基于轉(zhuǎn)錄組和代謝組的大花萬代蘭根部發(fā)育、防御過程初探

摘""要：大花萬代蘭（Vanda"coerulea），為附生型植物，根裸露在空氣中生長(zhǎng)，具有重要的觀賞價(jià)值，也是蘭花育種的重要親本。從組學(xué)水平探究大花萬代蘭根的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制，能為全面了解氣生根獨(dú)特適應(yīng)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。本研究以大花萬代蘭氣生根3個(gè)不同發(fā)育水平的根部位為材料，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)，揭示大花萬代蘭根部不同部位的生長(zhǎng)發(fā)育情況及其防御適應(yīng)機(jī)制。轉(zhuǎn)錄代謝聯(lián)合分析結(jié)果顯示，2份對(duì)比組的差異表達(dá)基因（DEGs）和差異積累代謝物（DAMs）顯著富集在代謝途徑、各種次生代謝物的生物合成途徑和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等途徑。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，根部分生區(qū)（A）與伸長(zhǎng)區(qū)（B）有11"995個(gè)DEGs，上調(diào)6274個(gè)，下調(diào)5721個(gè)。伸長(zhǎng)區(qū)（B）與成熟區(qū)（C）共有3673個(gè)DEGs，上調(diào)1691個(gè)，下調(diào)1982個(gè)。代謝組結(jié)果顯示2份對(duì)比組DAMs共有102個(gè)，上調(diào)52個(gè)，下調(diào)50個(gè)。在根系的生長(zhǎng)發(fā)育上，生長(zhǎng)素（auxin）、赤霉素（GAs）、脫落酸（ABA）等相關(guān)基因在植物根部發(fā)育過程中有顯著變化。在防御適應(yīng)機(jī)制上，生物堿（alkaloids）、類黃酮（flavonoids）、木質(zhì)素（lignins）等化合物合成相關(guān)基因在根的分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)表達(dá)相對(duì)成熟區(qū)較多。說明氣生根的發(fā)育受上述激素調(diào)控且積累較多種類的次生代謝物，提高自身的防御能力。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄組；代謝組；大花萬代蘭；生長(zhǎng)發(fā)育；植物防御機(jī)制中圖分類號(hào)：S682.31""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Process"of"Root"Development"and"Defense"of"Vanda"coerulea"Based"on"Metabolome"and"Transcriptome

DAN"Dongying1，"LONG"Qiangyu2，3，"LI"Jiawei1*

1."College"of"Forestry，"Guangxi"University"/"Guangxi"Key"Laboratory"of"Forest"Ecology"and"Conservation，"Nanning，"Guangxi"530004，"China;"2."Nanning"Botanical"Garden，"Nanning，"Guangxi"530029，"China;"3."Nanning"Qingxiushan"Scenic"and"Historic"Tourism"Development"Co.，"Ltd，"Nanning，"Guangxi"530004，"China

Abstract："Vanda"coerulea，"an"epiphytic"plant"with"bare"roots"growing"in"air，"has"important"value"for"orchid"breeding"and"ornament."Exploring"the"development"and"defense"mechanism"of"the"aerial"roots"from"the"omics"level"can"provide"a"theoretical"basis"for"comprehensive"understanding"of"the"unique"adaptation"mechanism"of"aerial"roots."In"this"study，"we"used"three"root"sites"with"different"developmental"levels"of"V."coerulea"aerial"roots"as"materials，"combined"with"transcriptomics"and"metabolomics，"to"reveal"the"development"of"different"parts"of"V."coerulea"roots"and"the"defense"mechanisms."Transcription-metabolism"analysis"showed"that"the"differentially"expressed"genes"（DEGs）"and"differentially"accumulated"metabolites"（DAMs）"were"significantly"enriched"in"the"metabolic"pathway，"biosynthesis"pathway"of"various"secondary"metabolites"and"pathway"of"plant"hormone"signaling"in"two"comparison"groups."Transcriptome"analysis"showed"11"995"DEGs"between"the"meristematic"（group"A）"and"elongation"（group"B）"zones"of"the"root，"with"6274"up-regulated"and"5721"down-regulated."There"were"3673"DEGs"between"the"elongation"（group"B）"and"maturation"zone"（group"C）"of"the"root，"with"1691"up-regulated"and"1982"down-regulated."Metabolomic"results"revealed"102"DAMs"between"the"two"comparison"groups，"with"52"up-regulated"and"50"down-regulated."In"the"development"of"roots，"the"relative"expression"levels"of"growth"regulators"such"as"auxin，"gibberellins"（GAs）"and"abscisic"acid"（ABA）"had"significant"changes"in"different"developmental"stages"of"plant"roots."In"terms"of"defense"mechanism，"the"genes"related"to"the"synthesis"of"alkaloids，"flavonoids，"and"lignins"were"more"expressed"in"the"meristem"and"elongation"zone"of"roots"than"in"the"mature"zone."The"results"indicate"that"aerial"roots"development"under"the"regulation"of"the"above-mentioned"hormones"and"accumulate"a"variety"of"secondary"metabolites"to"improve"defensive"capabilities.

Keywords："mranscriptome;"metabolome;"Vanda"coerulea;"development;"plant"defense"mechanisms

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.004

蘭科（Orchidaceae）是被子植物最大的科之一，具有觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，依其所屬生態(tài)類型可分為地生蘭、附生蘭和腐生蘭3類[1]。萬代蘭屬（Vanda）植物屬于附生蘭，為單軸莖的熱帶蘭，無假鱗莖，有明顯莖干，堅(jiān)固而直立，葉片革質(zhì)，綠色。葉表面有較厚的角質(zhì)層，具較強(qiáng)的抗旱性。其花形碩壯、花姿奔放、花色艷麗，花期較長(zhǎng)，是世界知名的商品化蘭花，也是世界重要的觀賞蘭花[2]。大花萬代蘭（Vanda"coerulea）的花型較大，花色為淺紫或深藍(lán)色，花期可持續(xù)約一個(gè)月，是萬代蘭屬內(nèi)雜交育種的重要親本種質(zhì)資源[3]。萬代蘭屬植物莖上具多數(shù)粗壯的氣生根，其肥厚的圓柱狀氣生根與空氣直接接觸。前人針對(duì)萬代蘭屬植物氣生根的成熟區(qū)的結(jié)構(gòu)及光合生理已有一定研究，但對(duì)于其不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄和代謝調(diào)控仍缺少研究。

根是植物固定和吸收水分、營(yíng)養(yǎng)以支持植物生長(zhǎng)和新陳代謝的主要器官，探究根的功能性狀，是理解植物生理響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制的重要一環(huán)[4-5]。附生植物與地生植物最顯著的差異在于根的生長(zhǎng)環(huán)境缺少土壤的支持，為適應(yīng)附生環(huán)境水分與養(yǎng)分的限制，尤其水分限制，附生蘭科植物的根演化出一系列結(jié)構(gòu)和生理特征來減少水分散失、提高水分快速吸收及增加水分存儲(chǔ)。如多數(shù)附生型蘭科植物的根最外層由根被結(jié)構(gòu)覆蓋[6]，根被細(xì)胞成熟過程經(jīng)歷了與導(dǎo)管細(xì)胞類似的細(xì)胞程序化死亡過程，最終僅由細(xì)胞壁加厚的死細(xì)胞組成[7]。根被吸水達(dá)飽和非常迅速，且干燥時(shí)可減少根內(nèi)水分蒸散，具有促進(jìn)水分吸收及減少水分散失的功能[8-9]。生活在水分供應(yīng)受限強(qiáng)烈地區(qū)的蘭科植物的根，具有更厚的根被[10-12]。根的導(dǎo)管大小是影響水分運(yùn)輸?shù)闹匾笜?biāo)，附生型蘭屬（Cymbidium）植物的根較地生型植物，具有較大導(dǎo)管直徑，說明附生蘭科植物可通過提高水分吸收效率來適應(yīng)水分供應(yīng)受限的生境[11]，部分附生蘭科植物根肉質(zhì)化，皮層細(xì)胞層數(shù)增多貯藏光合產(chǎn)物及水分，具有緩沖水分限制的功能[13-15]。對(duì)附生植物氣生根發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄和代謝組學(xué)層次的研究，能為完整理解氣生根的適應(yīng)機(jī)制，以及附生植物的引種馴化和栽培育種提供理論支持。

生長(zhǎng)素（auxin）作為植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的植物激素，可通過在根尖下表面細(xì)胞中積累抑制根尖向重力生長(zhǎng)。赤霉素（GAs）可以促進(jìn)主根的伸長(zhǎng)，但會(huì)對(duì)側(cè)根、不定根的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。脫落酸（ABA）以濃度依賴和吲哚乙酸互作等方式調(diào)控植物根系生長(zhǎng)[16]。上述植物激素不僅在根系發(fā)育上發(fā)揮作用，還與部分代謝物共同參與植物根系的防御機(jī)制。植物防御機(jī)制的建立主要依賴于植物次生代謝物，這些代謝物產(chǎn)物非常豐富且其功能多樣化。據(jù)報(bào)道，生物堿（alkaloids）可以對(duì)捕食性昆蟲產(chǎn)生毒性來保護(hù)植物[17]，類黃酮（flavonoids）中的花青素可以保護(hù)植物免受干旱、溫度的脅迫[18]。木質(zhì)素（lignins）可減少病原體侵入和有害物質(zhì)對(duì)植物的損害[19]。此外，植物激素也能與類黃酮等代謝物共同參與到植物抗逆脅迫當(dāng)中，彼此制約或促進(jìn)來維持植物的生命過程。

結(jié)合前人對(duì)于根生長(zhǎng)調(diào)控的廣泛研究基礎(chǔ)，本研究針對(duì)大花萬代蘭氣生根的分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)，進(jìn)行高通量Illumina測(cè)序，探究大花萬代蘭根不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的基因調(diào)控和代謝物積累變化差異，研究結(jié)果能為了解氣生根不同階段生長(zhǎng)發(fā)育情況及其在植物防御過程中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

本研究選取大花萬代蘭根尖為研究對(duì)象，采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院資源圃溫室大棚。大棚夏季平均溫度22～30"℃，冬季平均溫度8～10"℃；平均濕度60%～70%。隨機(jī)選取3～6株根尖發(fā)育良好有氣生根的健康植株，取氣生根時(shí)，在不損傷莖的前提下，距離莖部1"mm左右用枝剪剪下。剪下的根樣品分為分生區(qū)（A）、伸長(zhǎng)區(qū)（B）和成熟區(qū)（C），并立刻用液氮保存。

1.2""方法

1.2.1""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析""將大花萬代蘭根尖9個(gè)樣本進(jìn)行RNA提取與檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。委托武漢邁維生物科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。簡(jiǎn)要流程如下：使用瓊脂糖凝膠電泳、NanoPhotometer分光光度計(jì)、Qubit"2.0熒光計(jì)、Agilent"2100生物分析儀檢測(cè)RNA，合格后方可進(jìn)行建庫。建庫起始RNA為total"RNA，總量≥1"μg，建庫試劑盒為Illumina的NEBNext?"UltraTM"RNA"Library"Prep"Kit。使用qRT-PCR對(duì)文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度高于2"nmol/L），庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina測(cè)序。

使用fastp對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，后續(xù)所有分析均基于clean"reads。使用RSEM軟件計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，使用Benjamini＆Hochberg方法校正P值。校正后的P值以及|log2"（Fold"Change）|作為顯著差異表達(dá)的閾值?；诔瑤缀螜z驗(yàn)進(jìn)行富集分析，KEGG富集分析以pathway為單位進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，GO富集分析則基于GO"term進(jìn)行。

1.2.2""代謝組測(cè)定與分析""委托武漢邁維生物科技有限公司完成代謝組測(cè)定。簡(jiǎn)要流程如下：將凍干的材料用研磨機(jī)（MM"400，"Retsch）研磨成粉末溶于甲醇萃取液中，離心10"min，去除未溶解殘?jiān)?。樣品提取液使用SCAA-104濾膜（0.22"μm，"ANPE）和CNWBOND"Carbon-GCB"SPE濾盒（ANPEL）進(jìn)行過濾。使用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS：LC，"Shim-pack"UFLC"Shimadzu"CBM30A"system;"ESI，"MS，"Applied

Biosystems"6500"QTRAP）系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。色譜分離采用ACQUITY"UPLC"HSS"T3"C18（1.8"mm，"2.1"mm×100"mm;"Waters）。

線性離子阱（LIT）和三重四極桿（QQQ）掃描在API"6500"QTRAP"LC/MS/MS系統(tǒng)上進(jìn)行，并由Analyst"1.6軟件（AB"Sciex）控制。通過參數(shù)值（m/z數(shù)據(jù)，保留時(shí)間和碎片）進(jìn)行代謝物的鑒定，鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫MetaWare（http：//www."metware.cn/）進(jìn)行比較和注釋。差異積累代謝物（DAMs）的篩選標(biāo)準(zhǔn)：選取Fold"Change≥2和Fold"Change≤0.5且VIP≥1的代謝物。

1.2.3""轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析""結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)，把結(jié)果相同組的差異表達(dá)基因（DEGs）及DAMs同時(shí)映射到KEGG條形圖上，條形圖展示了富集到某一途徑的DAMs和DEGs的數(shù)目。通過網(wǎng)絡(luò)圖來表示DAMs與DEGs之間的相關(guān)關(guān)系，圖中不同組學(xué)的物質(zhì)用不同的形狀標(biāo)出。為進(jìn)一步研究植物根部不同部位生長(zhǎng)發(fā)育及其防御機(jī)制，在差異表達(dá)閾值設(shè)定為Padj≤0.05，|Log2"（Fold"Change）|≥1的基礎(chǔ)上篩選出植物次生代謝、植物激素等相關(guān)DEGs。

1.3""數(shù)據(jù)處理

使用Excel、Origin軟件分析數(shù)據(jù)。

2""結(jié)果與分析

2.1""轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與分析

將大花萬代蘭根部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共獲得419"235"416條raw"reads，數(shù)據(jù)過濾生成平均4473.8萬個(gè)clean"reads，平均每個(gè)樣品得到6.71"Gb"clean_bases，Q20堿基百分比為97.08%～97.51%，Q30堿基百分比為92.11%～93.00%，數(shù)據(jù)整體測(cè)序錯(cuò)誤率為0.03%，低于1.00%（表1）。

根據(jù)RNAseq結(jié)果，篩選DEGs。A"vs"B共有11"995個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)6274個(gè)，下調(diào)5721個(gè)。B"vs"C共有3673個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)1691個(gè)，下調(diào)1982個(gè)（圖1）。

2.2""KEGG富集分析

對(duì)unigenes進(jìn)行注釋后，根據(jù)其參與的KEGG途徑進(jìn)行分類。結(jié)果顯示，共有48"513條參與包括細(xì)胞過程、環(huán)境信號(hào)處理、遺傳信息處理、代謝和生物系統(tǒng)的KEGG途徑，并且在A"vs"B和B"vs"C分別富集了142條和136條KEGG途徑，選取富集分析結(jié)果中q-value最低的50條KEGG途徑，繪制富集條目柱形圖（圖2A）。在A"vs"B中DEGs最多的前5條KEGG途徑為代謝途徑、次生代謝物的生物合成途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、植物-病原體相互作用途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑。在B"vs"C中DEGs最多的前5條KEGG途徑為代謝途徑、次生代謝物的生物合成途徑、植物-病原體相互作用途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和苯丙烷類生物合成途徑。2個(gè)比較組途徑的差異為淀粉和蔗糖代謝途徑、苯丙烷類生物合成途徑。

選取富集最顯著的20條途徑繪制KEGG富集散點(diǎn)圖（圖2B）。在A"vs"B中DEGs顯著富集Top"5的途徑為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、各種植物次生代謝的生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、角質(zhì)（木栓素、蠟）生物合成途徑和苯丙烷類生物合成途徑。

而在B"vs"C富集Top"20條途徑中，DEGs顯著富集Top5的途徑為植物-病原體相互作用途徑、苯丙烷類生物合成途徑、次生代謝物的生物合成途徑、各種植物次生代謝的生物合成以及角質(zhì)（木栓素、蠟）生物合成途徑。2個(gè)比較組最顯著富集途徑的差異為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、類黃酮生物合成途徑以及次生代謝物的生物合成途徑。

2.3""GO富集分析

對(duì)大花萬代蘭根部轉(zhuǎn)錄組的unigenes進(jìn)行GO注釋，結(jié)果顯示54"044（34.84%）條unigenes被注釋到GO數(shù)據(jù)庫，并被劃分到GO的三大類中。富集結(jié)果顯示，2組unigenes都以生物過程大類中的細(xì)胞過程、代謝過程等為主；在細(xì)胞組分大類中，富集于細(xì)胞解剖實(shí)體和含蛋白質(zhì)的復(fù)合物；在分子功能大類中，以結(jié)合、催化活性為主（圖3A）。

按生物過程、分子功能和細(xì)胞組分功能群對(duì)根部不同區(qū)域產(chǎn)生的DEGs進(jìn)行GO功能富集分析。結(jié)果表明，在A"vs"B中，上調(diào)基因主要富集于生物過程的細(xì)胞過程、代謝過程和刺激響應(yīng)過程；細(xì)胞組分的細(xì)胞解剖實(shí)體以及分子功能大類中的結(jié)合、催化活性。下調(diào)基因主要富集于生物過程的細(xì)胞過程、代謝過程和生物調(diào)控過程；細(xì)胞組分的細(xì)胞解剖實(shí)體以及分子功能大類中的結(jié)合、催化活性。在B"vs"C中，上調(diào)和下調(diào)基因都主要富集于生物過程的細(xì)胞過程、代謝過程和刺激響應(yīng)過程；細(xì)胞組分的細(xì)胞解剖實(shí)體以及分子功能大類中的結(jié)合、催化活性（圖3B）。

2.4""代謝組檢測(cè)與分析

基于UPLC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)和自建數(shù)據(jù)庫共檢測(cè)到2個(gè)比較組顯著DAMs共有102個(gè)，上調(diào)52個(gè)，下調(diào)50個(gè)。其中氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸、甘油酯、鞘脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、游離脂肪酸、糖類和維生素在A"vs"B分別上調(diào)6、4、0、1、0、1、2、10、0、1個(gè)，下調(diào)5、4、5、6、2、2、1、4、6、1個(gè)。在B"vs"C分別上調(diào)3、1、0、5、0、6、4、4、3、1個(gè)，下調(diào)6、1、3、0、1、0、0、1、2、0個(gè)。DAMs涉及到氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸、甘油酯、鞘脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、游離脂肪酸、糖類和維生素十類。

2.5""差異積累代謝物（DAMs）篩選與分析

從上述十類代謝產(chǎn)物中，關(guān)注到磷脂酰絲氨酸（18：2）（Lmqn008024）、溶血磷脂酰乙醇胺20：2（Lmhp010757）、溶血磷脂酰乙醇胺20：2（2n異構(gòu)）（Lmhp010514）、羥基蓖麻油酸（Lmbn007891）、9，10，11-三羥基-12-十八碳烯酸（Hmqn003054）在A"vs"B和B"vs"C中均上調(diào)表達(dá)。氧化谷胱甘肽（mws413）、茄三糖（Lmmn000214）、二氫鞘氨醇-1-磷酸（MWS0952）在A"vs"B和B"vs"C中均下調(diào)表達(dá)。

尿苷-5'-二磷酸-D-木糖（Zmfn000481）、茉莉酰-L-異亮氨酸（pme2074）、D-松醇（mws2104）、半乳糖醇（pme2237）、D-甘露醇（mws1155）、異抗壞血酸（MWSmce690）、溶血磷脂酰膽堿19：0（pmb2228）、溶血磷脂酰乙醇胺18：1（2n異構(gòu)）*（pmb0856）在Anbsp;vs"B中下調(diào)表達(dá)，B"vs"C中上調(diào)表達(dá)。9-過氧-10E，12Z-十八碳二烯酸（pmb2787）在A"vs"B上調(diào)表達(dá)，B"vs"C中下調(diào)表達(dá)（表2）。

2.6""轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析

利用兩組學(xué)共同富集到的KEGG"pathway繪制條形圖，對(duì)于共有KEGG"pathway數(shù)目超過25的，以轉(zhuǎn)錄組為準(zhǔn)，只展示P-value排名前25的途徑。結(jié)果表明2個(gè)比較組的DEGs和DAMs顯著富集在代謝途徑、次生代謝物的生物合成途徑和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑（圖4A）。篩選與上述代謝物相關(guān)的皮爾遜系數(shù)大于0.80且P-value小于0.05的DEGs繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（圖4B）。

綜上所述，結(jié)合KEGG、GO富集分析結(jié)果得出，根系發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、次生代謝物的生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、苯丙烷類生物合成途徑、代謝途徑、角質(zhì)（木栓素、蠟）生物合成途徑、植物-病原體相互作用、細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞解剖實(shí)體和含蛋白質(zhì)的復(fù)合物等過程。

2.7""植物激素相關(guān)基因分析

從A"vs"B、B"vs"C兩個(gè)比較組中篩選到與生長(zhǎng)素（auxin）有關(guān)的DEGs分別有264、83個(gè)，上調(diào)基因分別有127、35個(gè)，下調(diào)基因分別為137、48個(gè)。生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin"response"factor，"ARF）在A"vs"B、B"vs"C中總體均下調(diào)表達(dá)，生長(zhǎng)素外排PIN家族蛋白（auxin"efflux"carrier"family"protein，"PIN）在A"vs"B中總體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中上調(diào)表達(dá)，生長(zhǎng)素響應(yīng)IAA蛋白（auxin-responsive"protein，"IAA）在A"vs"B中總體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)（圖5）。

從A"vs"B、B"vs"C兩個(gè)比較組中篩選到與赤霉素（GAs）有關(guān)的DEGs分別有72、18個(gè)。上調(diào)基因分別有37、11個(gè)，下調(diào)基因分別有35、7個(gè)。其中，有赤霉素受體GID1（gibberellin"receptor，"GID1）家族基因GID1B-like（A）在A"vs"B中上調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中下調(diào)表達(dá)，GID1C（A）、GID1C-like"isoform"X1"（A）基因在A"vs"B中下調(diào)表達(dá)，B"vs"C中上調(diào)表達(dá)（圖6）。

從A"vs"B、B"vs"C兩個(gè)比較組中篩選到與脫落酸（ABA）相關(guān)DEGs分別有289、99個(gè)。上調(diào)基因分別有172、54個(gè)，下調(diào)基因分別為117、45個(gè)。其中，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SRK2（serine/threonine-protein"kinase，"SRK2）、蛋白磷酸酶2C（protein"phosphatase"2C，"PP2C）相關(guān)基因在A"vs"B中總體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)（圖6）。

正值代表代表該基因上調(diào)，"負(fù)值代表下調(diào)。

綜上表明，植物根部不同區(qū)域的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著差異，上述基因的上調(diào)、下調(diào)表達(dá)在調(diào)控根部發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

2.8""植物次生代謝物相關(guān)基因分析

從A"vs"B、B"vs"C兩個(gè)比較組中篩選到與生物堿（alkaloids）有關(guān)的DEGs分別有95、34個(gè)，上調(diào)基因分別有66、14個(gè)，下調(diào)基因分別有29、20個(gè)。其中，托品酮還原酶（tropinone"reductase"I，"TR-I）、3-O-乙酰丙烷氧烷羧酸酯酶（3-O-"acetylpapaveroxine"carboxylesterase，"CXE1）相關(guān)基因在A"vs"B總體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)（圖7）。

從A"vs"B、B"vs"C兩個(gè)比較組中篩選到與類黃酮（flavonoids）有關(guān)的DEGs分別有151、58個(gè)，上調(diào)基因分別有71、23個(gè)，下調(diào)基因分別為80、35個(gè)。其中，類黃酮3'-單加氧酶（flavonoid"3'-mono oxygenase）家族基因在A"vs"B中總體下調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中上調(diào)表達(dá)，黃酮醇合酶（flavonol"synthase，"FLS）、雙功能二氫黃酮醇4-還原酶（bifunctional"dihydroflavonol"4-reductase，"DFR）、花青素合酶（anthocyanidin"synthase，"ANS）基因總體在2組中均下調(diào)表達(dá)，異黃酮（isoflavone）基因總體2組中均上調(diào)表達(dá)（圖8）。

篩選與木質(zhì)素（Lignins）有關(guān)的DEGs。A"vs"B、B"vs"C中分別有75、57個(gè)，上調(diào)基因分別有64、22個(gè)，下調(diào)基因分別有11、35個(gè)。關(guān)注到咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeoyl-CoA-3-O-methy ltransferase，"CCoAOMT）、過氧化物酶（Peroxidase，"PRX）、阿魏酸-5-羥化酶（Ferulate-5-hydroxylase，"F5H）、肉桂酰輔酶A還原酶（Cinnamoyl-CoA"reductase，"CCR）相關(guān)基因在A"vs"B中總體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)（圖9）。

3""討論

3.1""與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的顯著富集途徑及其代謝物

植物激素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育比如胚胎形成、種子萌發(fā)、形態(tài)建成、果實(shí)成熟以及器官衰老等，以

及在抵抗環(huán)境脅迫，比如干旱、鹽堿、高溫、寒冷和洪水等非生物脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[20]，它主要由植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生。植物典型5類激素主要包括生長(zhǎng)素（auxin）、赤霉素（GAs）、細(xì)胞分裂素（cytokinin）、脫落酸（ABA）和乙烯

（ethylene）。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化當(dāng)中為了抵抗環(huán)境脅迫已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來感知和響應(yīng)外部壓力[21]。本研究富集結(jié)果表明在大花萬代蘭根部分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)產(chǎn)生了大量的植物激素來刺激根的生長(zhǎng)發(fā)育以及抵抗環(huán)境脅迫。

Auxin作為植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的植物激素，參與了根的生長(zhǎng)過程。生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARF）可以與IAA蛋白相互作用來調(diào)控auxin反應(yīng)基因的表達(dá)，而生長(zhǎng)素外排載體（PIN）家族的成員也被證明處于Aux/IAA和ARF的控制之下。IAA、ARF、PIN蛋白相互作用有助于維持Auxin穩(wěn)態(tài)[22]。本研究中，Auxin相關(guān)基因的大量表達(dá)表明，其在大花萬代蘭氣生根的發(fā)育發(fā)揮著重要作用，而ARF在A"vs"B、B"vs"C中均下調(diào)表達(dá)。PIN蛋白在A"vs"B中下調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中上調(diào)表達(dá)。IAA蛋白在A"vs"B中上調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中下調(diào)表達(dá)。說明auxin在氣生根中的反應(yīng)極其復(fù)雜，這與前人在植物根部研究中的現(xiàn)象一致，可能與IAA、ARF、PIN蛋白的相互作用有關(guān)，三者的相互調(diào)控共同維持auxin穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)氣生根的生長(zhǎng)發(fā)育。

GAs是四環(huán)二萜類化合物[23]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中有著重要的作用，它能夠影響根系發(fā)育，促進(jìn)植株根莖的伸長(zhǎng)，且較高水平的GA限制植株根系生長(zhǎng)。研究表明，GA可以促進(jìn)主根的伸長(zhǎng)，但會(huì)對(duì)側(cè)根、不定根的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響[24]。赤霉素受體（GID1）是植物GA中重要的受體之一，被鑒定為可溶性GA受體[25]，并且GID1家族有3個(gè)受體基因GID1a、GID1b和GID1c，其中GID1b被證明在根系中的表達(dá)非常強(qiáng)烈[26]。GA-GID1復(fù)合物可以引起生長(zhǎng)抑制因子DELLA蛋白的快速分解來促進(jìn)植物生長(zhǎng)，DELLA是核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可抑制GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過在內(nèi)胚層中表達(dá)穩(wěn)定的DELLA突變蛋白從而抑制根伸長(zhǎng)[27-28]。本研究GID1B-like（A）基因在根部的強(qiáng)烈表達(dá)與前人結(jié)果一致，其在A"vs"B中上調(diào)表達(dá)，B"vs"C中下調(diào)表達(dá)，這一結(jié)果證明了該基因在根系伸長(zhǎng)區(qū)部分含量較高，并且GID1B-like（A）很可能在根部作為主要的GA結(jié)合受體參與到GA-GID1的過程中引起DELLA蛋白的快速分解來促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

ABA是一種主要的非生物應(yīng)激反應(yīng)激素，可以與auxin、GA等共同調(diào)節(jié)植物根系的發(fā)育并且在維持根分生組織活性和細(xì)胞伸長(zhǎng)方面起著重要作用。研究表明ABA通過激活auxin生物合成基因的表達(dá)來促進(jìn)auxin在根系中的積累，ABA處理減小了根分生組織大小、分生組織區(qū)細(xì)胞數(shù)和成熟區(qū)細(xì)胞長(zhǎng)度，從而限制了根系伸長(zhǎng)[29]。ABA對(duì)根毛伸長(zhǎng)的影響很大程度上取決于主要的PYR/PP2C/SnRK2信號(hào)途徑，擬南芥PID編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（SNF1相關(guān)蛋白激酶2，SnRK2蛋白），該激酶通過控制PIN的亞細(xì)胞定位來調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的再分布，特別是在根尖部分，在ABA處理后，幾乎所有這些auxin生物合成基因在根尖上調(diào)[30]。蛋白磷酸酶PP2C作為ABA受體被誘導(dǎo)，PP2C能夠通過接觸使ABA信號(hào)的正調(diào)節(jié)因子SnRK2發(fā)生去磷酸化作用而失活[31]。本研究絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（SRK2）、蛋白磷酸酶（PP2C）相關(guān)基因在A"vs"B中上調(diào)，而在B"vs"C中下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了SRK2和PP2C的互作反應(yīng)主要發(fā)生于植物伸長(zhǎng)區(qū)部分，可能是通過SRK2促進(jìn)auxin在該區(qū)域的積累，而PP2C使得SRK2失活這一相互作用來控制根部伸長(zhǎng)區(qū)的伸長(zhǎng)。

3.2""與植物防御機(jī)制相關(guān)的顯著富集途徑及其代謝物

植物次生代謝途徑主要產(chǎn)生植物次生代謝物，在植物響應(yīng)環(huán)境變化過程中起到非常重要的作用。植物的次生代謝產(chǎn)物非常豐富，研究發(fā)現(xiàn)次生代謝物的功能是多樣化的，它們可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、建立植物的防御機(jī)制[32]，保護(hù)植物免受病蟲害等。目前從植物分離獲得的次生代謝產(chǎn)物主要分為三大類：包括含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的苯丙烷類、異戊烯基的萜類以及含氮的生物堿。在本實(shí)驗(yàn)中GO顯著富集于生物過程的代謝過程并結(jié)合KEGG富集表明大花萬代蘭根部會(huì)產(chǎn)生大量的次生代謝物，這些代謝物在植物-環(huán)境相互作用、植物-微生物相互作用以及促進(jìn)根的生長(zhǎng)發(fā)育上發(fā)揮調(diào)控作用。

苯丙烷途徑由芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸開始，由莽草酸途徑合成[33]，是一條重要的植物次生代謝途徑，其產(chǎn)物主要包括lignins、flavonoids和酚類化合物等，通過產(chǎn)生抵御病原物侵染的物理和化學(xué)屏障，在植物應(yīng)答逆境脅迫中扮演著重要的角色，使植物對(duì)外界生物和非生物脅迫產(chǎn)生一定的抗性作用。在本實(shí)驗(yàn)中GO和KEGG富集表明在A"vs"B、B"vs"C中，苯丙烷途徑都是最顯著富集之一的途徑，表明大花萬代蘭根尖處在發(fā)育階段組織機(jī)械強(qiáng)度比較弱的情況下，可通過化學(xué)防御應(yīng)對(duì)外部脅迫。

Alkaloids是天然存在的特性代謝物，氮是其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在的特征元素，其表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)特性，可以為植物進(jìn)行固氮來應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，包括生物和非生物反應(yīng)，如可以對(duì)蜜蜂、蠟螟等捕食性昆蟲產(chǎn)生毒性[17]。此外，紫外線UV-B還可以引起玫瑰花根毛alkaloid含量的增加以保護(hù)植物免受輻射傷害[34]。除非生物因素外，植物激素對(duì)于alkaloid也具有一定的調(diào)控作用[35-36]。Alkaloid被合成的過程中有大量不同的酶作為底物參與合成過程并且發(fā)生一系列的催化反應(yīng)，例如氧化、還原、?；?，這闡釋了本研究托品酮還原酶（TR-I）、3-O-乙酰丙烷氧烷羧酸酯酶（CXE1）在根部中的誘導(dǎo)表達(dá)以及GO富集結(jié)果中的DEGs在A"vs"B、B"vs"C中均顯著富集在分子功能大類中的酶的結(jié)合、催化活性上，TR-I和CXE1在A"vs"B中上調(diào)，而在B"vs"C中下調(diào)表達(dá)，表明根部伸長(zhǎng)區(qū)正在發(fā)生大量與alkaloid有關(guān)的植物抗逆防御反應(yīng)，而在根的成熟區(qū)這些反應(yīng)可能變慢或不顯著。

Flavonoids由苯丙烷類化合物和聚酮類化合物途徑合成[33]，是一種包含10000多種結(jié)構(gòu)的次生代謝物，廣泛存在于植物界當(dāng)中[37]。根據(jù)其基本骨架的結(jié)構(gòu)，可以分為不同的類別，如查爾酮、黃酮醇和花青素[38]。在自然界中，flavonoid參與了許多生物過程，例如黃酮醇不僅能作為信號(hào)分子與植物激素共同調(diào)控植物根系的發(fā)育[39-40]還能對(duì)干旱和鹽脅迫作出響應(yīng)[41]；光照、溫度、干旱等可以誘導(dǎo)花青素的表達(dá)以保護(hù)植物免受各種環(huán)境的脅迫[18]。Flavonoid能夠在植物與環(huán)境、植物與微生物的相互作用中起到重要作用。本研究中，F(xiàn)LS、ANS在A"vs"B、B"vs"C中均下調(diào)表達(dá)，表明其在根部分生區(qū)的含量較高，說明flavonoid類化合物對(duì)于分生區(qū)的保護(hù)作用尤為重要。成熟區(qū)由于根被的成熟，機(jī)械強(qiáng)度增加，防御相關(guān)化合物的積累顯著較少。

Lignins是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，是一種天然酚類聚合物，分子量高，組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜。其生物合成廣泛有助于抗倒伏性以及對(duì)各種生物和非生物脅迫的反應(yīng)[42]。植物細(xì)胞壁是抵御外界危害的第一道屏障，其中l(wèi)ignin能夠提供植物在面對(duì)外部環(huán)境壓力和侵襲時(shí)的抗性和防御機(jī)制，增強(qiáng)植物的抗性，減少病原體侵入和有害物質(zhì)對(duì)植物的損害。因此，lignin與植物抗病、抗蟲、耐熱、耐寒等脅迫有一定關(guān)系[19]。研究表明，在水分脅迫下lignin中咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）在大豆根部伸長(zhǎng)區(qū)顯著上調(diào)，這可能是與木質(zhì)部木質(zhì)化的增加從而限制根部水分流失有關(guān)[43]。此外，肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）基因是lignin生物合成的關(guān)鍵基因，在植物傷口或病原體感染等條件下誘導(dǎo)，并且與干旱脅迫和鹽脅迫都有很強(qiáng)的相關(guān)性[44]。本研究中的CCoAOMT、CCR在A"vs"B中上調(diào)表達(dá)，而在B"vs"C中下調(diào)表達(dá)，這與前人在大豆根部的研究結(jié)果一致，說明在植物根伸長(zhǎng)區(qū)，根的維管組織成熟，需積累較多木質(zhì)素，且木質(zhì)素中抗脅迫、抗病原體等作用在這發(fā)育過程可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

大花萬代蘭氣生根在面臨外界生物和非生物脅迫時(shí)會(huì)通過調(diào)控相關(guān)基因和代謝物進(jìn)行防御。Alkaloids、flavonoids、lignins在建立根系防御機(jī)制上發(fā)揮了重要作用，可以保護(hù)植物免受病蟲害、溫度、光照、輻射等脅迫傷害。在根系的生長(zhǎng)發(fā)育上，auxin、GAs、ABA是重要的植物激素，參與植物根部分生、伸長(zhǎng)等過程。從DEGs和DAMs在不同部位的數(shù)量可以看出，根的分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)反應(yīng)活躍，代謝物較多，并且這些代謝物參與了植物防御機(jī)制的建立、植物代謝過程以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等植物生命過程，如半乳糖醇、D-松醇可以增加植物防御相關(guān)基因的表達(dá)等[45-46]。本研究結(jié)果為萬代蘭根部發(fā)育的后續(xù)研究提供有力支持。

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