巴西橡膠樹(shù)查爾酮異構(gòu)酶HbCHI基因家族的鑒定和基因功能初步驗(yàn)證

摘""要：為了研究查爾酮異構(gòu)酶（CHI）對(duì)橡膠樹(shù)葉片發(fā)育過(guò)程中黃酮類(lèi)化合物合成的影響，本研究利用CHI的功能域Chalcone（PF02431）鑒定橡膠樹(shù)查爾酮異構(gòu)酶HbCHI基因家族成員，分析其蛋白序列理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析；利用qRT-PCR分析HbCHI在橡膠樹(shù)葉片發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析HbCHI2影響植物黃酮合成的功能。結(jié)果表明：從橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定獲得9個(gè)HbCHI基因家族成員（HbCHI1～HbCHI9），其編碼的蛋白質(zhì)包含177～474個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.1～9.52，主要為親水蛋白；大部分HbCHI含有1～3個(gè)數(shù)量不等的基序，只有HbCHI1含有6個(gè)保守基序（motif1～motif6）；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，HbCHI1～HbCHI4是I型CHI，HbCHI6～HbCHI9表現(xiàn)出脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)，是III型CHI，HbCHI5是IV型CHI；橡膠樹(shù)HbCHI基因家族的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)出從小古銅期到成熟期先下降后上升的趨勢(shì)，其中在淡綠期時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最低，且總黃酮含量與CHI基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)一致；相關(guān)性分析表明HbCHI2表達(dá)量與黃酮含量相關(guān)性最高，皮爾遜系數(shù)為0.97；在煙草中過(guò)表達(dá)HbCHI2促進(jìn)了本氏煙草中類(lèi)黃酮的生物合成，增加了葉片的總黃酮含量，是對(duì)照的2.13倍。本研究結(jié)果表明HbCHI2基因正調(diào)控橡膠樹(shù)葉片中類(lèi)黃酮生物合成。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù)；查爾酮異構(gòu)酶；基因表達(dá)；類(lèi)黃酮；基因功能中圖分類(lèi)號(hào)：S794.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identification"and"Preliminary"Verification"of"Gene"Function"of"Chalcone"Isomerase"HbCHI"Gene"Family"in"Hevea"brasiliensis

WU"Qianqian1，2，"XIA"Ling1，"YU"Fei3，"LIANG"Xiaoyu1，2，"WANG"Meng1，2，"ZHANG"Yu1，2*

1."Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."College"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China;"3."Huizhou"Customs，"Huizhou，"Guangdong"516006，"China

Abstract："In"order"to"study"the"effect"of"chalcone"isomerase"on"the"synthesis"of"flavonoids"during"the"development"of"rubber"leaves，"this"study"used"the"CHI"functional"domain"chalcone"（PF02431）"to"identify"the"HbCHI"gene"family"members"of"the"Ccalcone"isomerase，"and"to"analyze"the"physicochemical"properties，"conserved"domain，"conserved"motif"and"phylogenetic"tree"of"the"protein"sequences."qRT-PCR"was"used"to"analyze"the"expression"pattern"of"HbCHI"during"the"development"of"rubber"leaves."The"effect"of"HbCHI2"on"plant"flavonoid"synthesis"was"analyzed"using"Agrobacterium-mediated"transient"expression"technique"in"Nicotiana"benjamina."Nine"HbCHI"gene"family"members"（HbCHI1?"HbCHI9）"were"identified"from"the"genomic"database"of"H."brasiliensis."The"proteins"encoded"by"HbCHI1?HbCHI9"contained"177?474"amino"acids"with"isoelectric"points"ranging"from"5.1"to"9.52."The"proteins"were"mainly"hydrophilic"proteins."Only"HbCHI1"contained"6"conserved"motif1?motif6"motifs，"and"phylogenetic"analysis"showed"that"HBCHI1?"HBCHI4"was"type"I"CHI."HbCHI6?HbCHI9"showed"fatty"acid"binding"sites，"which"were"type"III"CHI."HbCHI5"was"type"IV"CHI."The"relative"expression"level"of"HbCHI"gene"family"in"rubber"trees"showed"a"trend"of"first"decreasing"and"then"increasing"from"small"bronzer"to"mature"stage."The"relative"expression"level"was"the"lowest"in"light"green"stage，"and"the"change"trend"of"total"flavonoids"content"was"consistent"with"the"relative"expression"level"of"CHI"gene."Correlation"analysis"showed"that"HbCHI2"had"the"highest"significant"correlation"with"flavoniods"content."The"Pearson"coefficient"was"0.97."Overexpression"of"HbCHI2"in"N."benjamina"promoted"the"biosynthesis"of"flavonoids"and"increased"the"total"flavonoids"content"in"leaves，"which"was"2.13"times"that"of"control."These"results"indicate"that"HbCHI2"gene"regulates"flavonoid"biosynthesis"in"rubber"leaves.

Keywords："Hevea"brasiliensis;"chalcone"isomerase;"gene"expression;"flavonoids;"gene"function

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.001

黃酮類(lèi)化合物在植物對(duì)生物和非生物脅迫的防御過(guò)程中起到了重要作用，已有多項(xiàng)研究報(bào)道了它們?cè)谡婢?、?xì)菌和病毒防御中的關(guān)鍵性作用[1-2]。通過(guò)作用于生長(zhǎng)素外運(yùn)載體PIN-FORM（PIN），調(diào)節(jié)極性生長(zhǎng)素運(yùn)輸（PAT），從而幫助植物更有效地應(yīng)對(duì)脅迫[3]。黃酮類(lèi)化合物中羥基的數(shù)量和位置決定了它們的自由基清除能力，并通過(guò)自由基清除機(jī)制在細(xì)胞中發(fā)揮作用[4-6]。此外，黃酮還作為信號(hào)分子，促進(jìn)根瘤菌和叢枝菌根真菌的定植，從而增強(qiáng)植物－微生物共生以抵抗脅迫[7]。通過(guò)代謝積累黃酮，植物可以激活包括苯丙烷生物合成在內(nèi)的抗真菌防御反應(yīng)[8]。已有研究表明，黃酮類(lèi)化合物的抑菌試驗(yàn)顯示其提取物對(duì)黃曲霉（Aspergillus"flavus）、厚垣鐮孢霉H"ML278（Fusarium"chlamydosporum"H"ML278）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus"aureus）具有較強(qiáng)的抑制作用[9]。

黃酮類(lèi)化合物的生物合成起始于苯丙氨酸，經(jīng)由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、反式肉桂酸4-單加氧酶（C4H）和4-香豆酸酯-CoA連接酶（4CL）等限速酶的作用，生成對(duì)香豆?；o酶A（p-coumaroyl-CoA）。隨后，通過(guò)查爾酮合酶（CHS）催化生成柚皮素查爾酮（naringenin"chalcone），再經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶（CHI）催化轉(zhuǎn)化為柚皮素（naringenin）。柚皮素在黃酮醇合酶（FLS）、類(lèi)黃酮3'-羥化酶（F3'H）及類(lèi)黃酮3'，5'-羥化酶（F3'5'H）作用下，最終轉(zhuǎn)化為山奈酚（kaempferol），并通過(guò)類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）進(jìn)一步合成為黃酮類(lèi)化合物[10]。如在鞘蕎麥的研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)CHI可以顯著提高下游F3H、F3'H和FLS相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而增加黃酮類(lèi)化合物的生物合成[11]。

查爾酮異構(gòu)酶（chalcone"isomerase，"CHI）是黃酮類(lèi)化合物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，決定植物細(xì)胞內(nèi)黃酮類(lèi)化合物的產(chǎn)生[12]。CHI分為4種類(lèi)型：Ⅰ型和Ⅱ型CHI是真正具有CHI酶活性，主要參與類(lèi)黃酮合成和花色苷積累，Ⅰ型CHI對(duì)柚皮素查爾酮表現(xiàn)出底物特異性，存在于地錢(qián)、苔蘚、蕨類(lèi)植物和大多數(shù)維管植物中[13]，Ⅱ型CHI則是豆科植物特有的[14]；Ⅲ型和Ⅳ型CHI無(wú)查爾酮環(huán)化活性，具有脂肪酸結(jié)合特性，在擬南芥的脂肪酸的合成和儲(chǔ)存中起作用[15]；Ⅳ型CHI蛋白則完全失去了CHI的催化活性，但可作為類(lèi)黃酮生成和花色素沉著的增強(qiáng)劑[16-17]。目前，已從山茶花[18]、棉花[19]、煙草[20]、桑樹(shù)[21]、銀杏[22]、馬纓杜鵑[23]等多種植物中克隆并驗(yàn)證了CHI與黃酮合成的相關(guān)性。

巴西橡膠樹(shù)（Hevea"brasiliensis）是一種落葉多年生熱帶樹(shù)種，主要生產(chǎn)天然橡膠和橡膠木[24]。在我國(guó)橡膠樹(shù)的種植過(guò)程中，面臨多種病蟲(chóng)害的威脅，其中橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病是危害最普遍且嚴(yán)重的2種葉部病害[25]。盡管黃酮類(lèi)化合物在多種植物中具有明確的作用[1-2]。但關(guān)于巴西橡膠樹(shù)黃酮代謝調(diào)控的具體機(jī)制，特別是查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因在黃酮調(diào)控中的作用，目前仍不清晰。因此，探究CHI的功能對(duì)闡釋橡膠樹(shù)黃酮合成的分子機(jī)制具有重大意義。本研究通過(guò)對(duì)橡膠樹(shù)查爾酮異構(gòu)酶基因的生物信息學(xué)分析，以及在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)，驗(yàn)證其在黃酮合成中的調(diào)節(jié)功能，為進(jìn)一步研究HbCHI2在巴西橡膠樹(shù)中的功能提供參考。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""供試材料為橡膠樹(shù)品種熱研73397芽接苗，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種苗基地提供；本氏煙草由本實(shí)驗(yàn)室提供，在溫度為25"℃、濕度60%的條件下培養(yǎng)，其光暗時(shí)間設(shè)定為10∶14。

1.1.2""菌株及載體""大腸桿菌DH5α感受態(tài)以及農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)均購(gòu)自上海吐露港生物技術(shù)有限公司；pBin載體由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3""主要試劑""多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，qPCR"Mix和高保真酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，F(xiàn)rozen-EZ"Yeast"Transformation"II"Kit"T2001（ZYMO"RESEARCH）、卡那霉素和利福平購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.2""方法

1.2.1""生物信息學(xué)分析""從Interpro（https：//www."ebi.ac.uk/interpro/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載CHI的隱馬爾科夫模型Chalcone（PF02431）作為種子序列，借助hmmer"3.0軟件于橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)中開(kāi)展篩選，獲取HbCHI基因家族成員信息。把篩選所得的橡膠樹(shù)HbCHI基因家族成員蛋白名稱(chēng)經(jīng)由NCBI進(jìn)行比對(duì)，得到橡膠樹(shù)HbCHI基因ID。運(yùn)用TBtools軟件對(duì)其蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，通過(guò)MEME（https：//meme-suite.org/meme/）在線軟件分析橡膠樹(shù)HbCHI基因家族的保守基序，利用NCBI中的BatchCD"Search工具分析HbCHI基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)TBtools中的Visualize"Gene"Structure功能生成可視化圖形。利用Mega軟件通過(guò)鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建橡膠樹(shù)與茶樹(shù)、陸地棉和擬南芥CHI的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2""HbCHI基因家族成員在橡膠樹(shù)不同發(fā)育期的表達(dá)特性分析""采集橡膠樹(shù)熱研73397的不同時(shí)期（小古銅期、大古銅期、淡綠期和成熟期）葉片，利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用ToloScript"All-in-one"RT"EasyMix"for"qPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以橡膠樹(shù)HbActin作為內(nèi)參基因，使用NCBI"Primmer"Blast設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，檢測(cè)橡膠樹(shù)HbCHIs的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，使用2?ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量。

1.2.3""橡膠樹(shù)葉片不同發(fā)育期總黃酮含量測(cè)定""采集橡膠樹(shù)不同發(fā)育時(shí)期（小古銅期S1、大古銅期S2、淡綠期S3、成熟期S4）葉片，將葉片80"℃烘干24"h后研磨，再過(guò)80目篩得到烘干樣品。稱(chēng)取100"mg樣品置于10"mL具塞玻璃管中，加入4"mL"80%甲醇，使用超聲波提取法提取2"h，隨后5000"r/min離心10"min，上清液為黃酮提取液，重復(fù)提取1次，最后加入80%甲醇定容至10"mL，待測(cè)。吸取200"μL提取液于2"mL離心管中，加入1"mL"ddH2O和60"μL"5%"NaNO2反應(yīng)6"min，加入120"μL"10%"AlCl3反應(yīng)5"min，最后加入400"μL"1"mol/L"NaOH完成反應(yīng)。使用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：先稱(chēng)取10"mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品加入80%甲醇定容至50"mL，得到0.2"mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋為0、0.008、0.016、0.032、0.048、0.064、0.080"mg/mL濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在420"nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，將吸光度帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.4""目的基因克隆及載體構(gòu)建""使用帶酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增插入片段，酶切載體（過(guò)表達(dá)載體為pBin，酶切位點(diǎn)為BamH"Ⅰ）后，利用同源重組酶連接載體和插入片段，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。一端使用載體引物，另一端使用插入片段引物對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，測(cè)序確認(rèn)插入片段序列完全正確后，則成功構(gòu)建重組載體。

1.2.5""農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)""將pBin空載（CK）以及重組質(zhì)粒借助凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101內(nèi)，運(yùn)用基因特異性引物對(duì)陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行檢測(cè)。選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子置于含有50"μg/mL卡那霉素和20"μg/mL利福平的LB培養(yǎng)液中，在28"℃的溫度條件下，以220nbsp;r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2"d。從培養(yǎng)體系中取出5"mL菌液放入50"mL的離心管內(nèi)，通過(guò)5000"r/min的轉(zhuǎn)速離心5"min，收集菌體，再使用侵染液對(duì)菌體進(jìn)行3次洗滌，最后重新懸浮菌體。使用分光光度計(jì)調(diào)節(jié)OD600至0.5，將其置于昏暗條件下2"h。選取5周齡的本氏煙草，使用注射器將分別攜帶pBin空載以及含有HbCHI2基因的農(nóng)桿菌懸浮液，逐一注入到本氏煙草葉片主葉脈的兩側(cè)。收集2、4、6"dpi葉片，進(jìn)行qRT-PCR分析。采集6"dpi葉片提取葉片總黃酮，檢測(cè)其含量。每個(gè)樣本進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2""結(jié)果與分析

2.1""HbCHI基因家族鑒定

從橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定獲得9個(gè)HbCHI基因家族成員（HbCHI1～HbCHI9），HbCHI基因編碼的蛋白質(zhì)包含177～474個(gè)氨基酸；HbCHI1、HbCHI2、HbCHI5和HbCHI9為穩(wěn)定蛋白，HbCHI3、HbCHI4和HbCHI6-HbCHI8為不穩(wěn)定蛋白；理論等電點(diǎn)為5.10～9.52；HbCHI蛋白除HbCHI1和HbCHI5外均為親水蛋白（表2）。HbCHI1含有6個(gè)保守基序（motif1～motif6），其他HbCHI含有1～3個(gè)數(shù)量不等的基序（圖1A）。不同HbCHI蛋白含有不同類(lèi)型的查爾酮超家族結(jié)構(gòu)域（chalcone_3"superfamily、PLN02804、PLN02311、PLN03175和PLN03174）（圖1B）。

2.2""HbCHI基因家族進(jìn)化分析

選取了茶樹(shù)、陸地棉與擬南芥的CHI蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），結(jié)果表明，這些CHI分成3組，HbCHI6～HbCHI9與茶樹(shù)CsCHI7和CsCHI8、陸地棉GhCHI5～GhCHI12、擬南芥的AtCHI8～"AtCHI11屬同一分支；HbCHI5與CsCHI4、GhCHI4、AtCHI6屬同一分支；HbCHI1～HbCHI4與GhCHI1～GhCHI3、AtCHI1～AtCHI5、CsCHI1～"CsCHI3、CsCHI5、CsCHI6屬同一分支。其中HbCHI1～HbCHI4是Ⅰ型CHI，而HbCHI6～HbCHI9是Ⅲ型CHI，HbCHI5是Ⅳ型CHI。

2.3""HbCHI的表達(dá)特性分析和葉片黃酮含量分析

為了研究橡膠樹(shù)葉片不同生長(zhǎng)時(shí)期（圖3A）的HbCHI表達(dá)模式和總黃酮之間的關(guān)系，本研究檢測(cè)了橡膠樹(shù)葉片不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量與黃酮含量。結(jié)果表明，在不同發(fā)育時(shí)期的橡膠葉片中，HbCHI基因的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)出從小古銅期到成熟期先下降后上升的趨勢(shì)，其中在淡綠期的相對(duì)表達(dá)量最低，且9個(gè)HbCHI基因相對(duì)表達(dá)量差異較大，HbCHI2表達(dá)量最高，在成熟期表達(dá)量高達(dá)321.79，而該時(shí)期表達(dá)量最低的基因（HbCHI6）只有0.81（圖3B）；總黃酮含量在橡膠樹(shù)不同葉片發(fā)育期差異較大，成熟期葉片含量最大，為75.44"mg/g，其次是小古銅期（70.03"mg/g），淡綠期最低，僅為37.09"mg/g（圖3C）?？傸S酮含量與HbCHI基因的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)均表現(xiàn)為先降后升。通過(guò)對(duì)總黃酮含量與HbCHI相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性熱圖分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹(shù)HbCHI的相對(duì)表達(dá)量與總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系，其中HbCHI2與總黃酮含量顯著相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.97（圖3D）。

2.4""HbCHI2的煙草瞬時(shí)表達(dá)功能驗(yàn)證

將過(guò)表達(dá)載體（OE-HbCHI2）利用農(nóng)桿菌GV3101侵染本氏煙草，對(duì)不同時(shí)間瞬時(shí)過(guò)表達(dá)的葉片進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，HbCHI2侵染后的煙草葉片在2、4、6"dpi時(shí)顯著過(guò)表達(dá)（圖4A），與對(duì)照組相比，HbCHI2侵染后的煙草葉片類(lèi)黃酮合成途徑的下游相關(guān)基因NbANS、NbF3’H、NbLAR均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)（圖4B）。在過(guò)表達(dá)的6"dpi時(shí)，本氏煙草葉片總黃酮含量相對(duì)于空載顯著提高，是空載的2.13倍（圖4C）。以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)HbCHI2促進(jìn)了本氏煙草中類(lèi)黃酮的生物合成。

3""討論

查爾酮異構(gòu)酶是黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶，控制植物生成黃酮類(lèi)化合物的速率及產(chǎn)量。前人已經(jīng)在棉花[19]和桑樹(shù)[21]等物種中鑒定出CHI基因

家族，并針對(duì)其在花色改良、系統(tǒng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答中的重要作用進(jìn)行研究。本研究鑒定得到9個(gè)橡膠樹(shù)HbCHI基因，在調(diào)控黃酮類(lèi)化合物的生物合成中具有重要功能。CHAO等[21]對(duì)2種桑樹(shù)Ⅰ型CHI的分析揭示了其在花青素積累中的作用；XU等[26]對(duì)蔥Ⅳ型CHI的研究表明，AfCHIL可以有效提高AfCHS在柚皮苷合成中的效率。本研究對(duì)橡膠樹(shù)HbCHI基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示：HbCHI1～HbCHI4為Ⅰ型CHI，是真正發(fā)揮黃酮類(lèi)化合物合成功能的CHI；沒(méi)有豆科植物專(zhuān)屬的Ⅱ型CHI，與橡膠樹(shù)作為維管植物的屬性相符；HbCHI6～HbCHI9為Ⅲ型CHI，表現(xiàn)出脂肪酸結(jié)合特性；HbCHI5為Ⅳ型CHI，充當(dāng)類(lèi)黃酮生成和花色素沉著的增強(qiáng)劑[16-17]。

本研究分析了橡膠樹(shù)葉片在不同時(shí)期的表達(dá)模式及黃酮含量，結(jié)果顯示橡膠樹(shù)CHI基因家族的相對(duì)表達(dá)量從小古銅期到成熟期呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，在淡綠期時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)。總黃酮含量的變化趨勢(shì)與HbCHI基因的表達(dá)量一致，相關(guān)性分析表明，HbCHI2與黃酮含量的相關(guān)性最高，皮爾遜系數(shù)為0.97。為驗(yàn)證橡膠樹(shù)HbCHI2基因的功能，本研究進(jìn)行了煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，煙草中過(guò)表達(dá)HbCHI2促進(jìn)了NbANS、NbF3’H、NbLAR等下游相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)了類(lèi)黃酮的生物合成，總黃酮含量因此增加了2.13倍，表明HbCHI2基因調(diào)控了橡膠樹(shù)葉片中類(lèi)黃酮的生物合成，證實(shí)了其作為I型CHI的功能。已有許多研究也支持這一結(jié)論，例如，山茶花I型CHI"CnCHI4的過(guò)表達(dá)可以顯著增加煙草和山茶花的類(lèi)黃酮生物合成[18]；馬纓杜鵑I型CHI"RdCHI1可以將底物柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為原花青素、花色苷和黃酮醇等黃酮類(lèi)化合物[23]；君子蘭I型CHI"CmCHI1和CmCHI2可以將底物柚皮素查爾酮完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物柚皮素[27]。

HbCHI2基因在黃酮生物合成中發(fā)揮了重要作用，為進(jìn)一步探究橡膠樹(shù)黃酮生物合成的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。然而，關(guān)于HbCHI2基因?qū)ο鹉z樹(shù)抗性的影響及其在生物脅迫和非生物脅迫影響下的分子機(jī)制仍不明確。因此，進(jìn)一步對(duì)HbCHI的遺傳功能及其調(diào)控機(jī)制展開(kāi)研究將會(huì)是未來(lái)的關(guān)鍵方向，這對(duì)于選育抗炭疽病和白粉病的橡膠樹(shù)品種具有重要的研究?jī)r(jià)值。

參考文獻(xiàn)

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