"of"the"functions"of"AcSnRK1.1"and"AcSnRK1.2"genes.

Keywords："Actinidia"chinensis"var."Hongyang;"SnRK1;"gene"cloning;"bioinformatics"analysis;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.006

蔗糖非發(fā)酵-1相關(guān)蛋白激酶1（sucrose"non-"fermenting"1-related"protein"kinase，"SnRK1）蛋白是一類廣泛存在于植物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是酵母中SNF1和動物中AMPK的同源蛋白，是一個能量感受器，可被能量缺乏所激活[1]。SnRK1基因是由3個亞基組成的異三聚體，包括催化α亞基、支架β亞基和腺嘌呤核苷酸AMP或ADP締合γ亞基[2-3]。SnRK1是SnRK超家族中的一個重要分支，在植物中高度保守且廣泛參與了調(diào)控多種生理過程，主要參與了植物的生長發(fā)育[4]。在草莓中的研究表明，F(xiàn)aSnRK1a基因可以上調(diào)FaSUS1和FaSUS3基因表達(dá)提高蔗糖合酶（SUS）活性，促進(jìn)果實中蔗糖的積累，從而影響果實的發(fā)育[5]。馬鈴薯中的反義表達(dá)SnRK1基因可使其蔗糖合成酶基因表達(dá)急劇下調(diào)，并且導(dǎo)致蔗糖合成酶的活性降低了30%，說明SnRK1在轉(zhuǎn)錄水平上能對蔗糖合成酶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響蔗糖合成酶的活性，從而降低塊莖中淀粉含量[6]。將大麥中SnRK1進(jìn)行沉默表達(dá)，導(dǎo)致其花粉發(fā)育受阻，花粉中只含有少量或不含有淀粉，這可能與不能利用輸入的蔗糖有關(guān)，即沉默表達(dá)后的SnRK1無法激活蔗糖合成酶的活性[7]。番茄中過表達(dá)mhSnRK1基因可增加番茄葉片和成熟果實中淀粉含量[8]。以上結(jié)果表明，SnRK1通過調(diào)控蔗糖合酶的表達(dá)，在源和庫組織之間對蔗糖分配發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外，SnRK1還參與激素信號傳導(dǎo)、生物脅迫和非生物脅迫等過程，如在小麥萌發(fā)和幼苗早期生長過程中，SnRK1受到ABA的負(fù)調(diào)控[5]；在擬南芥中，SnRK1通過調(diào)控脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)和ABA信號通路參與糖和黑暗的響應(yīng)[9]。

獼猴桃也稱奇異果，含有豐富的維生素C、微量元素、氨基酸和膳食纖維，此外，還具有重要的保健功能，有“水果之王”的美稱[10-12]，深受消費者喜愛，具有極高的經(jīng)濟(jì)效益[13-14]?，F(xiàn)有研究在獼猴桃果實中鑒定到較多與果實發(fā)育和品質(zhì)形成有關(guān)的基因，這些基因的調(diào)控機(jī)制為果實品質(zhì)和產(chǎn)量的改善提供了一定的基礎(chǔ)。本課題組前期研究已經(jīng)證實蔗糖合酶與果實發(fā)育密切相關(guān)[15]，且已有的研究也表明，SnRK1能夠調(diào)控蔗糖合酶的活性，影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究以紅陽獼猴桃為材料，克隆得到了2個SnRK1成員，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并分析其在紅陽獼猴桃不同組織、果實發(fā)育時期和后熟軟化階段的表達(dá)特性，以期為深入研究紅陽獼猴桃SnRK1蛋白激酶的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""供試品種為種植在貴州省六盤水市米籮鄉(xiāng)的8年生的紅陽獼猴桃。激素處理材料的采集參照劉林婭等[16]的方法。不同組織和果實不同發(fā)育時期材料的采集參照任東立等[15]的方法。后熟軟化時期的果實于花后138"d采集，分別在采集后2、4、6、8、15、17、19"d取樣。每個實驗均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，樣品采集后立即用錫箔紙包裹置于液氮中速凍，置于–80"℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA的提取。

1.1.2""菌株與試劑""逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌（Escherichia"coli）"DH5α均購自天根生化科技（北京）有限公司；Trans"Taq?"HiFi"DNA"Polymerase"High"Fidelity（HiFi）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Phanta"Max"Super-Fidelity"DNA"Polymerase"（P505）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SYBR試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他生化試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

DNA序列測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2""方法

1.2.1""AcSnRK1基因全長cDNA克隆""紅陽獼猴桃總RNA提取參照實驗室改良的CTAB法，濃度和質(zhì)量檢測符合實驗要求，可用于下一步實驗[17]。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書合成cDNA第一鏈?；诩t陽獼猴桃轉(zhuǎn)錄組測序信息，設(shè)計SnRK1基因序列的特異引物（表1），以逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為模板，利用PCR法對SnRK1基因進(jìn)行cDNA全長擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95"℃預(yù)變性5"min；95"℃變性30"s，55"℃退火30"s，72"℃延伸1.5"min，28次循環(huán)；72"℃延伸10"min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測目的條帶，并按照TIANGEN公司凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物連接到PEASY-T1載體送公司測序。

1.2.2""AcSnRK1基因的生物信息學(xué)分析""在NCBI網(wǎng)站相關(guān)程序中對SnRK1蛋白序列進(jìn)行BLAST比對和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，利用其他在線網(wǎng)站和軟件預(yù)測SnRK1蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)域以及進(jìn)行氨基酸同源比對和構(gòu)建進(jìn)化樹。

（1）AcSnRK1基因的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和染色體定位。利用ExPASY（https：//www.expasy."org/tools）在線軟件預(yù)測SnRK1氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量（MW）、理論等電點（pI），不穩(wěn)定系數(shù)（instability"index）、脂溶性系數(shù)（aliphatic"index）和疏水性（grand"average"of"hydropathicity）。使用WOLF"PSORT"（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件預(yù)測SnRK1編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。將紅陽獼猴桃基因結(jié)構(gòu)注釋信息和基因ID上傳至TBtools軟件的Gene"Location"Visualize"from"GTF/GFF工具中，分析染色體定位。

（2）SnRK1系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。使用MEGA11軟件的Clustal"W算法的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列比對，利用Neighbor-Joining法，設(shè)置1000次bootstrap檢驗重復(fù)，其他參數(shù)默認(rèn)，將得到的建樹信息導(dǎo)入EvolView"2（https：//evolgenius.info//evolview-"v2/#login）在線軟件中對進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

（3）AcSnRK1結(jié)構(gòu)域序列分析。將在Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫下載TCP轉(zhuǎn)錄因子的隱馬爾可夫模型（HMM）和NCBI的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）結(jié)果利用TBtools軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域可視化，進(jìn)一步確定目的序列均含有SnRK1蛋白結(jié)構(gòu)域。將在Clustal"X序列比對后的結(jié)果導(dǎo)入DNAMAN軟件中進(jìn)行編輯，僅保留保守結(jié)構(gòu)域序列，導(dǎo)出圖片，使用PowerPoint軟件進(jìn)行標(biāo)注，并使用WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/）在線軟件生成一致的序列標(biāo)識。

（4）AcSnRK1基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析。在MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）網(wǎng)站中上傳AcSnRK1和AcSnRK2氨基酸序列，分析紅陽獼猴桃基因家族轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)保守基序，motif最大檢索數(shù)設(shè)置為6個，其他參數(shù)為默認(rèn)值。將保守基序結(jié)果、Clustal"X序列比對后的結(jié)果、紅陽獼猴桃基因結(jié)構(gòu)注釋信息和蛋白信息導(dǎo)入TBtools軟件的Gene"Structure"View（Advanced）工具中，將目標(biāo)基因的基因結(jié)構(gòu)及保守基序進(jìn)行可視化分析。

（5）AcSnRK1基因的順式作用元件分析。將紅陽獼猴桃基因組全序列提交到TBtools軟件中，截取起始密碼子上游2000"bp序列作為基因的啟動子區(qū)，使用PlantCare（http：//bioinformatics.psb."ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，再利用TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.3""實時熒光定量PCR分析""采用伯樂公司的CFX96"Touch實時熒光定量PCR儀分析不同處理對AcSnRK1基因表達(dá)的影響，具體的操作步驟參照儀器使用說明書。取不同處理樣品的RNA為材料，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后用于實時熒光定量分析。選用18S和GAPDH作為內(nèi)參基因，基因的熒光定量引物見表1，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的TBgreenII說明書設(shè)計反應(yīng)程序。

1.3""數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均由3次重復(fù)試驗獲得，并與18s和GADPH的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化處理，以3個生物重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。實驗結(jié)果采用E–ΔΔCt算法進(jìn)行分析，使用GraphPad"Prism"9.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""AcSnRK1基因的克隆與序列分析

通過其他物種的SnRK1基因序列，在獼猴桃基因組網(wǎng)站（http：//kiwifruitgenome.org/）上進(jìn)行Blast檢索，獲得該基因的基因組序列。根據(jù)已知序列設(shè)計引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到目的基因，命名為AcSnRK1.1（PSS35124）和AcSnRK1.2（PSS33671），其全長分別為2189、2056"bp（圖1），開放閱讀框分別為1548、1545"bp，分別編碼515、514個氨基酸。氨基酸序列比對表明2個基因的氨基酸序列相似性為96.31%（圖2）。

綠色水平橫線表示STKc_AMPK_alpha保守結(jié)構(gòu)域，紫色水平橫線表示UBA_SnRK1_plant保守結(jié)構(gòu)域，紅色水平橫線表示AMPK_C保守結(jié)構(gòu)域。

2.2""AcSnRK1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1""AcSnRK1的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位及染色體定位""使用ExPASy軟件對SnRK1家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因分別編碼515、514個氨基酸，相對分子質(zhì)量為58.68、58.75"kDa，等電點為8.22、

8.56，呈堿性，不穩(wěn)定系數(shù)為45.61、45.92。Wolf亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2均定位在細(xì)胞質(zhì)中。AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在染色體定位結(jié)果顯示，2個基因隨機(jī)分布在2條染色體上，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2分別分布在2號和3號染色體上。

2.2.2""SnRK1的系統(tǒng)發(fā)育分析""利用MEGA"11軟件，采用NJ法構(gòu)建AcSnRK1.1、AcSnRK1.2與其他物種SnRK氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，AcSnRK1.1、AcSnRK1.2與同一分支的平邑甜茶（Malus"hupehensis）、桃（Prunus"persica"L.）的親源關(guān)系較近，且19個SnRK蛋白明顯聚為3個不同的組，分別對應(yīng)于SnRK蛋白家族的3個亞家族。而AcSnRK1.1和AcSnRK1.2均聚在SnRK1亞家族中（圖3），由此推斷AcSnRK1.1和AcSnRK1.2均屬于紅陽獼猴桃SnRK1亞家族成員。

2.2.3""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域及保守序列分析""利用TBtools軟件對AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因均含有2個內(nèi)含子和10個外顯子（圖4）。此外，對AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2蛋白均含有SnRK1家族特有的保守結(jié)構(gòu)域：STKc_AMPK_alpha、AMPK_C、UBA_"SnRK1_plant結(jié)構(gòu)域（圖4）。對AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示AcSnRK1.1和AcSnRK1.2蛋白均含有6個motif元件（圖4）。綜上可知同一個亞族中的成員具有高度相似的基因結(jié)構(gòu)與保守基序列，該結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分類結(jié)果一致。

2.2.4""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的啟動子順式作用元件分析""為更好地了解紅陽獼猴桃的AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及潛在功能，利用PlantCARE軟件分析AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的啟動子區(qū)域（起始密碼子上游2000"bp）的順式調(diào)控元件。結(jié)果顯示，所有啟動子序列中共有36個順式作用元件，從中篩選出17個與激素信號通路及生長發(fā)育相關(guān)順式元件[主要包含脫落酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、生長調(diào)節(jié)、干旱、低溫應(yīng)答元件]分析發(fā)現(xiàn)，AcSnRK1基因中的順式作用元件大多與生長調(diào)節(jié)（生長素、糖代謝）、激素響應(yīng)（脫落酸、赤霉素等）、脅迫應(yīng)答（脫水脅迫、創(chuàng)傷）和光響應(yīng)（光信號）等相關(guān)（圖5）。表明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的功能相對保守，每個亞族成員的表達(dá)模式比較相近。

2.3""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因表達(dá)模式分析

2.3.1""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在不同組織中的表達(dá)分析""為了分析AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在紅陽獼猴桃不同組織中的表達(dá)模式，利用qRT-PCR技術(shù)檢測其在紅陽獼猴桃的雌花、雄花、芽、樹皮、葉和果實中的表達(dá)量。結(jié)果表明：AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在紅陽獼猴桃的6個組織或器官中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，2個基因在果實中的表達(dá)量顯著高于其他組織（圖6），說明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因可能在果實的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

2.3.2""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在果實發(fā)育時期的表達(dá)分析""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在紅陽獼猴桃果實不同發(fā)育時期的表達(dá)模式如圖7所示，隨著果實的發(fā)育，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)量均呈先下降后上升的趨勢，在花后38～118"d的果實中的表達(dá)量明顯上升，差異顯著，表明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的表達(dá)和果實生長發(fā)育可能存在相關(guān)性。

2.3.3""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在不同激素中的表達(dá)分析""紅陽獼猴桃果實經(jīng)不同激素（ABA、GA3、ET、CPPU）處理后，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的表達(dá)模式如圖8所示，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在GA3處理0～6"h時，表達(dá)量明顯上調(diào)，6"h時表達(dá)量最高，6"h之后表達(dá)量開始下調(diào)；AcSnRK1.1在ET處理前期，表達(dá)量無明顯變化，9"h時表達(dá)量開始下調(diào)；AcSnRK1.2在ET處理3～6"h時，表達(dá)量呈上升趨勢，6"h后表達(dá)量開始下調(diào)；AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在CPPU處理3～9"h時表達(dá)量明顯上升，9"h后表達(dá)量開始下降；ABA處理后，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在ABA處理前期下調(diào)表達(dá)，其中，AcSnRK1.1持續(xù)下調(diào)表達(dá)，AcSnRK1.2后期上調(diào)表達(dá)但總體呈現(xiàn)下降趨勢。

2.3.4""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在果實后熟軟化階段的表達(dá)分析""AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在紅陽獼猴桃果實后熟軟化階段的表達(dá)模式如圖9所示，隨著貯藏時間的增加，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢，在第6天表達(dá)量最低，6"d后表達(dá)量逐漸升高，說明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在果實后熟軟化時期也發(fā)揮重要作用。

3""討論

SnRK1是植物體內(nèi)復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐之一[18]，參與植物碳氮代謝、生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答等多種生理過程的調(diào)控[19]。SnRK1屬于保守的基因家族[20]，本研究克隆得到紅陽獼猴桃SnRK1家族的2個基因，命名為AcSnRK1.1和AcSnRK1.2，不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05）。

分別含有1548、1545"bp的開放閱讀框，分別編碼515和514個氨基酸，預(yù)測其主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。迄今為止，已在多種植物中克隆得到SnRK1蛋白家族成員，如擬南芥3個[21]、水稻4個[22]。草莓FaSnRK1α在葉片中表達(dá)量最高，果實中表達(dá)量最低[20]。番茄SlSnRK1.2在根和莖中表達(dá)量較高，在幼嫩葉片中表達(dá)量較低[13]。PdSnRK1α在桃的根尖中表達(dá)量最高，在花蕊、韌皮部、雄蕊、葉中表達(dá)水平較低[23]。在平邑甜茶中，MhSnRK1和MhAKINβγ基因均在葉中表達(dá)量最高[24]。而AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在紅陽獼猴桃的6種組織中均有表達(dá)，在果實中表達(dá)量最高。本研究只對紅陽獼猴桃AcSnRK1家族中與果實發(fā)育最相關(guān)的2個基因進(jìn)行了分析，在紅陽獼猴桃中可能還有成員尚未被鑒定。

相關(guān)研究表明，SnRK1基因與激素信號存在緊密聯(lián)系，尤其是ABA信號[19]。本研究分析AcSnRK1.1和AcSnRK1.2對ABA、GA3、ET、CPPU處理的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，果實中的AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在ABA處理前期下調(diào)表達(dá)，其中AcSnRK1.1持續(xù)下調(diào)表達(dá)，AcSnRK1.2在ABA處理后期上調(diào)表達(dá)，這與小麥中SnRK1基因受ABA負(fù)調(diào)控的結(jié)果一致[7]。但羅靜靜等[20]研究表明，草莓果實中FaSnRK1α在ABA處理后表達(dá)量上調(diào)，說明不同物種中SnRK1基因?qū)BA是存在應(yīng)答，但是應(yīng)答模式存在差異。AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在GA3處理時呈先上升后下降的趨勢，處理6"h的表達(dá)量最高，6"h后表達(dá)量開始下調(diào)；AcSnRK1.1在ET處理時整體表達(dá)量呈下降趨勢，AcSnRK1.2在ET處理3～6"h時，表達(dá)量呈上升趨勢，6"h后表達(dá)量開始下調(diào)；AcSnRK1.1和AcSnRK1.2在CPPU處理3～9"h時表達(dá)量呈上升趨勢，9"h后表達(dá)量開始下調(diào)。這表明AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)受ABA、GA3、ET、CPPU的調(diào)控。AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的順式作用元件中包括響應(yīng)脫落酸、赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯、生長素、光響應(yīng)、生長調(diào)節(jié)、干旱、低溫等應(yīng)答元件。該結(jié)果表明，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2受ABA、GA3、ET、CPPU的調(diào)控，為后續(xù)紅陽獼猴桃通過外源激素調(diào)控SnRK1基因的表達(dá)提供了理論基礎(chǔ)。

FaSnRK1α在果實發(fā)育過程中的表達(dá)量不斷升高，到果實成熟后表達(dá)量略有下降，在果實發(fā)育過程中，F(xiàn)aSnRK1a基因可以上調(diào)FaSUS1和FaSUS3基因的表達(dá)，表明該基因在果實發(fā)育時期調(diào)控了蔗糖合酶的表達(dá)，促進(jìn)了果實的發(fā)育進(jìn)程[20]。MdSnRK1.1在番茄中過表達(dá)會影響碳氮代謝，在果實成熟進(jìn)程中起重要作用[25]。本研究中AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)量在果實發(fā)育時期和后熟軟化階段表達(dá)量均呈先下降后上升的趨勢。在果實發(fā)育過程中，花后38～118"d屬于果實快速膨大期，需要提供大量的蔗糖，AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)量在這個階段明顯上調(diào)。本實驗室前期對蔗糖合酶的研究結(jié)果表明，紅陽獼猴桃中蔗糖合酶家族的成員中存在果實快速膨大期明顯上調(diào)的基因，在后熟軟化階段也存在表達(dá)量先下降后上升的基因（數(shù)據(jù)未發(fā)表），與本研究結(jié)果一致。因此，推測AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在果實快速膨大期和果實后熟軟化階段都參與了蔗糖合酶的調(diào)控，在果實快速膨大期和果實后熟軟化階段起著重要的作用。

4""結(jié)論

本研究探討了AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因在紅陽獼猴桃果實發(fā)育和貯藏過程中可能調(diào)控蔗糖合酶的表達(dá)，并且AcSnRK1.1和AcSnRK1.2的表達(dá)受ABA、GA3、ET、CPPU的調(diào)控，為進(jìn)一步闡述AcSnRK1.1和AcSnRK1.2基因的功能奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]"任東立."‘紅陽’獼猴桃葉片蔗糖代謝關(guān)鍵酶的酶學(xué)和基因表達(dá)特性研究[D]."貴陽："貴州師范大學(xué)，"2024."REN"D"L."Enzymatic"properties"and"gene"expression"of"key"sucrose"metabolizing"enzymes"in"leaves"of"‘Hongyang’"kiwifruit[D]."Guiyang："Guizhou"Normal"University，"2024."（in"Chinese）

[2]"RUAN"Y"L."Sucrose"metabolism："gateway"to"diverse"carbon"use"and"sugar"signaling[J]."Annual"Review"of"Plant"Biology，"2014，"65（1）："33-67.

[3]"王海波，"郭俊云，"田雪蓮."小桐子SnRK1蛋白激酶α亞基基因的克隆及原核表達(dá)分析[J]."生物技術(shù)通報，"2019，"35（6）："39-47.WANG"H"B，"GUO"J"Y，"TIAN"X"L."Molecular"cloning"and"prokaryotic"expression"analysis"of"protein"kinase"SnRK1"subunit"α"gene"from"Jatropha"curcas[J]."Biotechnology"Bulletin，"2019，"35（6）："39-47."（in"Chinese）

[4]"張余，"余舜武，"李佳，"李天菲，"陳晨，"高寧寧，"羅立軍."植物SnRK1蛋白激酶研究進(jìn)展[J]."上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，"2018，"34（5）："139-148．ZHANG"Y，"YU"S"W，"LI"J，"LI"T"F，"CHEN"C，"GAO"N"N，"LUO"L"J."Research"progress"of"plant"SnRK1"protein"kinase[J]."Acta"Agriculturae"Shanghai，"2018，"34（5）："139-148."（in"Chinese）

[5]"CROZRT"P，"MARGALHA"L，"CONFRARIA"A，"MARTINHO"C."Mechanisms"of"regulation"of"SNF1/"AMPK/SnRK1"protein"kinases[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2014，"5（1）："190.

[6]"CREPIN"N，"ROLLAND"F."SnRK1"activation，"signaling，"and"networking"for"energy"homeostasis[J]."Current"Opinion"Plant"Biology，"2019，"51（1）："29-36.

[7]"羅靜靜."FaSnRK1α對草莓果實蔗糖代謝、灰霉病抗性和抗?jié)承缘挠绊慬D]."泰安："山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2022.LUO"J"J."Effects"of"FaSnRK1α"on"fruit"sucrose"metabolism，"gray"mold"and"water"logging"resistance"of"strawberry[D]."Tai’an："Shandong"Agricultural"University，"2022."（in"Chinese）

[8]"PURCELL"P"C，"SMITH"A"M，"HALFORD"N"G."Antisense"expression"of"sucrose"non-fermenting-1-related"protein"kinase"sequence"in"potato"results"in"decreased"expression"of"sucrose"synthase"in"tubers"and"loss"of"sucrose"inducibility"of"sucrose"synthase"transcripts"innbsp;leaves[J]."The"Plant"Journal，"1998，"14（2）："195-203.

[9]"ZHANG"Y，"SHEWRY"P"R，"JONES"H，"BARCELO"P，"LAZZERI"P"A，"HALFPRD"N"G."Expression"of"antisense"SnRK1"protein"kinase"sequence"causes"abnormal"pollen"development"and"male"sterility"in"transgenic"barley[J]."The"Plant"Journal，"2001，"28（4）：431-441.

[10]"JOSSIER"M，"BOULY"J"P，"MEIMOUN"P，"ARJMAND"A，"LESSARD"P，"HAWLEY"S，"GRAHAME"HARDIE"D，"THOMAS"M."SnRK1"（SNF1-related"kinase1）"has"a"central"role"in"sugar"and"ABA"signalling"in""Arabidopsis"thaliana[J]."The"Plant"Journal，"2009，"59（1）："316-328.

[11]"張維，"付復(fù)華，"羅賽男，"賴燈妮，"朱向榮，"張群."湖南紅心獼猴桃品種品質(zhì)評價及綜合分析[J]."食品與發(fā)酵工業(yè)，"2021，"47（5）："201"-210.ZHANG"W，"FU"F"H，"LUO"S"N，"LAI"D"N，"ZHU"X"R，"ZHANG"Q."Quality"analysis"and"evaluation"of"Hunan"red"kiwifruit"varieties[J]."Food"and"Fermentation"Industries，"2021，"47（5）："201-210."（in"Chinese）

[12]"黎曉茜，"龍友華，"尹顯慧，"吳小毛，"趙志博，"樊榮，"莫飛旭，"蔣艷玲，"黃亞欣，"唐靖文."茉莉酸甲酯處理對獼猴桃軟腐病菌作用機(jī)制及果實品質(zhì)的影響[J]."食品科學(xué)，"2019，"40（15）："239-248.LI"X"Q，"LONG"Y"H，"YIN"X"H，"WU"X"M，"ZHAO"Z"B，"FAN"R，"MO"F"X，"JIANG"Y"L，"HUANG"Y"X，"TANG"J"W."Mechanism"of"action"of"methyl"jasmonate"against"kiwifruit"soft"rot"and"its"effect"on"fruit"quality[J]."Food"Science，"2019，"40（15）："239-248."（in"Chinese）

[13]"梁郅林."番茄SlSnRK1.2基因在番茄與灰霉菌互作過程中的功能研究[D]."合肥："安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2023.LIANG"Z"L."Functional"analysis"of"SlSnRK1.2"in"interaction"between"tomato"and"Botrytis"cinerea[D]."Hefei："Anhui"Agricultural"University，"2023.nbsp;（in"Chinese）

[14]"黃興成，"朱華清，"楊葉華，"李渝，"張雅蓉，"劉彥伶，"蔣太明."貴州省獼猴桃產(chǎn)量特征及影響因素分析[J]."中國果樹，"2023（2）："117-121.HUANG"X"C，"ZHU"H"Q，"YANG"Y"H，"LI"Y，"ZHANG"Y"R，"LIU"Y"L，"JIANG"T"M."Analysis"on"yield"characteristics"and"influencing"factors"of"kiwifruit"in"Guizhou"province[J]."China"Fruits，"2023（2）："117-121."（in"Chinese）

[15]"任東立，"黃亞成，"劉林婭，"何斌，"魯明秋，"龔小見."‘紅陽’獼猴桃蔗糖合成酶（AcSUS1）的克隆與表達(dá)分析[J/OL]."分子植物育種."（2023-03-15）[2024-08-14]."http：//kns.cnki.net/"kcms/detail/46.1068.s.20230314.1512.024.html.REN"D"L，"HUANG"Y"C，"LIU"L"Y，"HE"B，"LU"M"Q，"GONG"X"J."Cloning"and"expression"analysis"of"sucrose"synthase"（AcSUS1）"in"‘Hongyang’"kiwifruit[J/OL]."Molecular"Plant"Breeding."（2023-03-15）[2024-08-14]."http：//kns.cnki.net/kcms/"detail/46.1068.s.20230314.1512.024.html."（in"Chinese）

[16]"劉林婭，"楊那，"羅宇璇，"何斌，"趙艷妹，"宋姝熠，"黃亞成."‘紅陽’獼猴桃金屬硫蛋白基因AcMT2的克隆、表達(dá)分析及功能鑒定[J/OL]."分子植物育種，"（2024-02-26）[2024-08-23]."http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20240223.1502.010."html.LIU"L"Y，"YANG"N，"LUO"Y"X，"HE"B，"ZHAO"Y"M，"SONG"S"Y，"HUANG"Y"C."Cloning"expression"analysis"and"functional"characterization"of"AcMT2"in"Actinidia"chinensis"var."‘Hong"yang’[J/OL]."Molecular"Plant"Breeding，"（2024-02-26）[2024-"08-23]."http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20240223."1502.010.html."（in"Chinese）

• 劉林婭，"楊那，"代玥，"羅彩，"陳婷."一種大量提取獼猴桃不同組織高質(zhì)量總RNA的方法[J]."江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，"2020，"32（9）："30-34.LIU"L"Y，"YANG"N，"DAI"Y，"LUO"C，"CHEN"T."An"efficient"method"for"isolating"high-quality"total"RNA"from"different"tissues"of"kiwifruit"（Actinidia"chinensis）[J]."Acta"Agriculturae"Jiangxi，nbsp;2020，"32（9）："30-34."（in"Chinese）
• LASTDRAGER"J，"HANSON"J，"SMEEKENS"S."Sugar"signals"and"the"control"of"plant"growth"and"development[J]."Journal"of"Experiment"Botany，"2014，"65（1）："799-807.

[19]"EMANUELLE"S，"DOBLIN"M"S，"STAPLETON"D"I."Molecular"insights"into"the"enigmatic"metabolic"regulator，"SnRK1[J]."Trends"in"Plant"Science，"2016，"21（1）："341-353.

[20]"羅靜靜，"張亞飛，"張淑輝，"彭福田，"肖元松."草莓蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶1（SnRK1）α亞基編碼基因的克隆及表達(dá)分析[J]."植物生理學(xué)報，"2018，"54（8）："1341-1348．LUO"J"J，"ZHANG"Y"F，"ZHANG"S"H，"PENG"F"T，"XIAO"Y"S."Cloning"and"expression"analysis"of"the"gene"encoding"the"α-subunit"of"strawberry"sucrose"non-fermentation-1-associ ated"protein"kinase"1（SnRK1）[J]."Plant"Physiology"Journal"2018，"54（8）："1341-1348."（in"Chinese）

[21]"劉月."擬南芥SnRK1蛋白激酶調(diào)控氣孔運動的分子機(jī)制研究[D]."濟(jì)南："山東大學(xué)，"2020．LIU"Y."Functional"analysis"of"SnRK1"kinase"regulating"stomatal"movement"in"Arabidopsis[D]."Jinan："Shandong"University，"2020."（in"Chinese）

[22]"何藝琴."小麥SnRK基因家族鑒定、進(jìn)化及功能分析[D]."荊州："長江大學(xué)，"2021．HE"Y"Q."Identification，"evolution"and"functional"analysis"of"SnRK"gene"family"in"wheat[D]."Jingzhou："Yangtze"University，"2021."（in"Chinese）

[23]"于文英."桃SnRK1α促進(jìn)根毛發(fā)生和生長的機(jī)理研究[D]."泰安："山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2024.YU"W"Y."The"mechanism"of"SnRK1α"promoting"the"generation"and"growth"of"root"hair"in"peach[D]."Tai’an："Shandong"Agricultural"University，"2024."（in"Chinese）

[24]"李光杰."平邑甜茶SnRK1基因的克隆、表達(dá)及其功能的研究[D]."泰安："山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2009.LI"G"J."Cloning"and"expressing"regulation"of"sucrose"non-fermenting-1-related"protein"kinase-1"（SnRK1）"from"Pingyitiancha"（Malus"hupehensis"Rehd.）"and"researching"ofits"function[D]."Tai’an："Shandong"Agricultural"University，"2009."（in"Chinese）

[25]"WANG"X，"PENG"F，"LI"M."Expression"of"a"heterologous"SnRK1"in"tomato"increases"carbon"assimilation，"nitrogen"uptake"and"modifies"fruit"development[J]."Journal"of"Plant"Physiology，"2012，"169（12）："1173-1182.