不同生育期大豆根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征

摘要：為了探究大豆的不同生育時期根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，在大豆出苗期（VE）、始花期（R1）、盛莢期（R4）、鼓粒期（R6）和完熟期（R8）采集根際土壤樣品，并使用Illumina高通量測序技術(shù)進行分析，研究大豆根際真菌和細菌群落的組成及其多樣性特征。結(jié)果表明，大豆根際土壤中真菌和細菌群落多樣性和豐富度的變化趨勢相同，在出苗期時多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)較高，隨后在始花期下降，在盛莢期上升，在鼓粒期再次下降，完熟期又上升。

不同生長時期真菌優(yōu)勢菌門均為子囊菌門和鞭毛菌門，而真菌優(yōu)勢菌屬不同，出苗期和始花期的優(yōu)勢菌屬為穗霉屬，盛莢期、鼓粒期和完熟期的優(yōu)勢菌屬為籃狀菌屬；各生長時期的優(yōu)勢細菌門均為放線菌門、變形菌門和酸桿菌門，出苗期、始花期、盛莢期和鼓粒期的優(yōu)勢菌屬為節(jié)桿菌屬，完熟期的優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬。大豆根際微生物種群隨著生育期發(fā)生變化，出苗期時根際真菌和細菌的多樣性和豐富度最高，根際土壤中細菌種群豐富度比真菌更高。

關(guān)鍵詞：大豆；生育期；根際土壤微生物；真菌；細菌；豐富度指數(shù)；多樣性指數(shù)

收稿日期：2024-11-09

基金項目：黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新跨越工程農(nóng)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)科技創(chuàng)新重點攻關(guān)項目（CX23GG13）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新跨越工程農(nóng)業(yè)科技基礎(chǔ)創(chuàng)新優(yōu)青項目（CX23YQ18）；黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新推廣體系-生態(tài)農(nóng)業(yè)（2023-1197）。

第一作者：杜虹銳（1996-），女，碩士，研究實習(xí)員，從事植物病害生物防治研究。E-mail： dhr2208@126.com。

通信作者：劉春來（1975-），男，碩士，研究員，從事有害生物綠色防控研究。E-mail： liuchunlai@163.com。

大豆是重要的油料和經(jīng)濟作物，然而常年連作會導(dǎo)致大豆產(chǎn)量下降、病害加重等情況發(fā)生［1］。目前我國仍需要依靠進口大豆維持需求，提高國內(nèi)大豆產(chǎn)能迫在眉睫。已有研究表明，植物連作累積的根系分泌物會對作物產(chǎn)生自毒作用，還會對土壤微生物種群組成和多樣性產(chǎn)生嚴(yán)重影響［2-3］。土壤微生物對于植物具有重要作用，其在養(yǎng)分循環(huán)、能量流動及維持土壤生態(tài)系統(tǒng)過程中十分重要［4-5］，土壤中的固氮菌可以將空氣中的氮轉(zhuǎn)化為植物可利用的形式，促進大豆生長［6］。豐富的微生物多樣性可以改善土壤結(jié)構(gòu)，通過分泌多糖和其他有機物，改善土壤團粒結(jié)構(gòu)，增加土壤的透氣性和保水性，從而促進植物生長［7］。

根際是植物與土壤接觸的主要環(huán)境，根際土壤的質(zhì)量與作物的生長息息相關(guān)［8］。植物根系與土壤中的微生物存在相互作用，植物根系通過產(chǎn)生分泌物和次生代謝物吸引土壤中的有益菌為植物提供微量元素和養(yǎng)分［9］，同時，土壤中的細菌和真菌也會影響植物的健康情況［10］。已有研究發(fā)現(xiàn)植物的品種、不同的生長發(fā)育階段都會對土壤微生物造成影響［11-13］。因此，探究作物在不同的生長時期根際土壤環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，對提高作物產(chǎn)量、防控病害發(fā)生有重要作用。

本研究以大豆為研究對象，通過Illumina高通量測序技術(shù)對5個大豆生育時期的根際土壤進行測序，研究細菌和真菌群落的組成及豐度變化，以期為生產(chǎn)實踐中改善大豆連作障礙提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)置

采集黑龍江省哈爾濱市道外區(qū)民主鄉(xiāng)國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范展示基地大豆連作田土壤作為試驗用土，于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院盆栽場，采用盆栽種植方式進行試驗。2023年8月20日播種，大豆種子為黑農(nóng)84（由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所提供），種子消毒后播種于培養(yǎng)盆（高14 cm，口徑21 cm）中，每盆播種10粒種子，出苗后進行間苗，每盆留苗6株，共播種18盆，每個采樣時期隨機采集3盆大豆根際土壤樣品，作為3次重復(fù)，盆栽置于露天環(huán)境，不使用農(nóng)藥化肥。

1.2 樣品采集

分別在大豆出苗期（VE，9月6日）、始花期（R1，9月26日）、盛莢期（R4，10月16日）、鼓粒期（R6，11月17日）和完熟期（R8，12月21日），在不同生長期隨機采集3個培養(yǎng)盆的大豆植株的根際土壤，作為3次重復(fù)，使用刷子輕刷大豆根部，收集根際土壤于自封袋中，CK為播種前在培養(yǎng)盆中多點采集的土壤樣本，各土壤樣品保存于超低溫冰箱。

1.3 DNA提取及高通量測序

使用土壤DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，測定DNA質(zhì)量、濃度和純度。使用引物對338F/806R擴增細菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)［14］；引物對ITS1F/ITS2擴增真菌ITS基因ITS1-2區(qū)［15］。對PCR產(chǎn)物進行純化回收，利用Illumina公司的MiseqPE250平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用fastp v.0.20.0軟件［16］對原始下機序列質(zhì)控，F(xiàn)LASH v.1.2.7軟件［17］拼接序列，UPARSE v.0.20.0軟件［18］在97%相似度水平上對OUT進行聚類，去除嵌合體，按照最小樣本數(shù)進行序列抽平。所有試驗數(shù)據(jù)分析在美吉生物云平臺（https：//cloud.majorbio.com）進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

對6個土壤樣本進行測序，獲得真菌ITS基

因序列平均長度為244 bp，原始下機reads數(shù)1 571 000條，對序列進行優(yōu)化后獲得1 507 143條

有效序列，對OUT聚類后獲得總數(shù)為1 344個。由圖1A可知，6個樣本共有OUT數(shù)為129個，CK、VE、R1、R4、R6、R8特有OUT數(shù)量分別為328，90，54，82，55和63。說明CK特有的OUT數(shù)最多，其次為VE和R4時期。

獲得細菌16S rRNA基因序列片段平均長度為416 bp，原始下機reads數(shù)條，優(yōu)化后獲得序列1 510 452條，對OUT聚類后獲得10 250個OUT。圖1B顯示，6個樣本共有OUT數(shù)為2 085個，CK、VE、R1、R4、R6、R8特有OUT數(shù)量分別為1 509，736，446，578，610和684。說明CK特有的OUT數(shù)最多，其次為VE和R8時期。

2.2 根際真菌群落多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

通過對序列隨機抽樣，構(gòu)建稀釋曲線，由圖2可知，隨著測序深度的增加，在數(shù)據(jù)量達到25 000時曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理。由表1可知，6個樣本的測序深度指數(shù)都在99.80%以上，CK樣本具有較高的Shannon指數(shù)和較低的Simpson指數(shù)，說明具有較高的真菌多樣性，其次為VE時期，隨后土壤真菌多樣性在R1時期下降，在R4時期上升，然后再次下降。CK樣本的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)最高，說明其真菌群落豐富度較高，其次為VE時期，變化趨勢與真菌多樣性一致。

2.2.2 Beta多樣性分析

為探究6個土壤樣本的真菌群落組成的差異，PCoA分析（Anoism，R=0.900 4，P=0.001 0）結(jié)果顯示，CK與大豆其他5個生育期的真菌群落之間存在明顯的分離，在同一象限的樣本真菌群落結(jié)構(gòu)差異相對較小，VE和R1時期在同一象限，R4、R6和R8時期在同一象限，VE和R1時期的真菌群落組成與R4、R6和R8時期存在差異（圖3）。

2.2.3 物種組成分析

將獲得的OUT與Unite真菌數(shù)據(jù)庫（v8.0）比對進行物種注釋，共注釋到14個門、40個綱、84個目、167個科及325個屬。由圖4可知，大豆根際土壤門水平的真菌群落組成豐度前十的真菌門分別是子囊菌門（Ascomycota）、鞭毛菌門（Mortierellomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、unclassified_k_Fungi、球囊菌門（Glomeromycota）、毛霉門（Mucoromycota）、

油壺菌門（Olpidiomycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota），

其中子囊菌門是6個樣本的優(yōu)勢菌門，在CK、VE、R1、R4、R6和R8中分別占比83.66%、84.48%、94.33%、87.06%、91.10%和91.26%。

由圖5可知，在屬水平上的真菌群落組成豐度前十的真菌屬分別為籃狀菌屬（Talaromyces）、曲霉屬（Aspergillus）、穗霉菌（Stachybotrys）、被孢霉屬（Mortierella）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）、鐮刀菌屬（Fusarium）、毛殼屬（Chaetomium）、unclassified_f_Didymellaceae、交鏈孢菌屬（Alternaria）和新赤殼屬（Neocosmospora），其中CK樣本的優(yōu)勢菌屬是曲霉屬，占比15.71%，VE和R1時期的優(yōu)勢菌屬為穗霉菌，占比分別為38.89%和38.50%，R4、R6和R8時期的優(yōu)勢菌屬是籃狀菌屬，占比分別為37.95%、39.70%和29.91%。

2.3 根際細菌群落多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析

由圖6可知，細菌的高通量測序在數(shù)據(jù)量達到50 000時曲線趨于平緩。由表2可知，6個樣本的測序深度指數(shù)都在98.50%以上。CK樣本具有較高的Shannon指數(shù)，說明細菌多樣性較高，在大豆的5個生育期中，VE時期的細菌多樣性指數(shù)較高，隨后在R1時期下降，在R4時期升高，然后在R6時期再次下降，R8時期回升。R1時期的Shannon指數(shù)較低、Simpson指數(shù)較高，說明在始花期大豆根際土壤細菌豐富度較低。CK樣本的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)最高，說明其真菌群落豐富度較高，豐富度變化趨勢與多樣性一致。

2.3.2 Beta多樣性分析

為探究6個土壤樣本細菌群落組成的差異，PCoA分析（Anoism，R=0.957 2，P=0.001 0）結(jié)果顯示（圖7），CK與大豆其他5個生育期的細菌群落之間存在明顯的分離，VE和R1時期距離較近，菌落組成比較相似，R4、R6和R8時期在同一象限，菌落組成相似，各樣本不同重復(fù)之間聚集在一起。

2.3.3 物種組成分析

與Silva 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫（v138）進行比對注釋，注釋到36個門、116個

綱、287個目、469個科和946個屬。由圖8A可知，大豆根際土壤在門水平上的細菌群落組成豐度前十的細菌門分別為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidota）、芽單胞桿菌門（Gemmatimonadota）、厚壁菌門（Firmicutes）、髕骨細菌門（Patescibacteria）、黏菌門（Myxococcota）和硝化螺菌門（Nitrospirota），結(jié)果表明不同樣本在門水平優(yōu)勢物種相同，但相對豐度不同。

由圖8B可知，在屬水平上的細菌群落組成，豐度前十的細菌屬分別為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、norank_f_norank_o_Gaiellales、norank_f_norank_o_norank_c_MB-A2-108、馬賽菌屬（Massilia）、溶桿菌屬（Lysobacter）、諾卡菌屬（Nocardia）、沙壤土桿菌屬（Ramlibacter）和norank_f_Gemmatimonadaceae，VE、R1、R4和R6時期的優(yōu)勢菌屬為節(jié)桿菌屬，占比分別為8.67%、19.36%、4.93%和6.68%。

3 討論

植物的生長與根際微生物種群的多樣性及豐富度密切相關(guān)。已有研究證實，處于不同生長階段的植物根際微生物的群落組成會有顯著差異，李巧玲等［19］以三年生梔子為研究對象，發(fā)現(xiàn)在盛花期后細菌種群多樣性升高，此時植物生長代謝旺盛，產(chǎn)生較多分泌物，有利于某些細菌的生長。植物生長不同階段的需求不同，土壤中的細菌和真菌群落組成及豐度也會隨之發(fā)生變化［20］，在本研究中，發(fā)現(xiàn)真菌種群多樣性在出苗期較高，隨后在始花期下降，在盛莢期又重新上升，在鼓粒期下降，優(yōu)勢菌門組成相似，但相對豐度不同，子囊菌門為各個樣本的優(yōu)勢真菌門。子囊菌門在土壤中可以促進土壤氮的積累，在土壤的營養(yǎng)含量缺失時會通過降低子囊菌門的豐度進行調(diào)節(jié)［21-22］，在本研究中始花期的子囊菌門豐度最高，隨后在盛莢期豐度下降，可能由于此時植物生長吸收大量的土壤營養(yǎng)，土壤菌群相對做出的調(diào)節(jié)反應(yīng)?；@狀菌屬是分解植物殘體的重要菌群［23-24］，可以促進植物抗逆、抗病和礦物質(zhì)吸收等［25-26］。R4、R6和R8時期的優(yōu)勢真菌屬為籃狀菌屬，此時在大豆生長后期，培養(yǎng)盆內(nèi)落葉積累，藍狀菌屬的增多有助植物殘體的分解。Niu等［27］發(fā)現(xiàn)，放線菌門和變形菌門可以促進玉米生長初期的根系發(fā)育，而且擬桿菌門通過調(diào)節(jié)過氧化氫酶活性，參與植物生長發(fā)育［28］。在本研究中，放線菌門和擬桿菌門是細菌種群的優(yōu)勢細菌門，在始花期時這兩個細菌門的豐度最高，研究結(jié)果與劉欣等［12］研究結(jié)果一致，優(yōu)勢菌門都包括放線菌，但由于栽培環(huán)境及土壤類型不同，微生物種群組成也稍有差異。節(jié)桿菌屬的細菌具有固氮和促進植物生長的能力［29-30］，在本研究中出苗期、始花期、盛莢期和完熟期的優(yōu)勢細菌屬為節(jié)桿菌屬，在始花期時的豐度最高，此時植物生長旺盛，有大量的營養(yǎng)需求，對根際土壤菌群的招募也多為促生菌。

4 結(jié)論

本研究通過對大豆不同生長時期根際土壤樣本進行高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本中真菌種群OUT數(shù)量顯著少于細菌種群，真菌和細菌群落多樣性指數(shù)都是在出苗期較高，隨后在始花期下降，在盛莢期上升，在鼓粒期又重新下降的變化趨勢，真菌和細菌種群的優(yōu)勢菌屬結(jié)構(gòu)相似，只是豐富度在不同時期有所變化，本研究結(jié)果為大豆不同生長時期根際土壤群落演替提供理論依據(jù)。

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Structural Characteristics of Rhizosphere Soil Microbial Communities in Soybean at Different Growth Stages

DU Hongrui1， YANG Fan1， WANG Shuang1， JIANG Xifeng1， LI Mukai2， LIU Chunlai1

（1.Institute of Plant Protection， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Harbin， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China; 2.College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

Abstract：In order to explore the changes of rhizosphere soil microbial population structure in different growth stages of soybean. Rhizosphere soil samples were collected from soybean at period of emergence （VE）， early blooming （R1）， pod period （R4）， pod filling period （R6） and full-ripe period （R8）. Illumina high-throughput sequencing was used to study the diversity characteristics and composition of rhizosphere fungal and bacterial communities. The results indicated that the trends in diversity and richness of fungal and bacterial communities were similar. The diversity index and richness index were higher during the VE， then decreased during the R1， increased during the R4， decreased again during the R6， and increased during the R8. The dominant fungal phyla in each sample were Ascomycota and Mortierellomycota. The dominant fungal genera were different at different growth stages. The dominant fungal genera during the VE and R1 were Stachybotrys， while the dominant fungal genera during the R4， R6， and R8 were Talaromyces. The dominant bacterial phyla in each sample were Actinobacteria， Proteobacteria， and Acidobacteriota. The dominant bacterial genera during the VE， R1， R4 and R6 are Arthrobacter， while the dominant bacterial genera during the R8 was Streptomyces. The changes in soybean rhizosphere microbial population varied with the growth period. The diversity and richness of rhizosphere fungi and bacteria were highest at the emergence period， and the richness of bacterial population in rhizosphere soil was higher than that of fungi.

Keywords：soybean; growing period; rhizosphere soil microorganisms; fungus; bacteria; richness index; cliversity index