不同菌種固態(tài)發(fā)酵時(shí)間對(duì)甘草黃酮含量及其抗氧化特性的影響

摘要：為充分發(fā)掘與利用甘草資源，促進(jìn)發(fā)酵甘草的抗氧化研究，選取3 種不同菌種（酵母菌、米曲霉菌、黑曲霉菌）發(fā)酵的甘草黃酮為研究對(duì)象，采用乙醇回流法提取甘草中的黃酮，在甘草30 g，接種量10%、發(fā)酵溫度28 ℃、含水量80%的條件下，對(duì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化，優(yōu)化發(fā)酵后提取的甘草黃酮粗提物用D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，并測(cè)定其相關(guān)的體外抗氧化能力，探究不同菌種固態(tài)發(fā)酵時(shí)間對(duì)甘草黃酮含量和抗氧化特性的影響。結(jié)果表明，甘草在酵母菌發(fā)酵5 d、米曲霉菌發(fā)酵5 d，黑曲霉菌發(fā)酵3 d時(shí)的黃酮含量最高，經(jīng)大孔樹脂純化后黃酮含量上升，黑曲霉菌發(fā)酵組由63.8 mg·g-1上升為90.6 mg·g-1、米曲霉菌發(fā)酵組由78.2 mg·g-1上升為101.8 mg·g-1、酵母菌發(fā)酵組由54.9 mg·g-1上升為82.6 mg·g-1、未發(fā)酵組由39.6 mg·g-1上升為57.9 mg·g-1;不同菌種發(fā)酵甘草后對(duì)DPPH及ABTS自由基的清除能力顯著高于未發(fā)酵甘草，其中米曲霉發(fā)酵組的DPPH及ABTS 清除力最高。因此，酵母菌、米曲霉、黑曲霉發(fā)酵甘草能有效提高黃酮含量，大孔樹脂純化甘草黃酮后黃酮含量顯著上升，且具有更好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：甘草黃酮；固體發(fā)酵；大孔樹脂；抗氧化性；DPPH；ABTS

收稿日期：2024-09-15

基金項(xiàng)目：山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（20210302123317）;山西省中獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心。

第一作者：李達(dá)（1997-），男，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物制備和功能產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail：1033606477@qq.com。

通信作者：武曉英（1973-），女，博士，教授，從事天然產(chǎn)物制備和功能產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail：wuxy@tynu.edu.cn。

甘草是一種分布廣、利用價(jià)值高的藥食兩用豆科草本植物。新疆、內(nèi)蒙古、寧夏以及山西是中國主要的產(chǎn)地，同時(shí)華北和西北地區(qū)也有少量分布。甘草中含有黃酮類、三萜皂苷類、香豆素類、二苯乙烯類、多糖類、有機(jī)酸類和生物堿類等多種天然活性成分［1-4］。其中，黃酮類化合物的含量在甘草藥材中大約占3%，已有的研究報(bào)道顯示，甘草具有許多潛在的藥用價(jià)值［5-6］，有抑菌、抗癌、抗輻射、抗心律失常、抗病毒、利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等治療功效［7］，還有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)的保健功能，同時(shí)也有抑制黃褐斑、美白的美容功效。

發(fā)酵是一種用于中藥的加工方法。通過微生物的作用，在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度和水分條件下對(duì)藥材進(jìn)行發(fā)酵，以增強(qiáng)其原有特性或產(chǎn)生新的效果。益生菌發(fā)酵草藥具有使用純菌株、可控過程以及在發(fā)酵過程中通過其轉(zhuǎn)化作用增加生物活性成分的特點(diǎn)［8-10］。例如，Dey等［11］和Xu等［12］的研究表明真菌發(fā)酵可以提升谷物的抗氧化潛力，Araújo等［13］研究表明兩種真菌在未經(jīng)處理的水果皮上生長之后增加了它們的蛋白質(zhì)含量和抗氧化活性。Meng等［14］研究表明黑曲霉可以從植物生物質(zhì)中生產(chǎn)木糖醇。

黃酮類化合物可以從甘草中通過多種途徑提取，其中包括堿性水溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法、超聲輔助提取法。但基本原理是利用有效的方法破壞甘草細(xì)胞結(jié)構(gòu)，再根據(jù)甘草黃酮在極性和溶解方面的不同特性進(jìn)行有目標(biāo)的提取和分離。為了提高甘草黃酮的純度，在提取過程中需進(jìn)行純化處理［15-18］。大孔吸附樹脂法是最為常用的純化技術(shù)，因其獨(dú)有的理化性質(zhì)和很強(qiáng)的穩(wěn)定性，不僅不受無機(jī)鹽類、強(qiáng)離子及低分子化合物的干擾，而且其內(nèi)部的多孔性結(jié)構(gòu)對(duì)不同物質(zhì)可以進(jìn)行有效分離和富集，能夠精準(zhǔn)篩選出目標(biāo)黃酮類化合物［19］。

甘草作為藥食同源的常用藥材，本研究以甘草黃酮為研究對(duì)象，將甘草經(jīng)過不同菌種發(fā)酵后，通過乙醇回流法提取黃酮并純化，采用清除自由基能力的比較來探究發(fā)酵對(duì)其抗氧化活性的影響，本研究旨在充分發(fā)掘與利用甘草這一珍貴資源，為發(fā)酵甘草的抗氧化研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草飲片，山西瑞象生物藥業(yè)有限公司；黑曲霉，BNCC公司，編號(hào)BNCC186380；米曲霉，BNCC公司，編號(hào)BNCC338380；酵母菌，安琪公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，飛靜生物；亞硝酸鈉，永大試劑；硝酸鋁，恒興試劑；氫氧化鈉，恒興試劑；氯化鈉，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；酵母膏胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基（酵母浸膏，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；蛋白胨，索萊寶；無水葡萄糖，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，索萊寶；無水乙醇，致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） ，阿拉丁;2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），阿拉?。粺o水甲醇，致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；D101型大孔吸附樹脂，索萊寶；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高速多功能粉碎機(jī)，永康市紅太陽機(jī)電有限公司；可見分光光度計(jì)V-1100D型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；高速離心機(jī)HC-3018、HC-3018R，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；普通層析柱35 cm×40 cm，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；DBS-100電腦全自動(dòng)部份收集器，上海浦西分析儀器廠有限公司；潔凈工作臺(tái)JB-CJ-1000FX，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司。

1.2 方法

本研究于2024年4月1日在太原師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院格物樓613天然產(chǎn)物活性成分創(chuàng)新獸藥工程技術(shù)中心開始發(fā)酵工作，最終于2024年6月下旬完成本研究。

1.2.1 菌種活化與菌液稀釋

配制PDA和YPD固體培養(yǎng)基，將米曲霉、黑曲霉涂布于PDA培養(yǎng)基，酵母菌涂布于YPD培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)基劃開，放入離心管，加入少量生理鹽水，震蕩，洗脫米曲霉、黑曲霉孢子，得到高濃度混懸液，將混懸液通過無菌脫脂棉花過濾，除去混入懸液中的菌絲體，得到孢子懸液。用生理鹽水沖洗培養(yǎng)基上酵母菌菌落，得到酵母菌菌懸液，3種菌液分別稀釋后放置冰箱中待用。

1.2.2 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

將甘草飲片用粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩進(jìn)行發(fā)酵，30 g甘草中分別接種10%的不同菌種，控制發(fā)酵溫度28 ℃、含水量80%，分別考察發(fā)酵時(shí)間（1，3，5和7 d）、菌種（酵母菌、黑曲霉、米曲霉）對(duì)甘草總黃酮含量的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適發(fā)酵天數(shù)進(jìn)行后續(xù)大量發(fā)酵并純化。

1.2.3 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制0.5 mg·mL-1的蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，梯度稀釋為50，100，150，200，250，300，350和400 μg·mL-1的蘆丁溶液，分別精密量取6 mL各稀釋梯度蘆丁溶液于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置 6 min。再添加1 mL 10%的硝酸鋁溶液，反應(yīng) 6 min。添加 4%的氫氧化鈉溶液 10 mL，最后用70%的乙醇溶液定容靜置15 min。以無水乙醇為空白對(duì)照，利用紫外可見分光光度計(jì)在波長510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度 C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得吸光度 A 與蘆丁濃度 C（mg·mL-1）之間的線性回歸方程式為： Y=0.002 8X-0.002 4，相關(guān)系數(shù)為 0.999 9。

1.2.4 甘草總黃酮提取及含量測(cè)定

采取乙醇回流提取法進(jìn)行提取，保持80 ℃的提取溫度， 以3∶7的比例混合水和乙醇，按照1∶15的料液比，回流提取1 h。采用NANO2-AL（NO3）3比色法黃酮含量測(cè)定［20］。

1.2.5 大孔吸附樹脂純化甘草黃酮

大孔樹脂預(yù)處理：采用D101型樹脂［21］，先用4%鹽酸洗沒過樹脂，放置于搖床120 r·min-1處理2 h，取出用蒸餾水沖洗抽濾至中性。再用4%氫氧化鈉洗沒過樹脂，放置于搖床120 r·min-1處理2 h，取出用蒸餾水沖洗抽濾至中性。最后用無水乙醇洗沒過樹脂，放置于搖床120 r·min-1處理2 h，取出用蒸餾水沖洗抽濾至無醇味，備用。

泄露曲線檢測(cè)：稱取 140 g預(yù)處理后的D-101大孔樹脂濕法裝柱，計(jì)算柱體積（Bed Volumn，BV=70 mL）后，以甘草黃酮上樣濃度為 0.9 mg·mL-1，流速設(shè)定2 BV·h-1，每7 mL收集1管，測(cè)定黃酮含量，并繪制泄露曲線，以此來確定最佳上樣條件。

動(dòng)態(tài)洗脫試驗(yàn)：選取最佳上樣條件上樣，待吸附飽和后分別用蒸餾水和80%乙醇作為洗脫液沖洗樹脂至洗脫液無色，流速2 BV·h-1，每7 mL收集1管，測(cè)定黃酮含量，繪制洗脫曲線。

甘草黃酮粗提物純化：以最佳上樣條件，水洗體積，醇洗體積對(duì)未發(fā)酵、黑曲霉、米曲霉、酵母菌的甘草黃酮粗提物進(jìn)行純化，收集醇洗洗脫液，將洗脫液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸至無醇味，于低溫冷凍干燥機(jī)中干燥48 h，得甘草總黃酮純化物。用70%乙醇復(fù)溶，測(cè)定510 nm處吸光度計(jì)算其中黃酮含量。

1.2.6 DPPH測(cè)定

將0.007 9 g DPPH加入無水甲醇當(dāng)中，定容至100 mL，將定容好的DPPH溶液稀釋為60 μmol·L-1待用。取大孔吸附樹脂純化后的甘草黃酮提取物，配制5 mg·mL-1的黃酮樣品溶液，移取80 μL定容至0.3 mL，將0.3 mL的樣品溶液與2.7 mL稀釋好的DPPH溶液混勻并按照如下的分組A0：0.3 mL去離子水+2.7 mLDPPH溶液。As：0.3 mL樣品溶液+2.7 mLDPPH溶液。Ar：0.3 mL樣品溶液+2.7 mL無水甲醇溶液。配制好之后，黑暗常溫反應(yīng)30 min，以無水甲醇為空白參照，在518 nm處測(cè)吸光度。并計(jì)算DPPH清除率（Y），計(jì)算公式如下：

Y（%）=（As-ArA0）×100（1）

1.2.7 ABTS測(cè)定

將7 mmol·L-1 ABTS 和2.5 mmol·L-1 過硫酸鉀溶液，在室溫條件下等體積混合，并置于暗處反應(yīng)12～16 h，獲得ABTS+溶液。將獲得的ABTS+溶液以80%乙醇稀釋，使其734 nm下的吸光度為0.7。取大孔吸附樹脂純化后的甘草黃酮提取物，配制5 mg·mL-1的黃酮樣品溶液，移取10 μL定容至0.3 mL，按照如下方式加樣，A0：0.3 mL去離子水+2.7 mL ABTS+溶液；As：0.3 mL樣品溶液+2.7 mL ABTS+ 溶液；Ar：0.3 mL樣品溶液+2.7 mL 無水乙醇溶液。黑暗常溫反應(yīng)30 min，以無水乙醇為空白參照，在734nm處測(cè)吸光度。并參照公式（1），計(jì)算ABTS清除率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并借助Graphpad Prism 9和Origin 2021繪制結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種和發(fā)酵時(shí)間對(duì)甘草黃酮含量的影響

由圖1可知，未發(fā)酵組1～7 d黃酮濃度基本保持不變（Pgt;0.05）；酵母菌組甘草發(fā)酵3 d、5 d

的黃酮濃度顯著高于發(fā)酵1 d和7 d的（Plt;0.05），酵母菌組甘草發(fā)酵3 d和5 d之間黃酮含量差異不顯著（Pgt;0.05）；米曲霉組甘草發(fā)酵5 d后黃酮濃度顯著高于發(fā)酵1 d、3 d和7 d（Plt;0.05）；黑曲霉組甘草發(fā)酵3 d、5 d、7 d后的黃酮濃度顯著高于發(fā)酵1 d組（Plt;0.05），發(fā)酵3 d、5 d和7 d處理間黃酮濃度差異不顯著（Pgt;0.05）。

米曲霉組甘草發(fā)酵1 d的黃酮含量顯著高于未發(fā)酵組和黑曲霉組（Plt;0.05）；酵母菌、米曲霉、黑曲霉組甘草發(fā)酵3 d、5 d的黃酮含量顯著高于未發(fā)酵組（Plt;0.05）；黑曲霉組甘草發(fā)酵7 d 的黃酮含量顯著高于未發(fā)酵組和酵母菌、米曲霉處理（Plt;0.05）。綜上所述，不同菌種發(fā)酵甘草的最佳時(shí)間條件為酵母菌5 d，米曲霉5 d，黑曲霉3 d。

2.2 大孔吸附樹脂純化甘草黃酮效果

2.2.1 大孔吸附樹脂純化甘草黃酮的優(yōu)化條件

樣品洗脫泄露曲線結(jié)果如圖2A所示，當(dāng)上樣濃度為0.9 mg·mL-1且洗脫體積達(dá)到2.2 BV時(shí)，洗脫液中黃酮含量達(dá)到上樣濃度的20%即達(dá)到泄漏點(diǎn)，此時(shí)大孔樹脂吸附飽和之后樣品會(huì)發(fā)生泄露，所以最佳上樣體積為2.2 BV。

水洗除雜，是利用黃酮不親水而雜質(zhì)親水的特性，通過水洗去雜質(zhì)的過程，水洗除雜曲線如圖2B所示，黃酮吸附量隨著水洗液體積的增加呈現(xiàn)出先上升后下降并最終為0的趨勢(shì)，當(dāng)水洗體積在2.6 BV時(shí)，一小部分的黃酮以及大量的雜質(zhì)被有效地從洗脫劑中洗出，此時(shí)黃酮吸附量最低；隨著水洗體積的繼續(xù)增加，當(dāng)達(dá)到5.0 BV時(shí)，水洗液中黃酮含降為0，此時(shí)大孔吸附樹脂所吸附的黃酮含量趨于穩(wěn)定，故從泄漏點(diǎn)開始算起的2.2 BV體積到最終的5.0 BV之間一共有2.9 BV的體積，故選取2.9 BV為最佳水洗體積。

醇洗是指在水洗除雜之后，利用一定濃度的乙醇溶液把大孔吸附樹脂之內(nèi)的黃酮洗脫出來的過程。醇洗曲線如圖2C所示，隨著醇體積的增加樣品中的黃酮逐漸被洗出，呈現(xiàn)先上升后下降并趨于穩(wěn)定，其中當(dāng)?shù)竭_(dá)3.0 BV時(shí)洗脫液中黃酮含量最大，黃酮大量被洗出。當(dāng)達(dá)到6.5 BV時(shí)黃酮含量趨于穩(wěn)定，之后無變化，說明3.0 BV為最佳醇洗體積。

2.2.2 發(fā)酵甘草黃酮純化前后含量的比較

由表1可知，純化后樣品中黃酮含量較純化前含量上升，未發(fā)酵處理由39.6 mg·g-1上升為57.9 mg·g-1。酵母菌由54.9 mg·g-1上升為82.6 mg·g-1，米曲霉由78.2 mg·g-1上升為101.8 mg·g-1，黑曲霉由63.8 mg·g-1上升為90.6 mg·g-1。

2.3 發(fā)酵甘草黃酮的抗氧化性比較

甘草發(fā)酵前后在相同濃度下對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力結(jié)果如圖3所示，米曲霉、黑曲霉、酵母菌發(fā)酵甘草組對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率顯著高于未發(fā)酵組（Plt;0.05），且米曲霉組顯著高于黑曲霉、酵母菌組（Plt;0.05）。圖3A顯示，黑曲霉和酵母菌發(fā)酵甘草對(duì)DPPH的清除力無顯著性差異（Pgt;0.05），圖3B顯示，酵母菌發(fā)酵甘草組清除ABTS的能力顯著高于黑曲霉組（Plt;0.05）。因此，甘草發(fā)酵后清除DPPH和ABTS自由基的能力提高，抗氧化活性增強(qiáng)，且以米曲霉處理為最佳。

3 討論

微生物發(fā)酵技術(shù)可以利用合適的溫度、pH和接種量等條件，將中草藥作為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，微生物會(huì)釋放很多種不同效果的酶，催化藥材產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)生成多種初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物［22］。并且由于微生物的作用，部分藥材會(huì)經(jīng)歷酯化等多種生物化學(xué)反應(yīng)過程，進(jìn)而生成全新的活性物質(zhì)［23-24］。這些新的物質(zhì)不僅豐富了中藥材的化學(xué)成分，也極大地?cái)U(kuò)展了其藥用范圍，使其得以應(yīng)用于更多疾病的治療［25］。本研究采用米曲霉、黑曲霉、酵母菌發(fā)酵甘草，甘草中黃酮的含量顯著增加，且影響黃酮含量的最佳發(fā)酵時(shí)間條件為酵母菌5 d，米曲霉5 d，黑曲霉3 d。

甘草黃酮因含有酚羥基的結(jié)構(gòu)，能夠與一些自由基發(fā)生反應(yīng)，所以具有抗氧化特性。近年來，甘草黃酮因在化妝品行業(yè)和保健品行業(yè)的廣泛應(yīng)用，受到眾多消費(fèi)者的喜愛。自由基因其高度的不穩(wěn)定性和極高的化學(xué)活性，易與活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，這種反應(yīng)過程會(huì)對(duì)機(jī)體造成一系列的損害，影響細(xì)胞的正常功能和機(jī)體的健康。最近一項(xiàng)研究顯示發(fā)酵技術(shù)可以幫助人體預(yù)防自由基相關(guān)的疾病，例如Jakubczyk等［26］的研究指出無鹽發(fā)酵甜菜根汁具有預(yù)防自由基疾病相關(guān)的潛在有益健康特性。而直接影響發(fā)酵結(jié)果的發(fā)酵參數(shù)也需要不斷地優(yōu)化才可以獲得更好的發(fā)酵效果，發(fā)酵的時(shí)間、溫度、菌種的選擇都是很重要的指標(biāo)，例如Vaitkeviciene等［27］研究指出優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)可以提高柳葉中糖和光合色素的含量。

越來越多的真菌菌株已用于工業(yè)生產(chǎn)，擴(kuò)大了發(fā)酵產(chǎn)品特性的多樣性［28］。Zhang等［29］研究認(rèn)為發(fā)酵中草藥是一種良好的豬生長飼料添加劑，對(duì)豬的免疫力有正面作用。Shakya等［30］研究得出益生菌發(fā)酵顯著提高了薄荷提取物的生物活性。本研究通過不同菌種發(fā)酵甘草經(jīng)純化后，采用DPPH和ABTS檢測(cè)甘草黃酮對(duì)自由基的清除能力，研究結(jié)果與前人一致，甘草黃酮含量在增加的同時(shí)，抗氧化活性也顯著增加，不同菌種發(fā)酵甘草的組別都顯著高于未發(fā)酵組（Plt;0.05），且米曲霉組顯著高于黑曲霉、酵母菌組（Plt;0.05）。

4 結(jié)論

本研究采用乙醇回流提取法提取甘草中的黃酮，利用時(shí)間單因素優(yōu)化不同菌種發(fā)酵甘草的條件，將甘草黃酮粗提物用D101型大孔吸附樹脂純化，純化后樣品中黃酮含量較未發(fā)酵組都顯著提高，抗氧化試驗(yàn)結(jié)果也表明，發(fā)酵后甘草中黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基具有良好的清除能力。本試驗(yàn)證實(shí)了甘草經(jīng)過發(fā)酵有效提高了黃酮含量，并且可以增強(qiáng)黃酮對(duì)自由基的清除能力，黃酮抗氧化能力的提高將對(duì)醫(yī)藥、保健品，以及化妝品產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)品開發(fā)和利用提供有價(jià)值的參考，對(duì)于高效、合理地利用甘草資源具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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Effects of Solid-State Fermentation Time of Different Bacterial Strains on Content and Antioxidant Properties of Licorice Flavonoids

LI Da， ZHU Ting， LIU Di，WU Xiaoying

（College of Biological Science and Technology， Taiyuan Normal University， Jinzhong 030619， China）

Abstract：In order to fully explore and utilize licorice resources and promote the antioxidant research of fermented licorice， three different probiotics （yeast， Aspergillus oryzae， and Aspergillus niger） were selected as the research objects to ferment flavonoids in licorice. Ethanol reflux method was used to extract flavonoids from licorice， and single factor experiments were conducted to optimize the fermentation time under the fixed conditions of inoculation volume of 10%， fermentation temperature of 28 ℃， water content of 80%， and 30 g of licorice. Based on the optimal fermentation time， the crude extract of licorice flavonoids was purified using D101 macroporous adsorption resin and its relatedin vitro antioxidant capacity was determined.The effect of solid-state fermentation time of different bacterial strains on the content and antioxidant properties of licorice flavonoids was explored. The results showed that the content of flavonoids was highest in yeast fermentation for 5 days， Aspergillus oryzae fermentation for 5 days， and Aspergillus niger fermentation for 3 days. Therefore， based on this， purification was carried out using macroporous resin， and the flavonoid content increased after purification. Aspergillus niger increased from 63.8 mg·g-1 to 90.6 mg·g-1， Aspergillus oryzae increased from 78.2 mg·g-1 to 101.8 mg·g-1， yeast increased from 54.9 mg·g-1 to 82.6 mg·g-1， and unfermented increased from 39.6 mg·g-1 to 57.9 mg·g-1; The scavenging ability of different strains of fermented licorice on DPPH and ABTS free radicals was significantly higher than that of unfermented licorice. In summary， there is a significant difference in the flavonoid content of licorice before and after fermentation. After purification with macroporous adsorption resin， the flavonoid content of licorice increases significantly， and licorice has better antioxidant activity after fermentation.

Keywords：Licorice flavonoids; solid state fermentation; macroporous resin; antioxidant activity; DPPH; ABTS