藏桃AmArg1基因克隆與互作蛋白篩選及抗逆性分析

摘要：為探究藏桃精氨酸酶1的耐逆性生物學功能，克隆了精氨酸酶1基因（AmArg1）全長ORF，用生物信息學技術(shù)分析其蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，結(jié)果表明，該蛋白是酸性的無信號肽結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。將AmArg1轉(zhuǎn)入酵母細胞，其對酵母細胞無毒性、無自激活活性。通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出AmArg1的互作蛋白AmLhcb1、AmRabB1b 并在洋蔥活體細胞內(nèi)驗證互作，并初步探究AmArg1在NaCl、甘露醇和CuSO4脅迫下的抗逆性反應，發(fā)現(xiàn)過表達轉(zhuǎn)AmArg1酵母菌具有較強的脅迫耐受性。

關鍵詞：藏桃；互作蛋白；非生物脅迫；AmArg1基因

收稿日期：2024-07-23

基金項目：國家自然科學基金（31500317）。

第一作者：白潔霞（1999-），女，碩士研究生，從事植物逆境生理生態(tài)學研究。E-mail：b17735744603@163.com。

通信作者：羅秋香（1976-），女，博士，副教授，從事植物逆境生理生態(tài)學研究。E-mail：luoqiuxiang@sina.com。

精氨酸酶（Arginase， E.C.3.5.3.1）又叫做 L-精氨酸尿素水解酶（L-arginine amidinase）或 L-精氨酸脒基水解酶（L-arginine amidinohydrolase），精氨酸酶作為生物體內(nèi)的一種水解酶，能夠特異性地催化L-精氨酸的水解，從而生成L-鳥氨酸和尿素，在尿素的循環(huán)過程中起到了非常關鍵的作用［1］。該酶參與精氨酸代謝的多個途徑，直接或間接影響生成尿素、NO、多胺等物質(zhì)的過程，這些物質(zhì)扮演著重要的信號傳遞角色，參與植物的多種生理和生化活動，能夠影響作物生長和抵御脅迫環(huán)境的能力［2］。

精氨酸酶在多種植物中的存在和具體活性已經(jīng)得到廣泛證實，這為進一步理解其在植物生理過程和抗逆性形成中的功能提供了基礎。目前在水稻［3］、擬南芥［4］、玉米［5］、 番茄［6］和人參［7］等多個植物中均檢測到精氨酸酶的活性并成功克隆了精氨酸酶基因。相關研究表明，在鹽漬和干旱脅迫條件下，水稻OsARG1受兩種脅迫誘導而表達量明顯上升［8］。張曉旭［9］用100 mmol·L-1 NaCl 處理擬南芥幼苗，Northern 雜交表明AtARGAH1在根和葉片中的表達量均隨處理時間的延長而增加，且分別在處理24和12 h達到峰值。此外，研究還發(fā)現(xiàn)棉花GhARG1可以通過ABA和SA信號途徑參與對NaCl和干旱的脅迫響應，信號分子ABA和SA能夠誘導棉花GhARG1的表達［10］。在小麥中，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下TaARG-2BS的表達被誘導；干旱脅迫下TaARG-2BS和TaARG-2DS的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)；低溫處理下，兩個基因均未受到誘導［11］。此外，在番茄果實中，LeARG1和LeARG2均受低溫脅迫誘導［12-13］，施加外源精氨酸會提高精氨酸酶活性，從而提高番茄果實對低溫的耐受能力 ［14］。在鹽脅迫和高溫處理后，香菜中的精氨酸酶CsARG活性顯著增強［15］。上述研究結(jié)果顯示了精氨酸酶對植物在響應非生物脅迫時產(chǎn)生的重要影響。

精氨酸酶除了能夠抵御非生物脅迫外，在植物遭受多種生物脅迫時也發(fā)揮著重要的功能。研究表明，甘蔗和番茄在受到黑穗病菌和丁香假單胞菌感染后，精氨酸酶活性會提高［16］。過表達AtARGAH2可明顯提高擬南芥對灰葡萄孢菌的抗性，而AtARGAH2基因沉默株系和野生型則對灰葡萄孢菌敏感［17］。感染白粉病會誘導小麥精氨酸酶基因TaARG-2BS和TaARG-2DS的表達［11］。此外，酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)水稻和小麥精氨酸酶都能和水稻OsXA21蛋白產(chǎn)生互作［18］，表明精氨酸酶可能參與了基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用體的生物脅迫。

藏桃（Amygdalus mira Koehne）是薔薇科桃屬的一種落葉喬木，又名光核桃，具有適應性強、耐寒、耐旱、耐瘠、抗病、長壽、結(jié)果力強等優(yōu)良特性，具有很高的生態(tài)、經(jīng)濟、藥用等價值。

藏桃作為西藏地區(qū)分布最廣泛的野生果樹種質(zhì)資源之一，同時是中國特有的桃種質(zhì)資源，是國內(nèi)外罕見的桃種質(zhì)資源“活化石群”，具有眾多優(yōu)良特質(zhì)，如較強的耐寒性、耐旱性、抗病能力等和生態(tài)、經(jīng)濟、藥用等多重價值［19-21］。為探尋藏桃精氨酸酶1的耐逆性生物學的多樣性功能，本研究克隆了AmArg1基因，篩選AmArg1的互作蛋白并驗證互作，并將藏桃AmArg1轉(zhuǎn)入酵母菌株，進行非生物脅迫，驗證AmArg1抗逆性，為今后探討藏桃抗逆性分子機制奠定初步基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

該研究于2024年1月-6月在黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學生命科學學院的東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室進行。

藏桃：西藏桃種質(zhì)資源，種子保存于本實驗室；cDNA文庫：在進行了16 d的干旱處理后，從藏桃葉片中提取RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；大腸桿菌感受態(tài)DH5α、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit均購自Omega BIO-TEX公司；限制性內(nèi)切酶、雙色預染蛋白分子量Marker購自ThermoFisher Scientifc公司；T4 DNA Ligase購自TaKaRa生物科技公司；INVSc1酵母菌株、pYES2酵母抗性載體均購入于唯地生物公司；酵母菌感受態(tài)Y2HGold、農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101、pGBKT7、pGADT7酵母雙雜交載體、pSPYNE-35S、pSPYCE-35S雙分子熒光互補載體均保存于本實驗室。

1.2 AmArg1基因的克隆

以碧桃的保守序列在NCBI進行搜索，搜索到碧桃的Arg1基因，鑒于碧桃與藏桃為近緣種，因此以PpArg1基因序列為模板，并使用Primer 5.0［22］設計特異性引物。以cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增后的陽性克隆菌落搖菌后測序。

1.3 生物信息學分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫找到Arg1在不同物種中的同源序列，利用DNAMAN（Lynnon Biosoft）［23］對其在不同物種中的氨基酸序列進行比對；利用MEGA［24］軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用ProtParam tool［25］分析AmArg1的理化參數(shù)；利用SignalP 5.0 Server［26］對AmArg1蛋白信號肽進行預測；利用PROSITE網(wǎng)站［27］對AmArg1蛋白功能域進行分析。

1.4 pGBKT7-AmArg1重組載體構(gòu)建

利用克隆獲得的AmArg1全長ORF，設計帶有酶切位點的特異性上下游引物進行PCR擴增，擴增得到的片段連接到pLB-Simple Vector中間載體上，將AmArg1從中間載體切下后與pGBKT7質(zhì)粒16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，挑取陽性單克隆搖菌，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。

1.5 酵母自激活和毒性驗證

將pGBKT7空載和pGBKT7-AmArg1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)Y2HGold中。將轉(zhuǎn)化后的空載pGBKT7稀釋后涂布在SD-Trp固體培養(yǎng)基上；轉(zhuǎn)化后的pGBKT7-AmArg1菌液稀釋后涂布在SD-Trp和SD-Trp+X-α-gal固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)。

1.6 酵母雙雜交篩選互作蛋白

將誘餌蛋白與藏桃cDNA文庫融合得到的菌液涂布培養(yǎng)在SD-Trp-Leu-His平板，生長趨勢較好的雜交單克隆菌落劃線培養(yǎng)在SD-Trp-Leu-His+X-α-gal培養(yǎng)基上，將生長情況正常并且變藍的單克隆酵母菌用pGADT7載體的通用引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物測序，得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.7 互作蛋白共轉(zhuǎn)化

篩選到的互作蛋白與pGBAD7載體連接。將這些重組質(zhì)粒與pGBKT7-AmArg1進行共轉(zhuǎn)化，涂布于SD-Trp-Leu培養(yǎng)基，挑取單克隆進行菌落PCR鑒定。調(diào)整菌液濃度并培養(yǎng)于SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal的培養(yǎng)基上。

1.8 BiFC驗證

參照農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將pSPYNE-AmArg1、pSPYCE-AmLhcb1、pSPYCE-AmRabB1b重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化有pSPYNE-AmArg1與pSPYCE-AmLhcb1、pSPYCE-AmRabB1b質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液分別1∶1混合共侵染洋蔥表皮細胞，暗培養(yǎng)24 h后再光照培養(yǎng)24 h，制成洋蔥表皮切片后，用熒光顯微鏡檢測GFP熒光信號。

1.9 固體培養(yǎng)基脅迫處理

將濃度一致的過表達酵母菌pYES2-AmArg1和空載酵母pYES2菌液進行1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4濃度梯度稀釋，點于含有NaCl（0，50和100 mmol·L-1）、甘露醇（0，100和200" mmol·L-1）和CuSO4（0，15和30 μmol·L-1）不同脅迫的YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。

1.10 液體培養(yǎng)基脅迫處理

將空載酵母和轉(zhuǎn)基因酵母菌的菌液OD值均調(diào)整至0.2。取調(diào)整后濃度一致的菌液1 mL，7 000 r·min-1， 30 s棄上清，重懸于1 mL不同脅迫的YPD液體培養(yǎng)基中。28 ℃震蕩脅迫培養(yǎng)3，6和9 h，分別測量各組菌液的OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmArg1基因擴增結(jié)果與分析

以藏桃葉片cDNA為模板擴增AmArg1基因，由圖1可見，在1 000～2 000 bp之間存在一條明亮的條帶，大小約為1 040 bp左右，與碧桃（Prunus persica）的PpArg1基因大小一致（1 041 bp），說明PCR擴增獲得AmArg1基因。

2.2 生物信息學分析

將克隆獲得的AmArg1全長ORF測序后翻譯成氨基酸序列，利用DNAMAN軟件將藏桃的AmArg1氨基酸序列，分別與碧桃、扁桃（Prunus dulcis）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、棉花（Gossypium hirsutum）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）和番茄（Lycopersicon esculentum）中Arg蛋白的氨基酸序列進行同源性比對（圖2）。結(jié)果表明，藏桃AmArg1與碧桃和扁桃的Arg蛋白的氨基酸序列具有較高同源相似性。

利用MEGA軟件中PHYLOGENY的Construct/Test Neighbor-Joining Tree的分析功能進行多序列比對，構(gòu)建AmArg1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖3所示，藏桃AmArg1與碧桃、扁桃和梅等植物的Arg1蛋白的親緣關系較近。

使用ProtParam tool分析AmArg1的理化參數(shù)，AmArg1的分子式C1692H2704N470O525S12，分子量為37 799.14，理論等電點為5.62，氨基酸總 數(shù)為347，屬于酸性蛋白（圖4A）。以Hphob. /Kyte amp; Doolittle為標度對AmArg1的一級結(jié)構(gòu)進行ProtScale分析（圖4B），利用ProtParam分析可知，氨基酸序列平均疏水指數(shù)為-0.071，即該蛋白為親水性蛋白。采用在線軟件SignalP 5.0 Server對 AmArg1蛋白信號肽進行預測（圖4Ｃ），氨基酸序列中無明顯的信號肽序列，表明該蛋白是無信號肽結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。將AmArg1通過PROSITE網(wǎng)站分析其功能域（圖4Ｄ），結(jié)果顯示AmArg1的61～347位氨基酸處具有ARGINASE-2結(jié)合域。

2.3 pGBKT7-AmArg1重組載體構(gòu)建

構(gòu)建重組載體pGBKT7-AmArg1，在AmArg1片段已知序列的上下游，通過PCR擴增的方法加入酶切位點BamHI、SalI。經(jīng)雙酶切驗證，目的基因AmArg1和載體的位置均正確，由圖5可知，pGBKT7-AmArg1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 藏桃AmArg1蛋白的毒性和自激活檢測

如圖6所示，將pGBKT7空載體和構(gòu)建好的pGBKT7-AmArg1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌并涂布于SD-Trp培養(yǎng)基，兩個培養(yǎng)基中的酵母菌長勢基本一致，菌落數(shù)目大小相近，說明將AmArg1構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母中，對酵母菌的生長無毒性。

將pGBKT7-AmArg1重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化的酵母單克隆菌液，涂布于加有X-α-gal的SD-Trp培養(yǎng)基上，結(jié)果如圖7A所示，生長的酵母菌株并沒有變藍的情況發(fā)生；與酵母菌的陽性和陰性對照菌液置于同一加有X-α-gal的SD-Trp培養(yǎng)基

上共同培養(yǎng)時，結(jié)果如圖7B所示，在陽性和陰性

對照生長正常的情況下，pGBKT7-AmArg1重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化的酵母單克隆菌株并沒有變藍，這些結(jié)果說明該基因在轉(zhuǎn)入酵母后無自激活活性。

2.5 藏桃AmArg1互作蛋白的篩選

將pGBKT7-AmArg1重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化的酵母單克隆菌株與藏桃cDNA酵母文庫的酵母菌株進行共培養(yǎng)，雜交的單克隆菌株劃線培養(yǎng)在SD-Trp-Leu-His＋X-α-gal平板上，生長情況如圖8A所示，雜交的單克隆酵母菌生長情況正常并且均有變藍，對雜交成功的酵母菌株進行PCR送測，得到的序列在NCBI進行比對。最終篩選出互作蛋白葉綠素結(jié)合蛋白AmLhcb1、Ras相關蛋白AmRabB1b（圖8B）。

2.6 藏桃AmArg1與互作蛋白共轉(zhuǎn)化驗證

將互作蛋白基因片段構(gòu)建到pGADT7載體上，得到pGADT7-AmLhcb1和pGADT7-AmRabB1b重組質(zhì)粒。pGBKT7-AmArg1分別和pGADT7-AmLhcb1、pGADT7-AmRabB1b質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)入酵母菌中得到共轉(zhuǎn)化酵母菌。這些酵母菌在SD-Trp-Leu培養(yǎng)基正常生長，在SD-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上生長且變藍，結(jié)果如圖9所示。

2.7 BiFC實驗重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將AmArg1和AmLhcb1、AmRabB1b分別構(gòu)建到pSPYNE和pSPYCE載體上，最終得到pSPYNE-AmArg1和pSPYCE-AmLhcb1、pSPYCE-AmRabB1b重組質(zhì)粒。雙酶切驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，結(jié)果如圖10所示，目的基因和載體條帶位置正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.8 藏桃AmArg1與互作蛋白的BiFC驗證

將轉(zhuǎn)化有pSPYNE-AmArg1質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌與轉(zhuǎn)化有pSPYCE-AmLhcb1、pSPYCE-AmRabB1b質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的菌株兩兩混合菌液分別共侵染洋蔥表皮細胞，暗培養(yǎng)24 h后再光照培養(yǎng)24 h，制成洋蔥表皮切片后，用熒光顯微鏡檢測GFP熒光信號，結(jié)果如圖11所示，洋蔥表皮細胞中pSPYNE-AmArg1與pSPYCE-AmLhcb1和pSPYCE-AmRabB1b的共表達產(chǎn)生了綠色熒光信號。以上結(jié)果進一步證實了AmArg1與AmLhcb1、AmRabB1b之間存在互作關系。

2.9 pYES2-AmArg1重組載體構(gòu)建

在AmArg1片段已知序列的上下游，通過PCR擴增的方法加入酶切位點XhoI、XbaI。經(jīng)雙酶切驗證，圖12結(jié)果表明pYES2-AmArg1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.10 固體培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因酵母對逆境脅迫的生長響應

如圖13所示，在對照組的培養(yǎng)基上，兩種酵母菌株的生長趨勢相似。在高濃度的NaCl、甘露醇和CuSO4脅迫下，轉(zhuǎn)pYES2-AmArg1的酵母菌株的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于空載酵母菌株，pYES2空載酵母菌株的生長受到明顯抑制。

2.11 液體培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因酵母對逆境脅迫的生長響應

將轉(zhuǎn)化有pYES2-AmArg1和空載pYES2酵母菌液濃度調(diào)整一致，比較在不同濃度梯度的NaCl、甘露醇、CuSO4的脅迫培養(yǎng)基中兩種酵母的生長狀態(tài)。如圖14所示，在正常無脅迫的條件下，兩種酵母菌株的生長趨勢是基本一致的。在不同脅迫下，過表達酵母菌的存活率均優(yōu)于對照組，在100 mmol·L-1NaCl、200 mmol·L-1甘露醇和30 μmol·L-1 CuSO4脅迫下，過表達轉(zhuǎn)AmArg1酵母菌在脅迫處理9 h時的存活率明顯高于對照空載酵母，說明AmArg1的表達提高了酵母抵御鹽脅迫、甘露醇脅迫和CuSO4脅迫的能力。

3 討論

植物精氨酸酶作為一種水解酶，在尿素循環(huán)中扮演著至關重要的角色［1］。精氨酸酶有Ⅰ型和Ⅱ型兩種類型，其在植物系統(tǒng)中的主要作用是在種子發(fā)芽期間調(diào)動儲存的精氨酸，并在發(fā)育期為合成其他氨基酸和多胺提供氮和碳源，其中就包括NO和多胺，而這兩種物質(zhì)是信使分子，植物體中絕大多數(shù)的生理生化過程中都有它們的參與，包括影響植物的生長發(fā)育、提高植物抗逆性等［28-30］。本研究從藏桃的cDNA文庫中克隆到了AmArg1。對藏桃AmArg1的氨基酸序列與多種植物的精氨酸酶的氨基酸序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)藏桃AmArg1與碧桃的PpArg1以及扁桃的PdArg1氨基酸序列同源性最高。在多種不同的網(wǎng)站上對藏桃AmArg1進行理化性質(zhì)等特性分析，可知藏桃的AmArg1是分子量為37 799.14，pI值為5.62的酸性親水性蛋白，它也是無信號肽的非分泌蛋白。

蛋白質(zhì)通常作為動態(tài)網(wǎng)絡的一部分來行使其功能。大量的研究表明，蛋白質(zhì)通過直接或間接的互作關系，參與胞內(nèi)多種生物過程［31］。因此將AmArg1與藏桃cDNA文庫進行雜交，最終篩選出了兩個與AmArg1互作的蛋白，分別是葉綠素結(jié)合蛋白AmLhcb1（chlorophyll a-b binding protein of LHCII type 1）、Ras相關蛋白AmRabB1b（rasrelated protein RABB1b），之后進行了共轉(zhuǎn)化驗證和BiFC驗證，結(jié)果表明AmArg1與AmLhcb1和AmRabB1b具有相互作用關系。

酵母與植物應對逆境的機制高度相似［32］，對于某個基因的研究來說，酵母表達系統(tǒng)對于其抗逆性功能的探究有很大幫助，20世紀90年代研究人員用酵母表達系統(tǒng)來研究植物的耐鹽性［33］。本研究將AmArg1基因轉(zhuǎn)入了酵母細胞，旨在驗證該基因的抗逆功能。結(jié)果顯示，在NaCl、甘露醇和CuSO4脅迫的液體脅迫培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)pYES2-AmArg1的酵母菌株表現(xiàn)出更高的存活率；同時，在加有NaCl、甘露醇和CuSO4脅迫的固體培養(yǎng)基上，過表達AmArg1酵母菌的生長趨勢明顯優(yōu)于空載對照酵母菌株。這與TrSOS1等基因在酵母中的過表達能夠提高酵母菌脅迫耐受性的結(jié)果相一致［34］。因此推測過表達AmArg1可能提高了酵母菌對鹽、干旱和CuSO4的耐逆能力。

4 結(jié)論

本研究以藏桃葉片cDNA為模板成功擴增出AmArg1基因，對AmArg1蛋白進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)AmArg1與碧桃和扁桃具有較高的同源性，是酸性的無信號肽結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。成功構(gòu)建pGBKT7-AmArg1重組載體，篩選出了互作蛋白AmLhcb1、AmRabB1b并通過BiFC驗證其相互作用。過表達轉(zhuǎn)AmArg1酵母菌株在液體培養(yǎng)基中的存活率更高，且在固體培養(yǎng)基中的生長表型更優(yōu)，表明過表達轉(zhuǎn)AmArg1酵母菌具有較強的對鹽、甘露醇、金屬Cu脅迫的耐受性。為深入探究AmArg1的生物學功能提供了思路。

參考文獻：

［1］ SIDDAPPA S， MARATHE G K. What we know about plant arginases？［J］. Plant Physiology and Biochemistry， 2020， 156： 600-610.

［2］ WINTER G， TODD C D， TROVATO M， et al. Physiological implications of arginine metabolism in plants［J］. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 534.

［3］ CAO F Q， WERNER A K， DAHNCKE K， et al. Identification and characterization of proteins involved in rice urea and arginine catabolism［J］. Plant Physiology， 2010， 154（1）： 98-108.

［4］ ZONIA L E， STEBBINS N E， POLACCO J C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds［J］. Plant Physiology， 1995， 107（4）： 1097-1103.

［5］ 郭新海， 祖洪月， 楊帆， 等. 轉(zhuǎn)精氨酸酶基因ZmARG玉米后代株系的遺傳穩(wěn)定性分析和功能驗證［J］. 玉米科學， 2017， 25（1）： 34-38.

［6］ CHEN H， McCAIG B C， MELOTTO M， et al. Regulation of plant arginase by wounding， jasmonate， and the phytotoxin coronatine［J］. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279（44）： 45998-46007.

［7］ HWANG H J， KIM E H， CHO Y D. Isolation and properties of arginase from a shade plant， ginseng （Panax ginseng C.A. Meyer） roots［J］. Phytochemistry， 2001， 58（7）： 1015-1024.

［8］ 楊慧. 水稻精氨酸酶基因啟動子表達模式及精氨酸酶基因的功能研究［D］. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學院， 2014.

［9］ 張曉旭. 擬南芥精氨酸酶基因（AtARGAH1、AtARGAH2）功能解析以及對氮源和鹽脅迫的響應［D］. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學， 2014.

［10］ 王慧飛， 馮雪， 張一名， 等. 棉花精氨酸酶基因GhARG1 cDNA的克隆與表達分析［J］. 華北農(nóng)學報， 2018， 33（4）： 17-24.

［11］ SHE M Y， WANG J， WANG X M， et al. Comprehensive molecular analysis of arginase-encoding genes in common wheat and its progenitor species［J］. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 6641.

［12］ MIN D D， LI F J， ZHANG X H， et al. SlMYC2 involved in methyl jasmonate-induced tomato fruit chilling tolerance［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2018， 66（12）： 3110-3117.

［13］ ZHANG X H， SHEN L， LI F J， et al. Methyl salicylate-induced arginine catabolism is associated with up-regulation of polyamine and nitric oxide levels and improves chilling tolerance in cherry tomato fruit［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2011， 59（17）： 9351-9357.

［14］ ZHANG X H， SHEN L， LI F J， et al. Up-regulating arginase contributes to amelioration of chilling stress and the antioxidant system in cherry tomato fruits［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2010， 90（13）： 2195-2202.

［15］ SIDDAPPA S， BASRUR V， RAVISHANKAR RAI V， et al. Biochemical and functional characterization of an atypical plant l-arginase from Cilantro （Coriandrum sativam L.）［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2018， 118： 844-856.

［16］ MILLANES A M， FONTANIELLA B， LEGAZ M E， et al. Glycoproteins from sugarcane plants regulate cell polarity of Ustilago scitaminea teliospores［J］. Journal of Plant Physiology， 2005， 162（3）： 253-265.

［17］ BRAUC S， de VOOGHT E， CLAEYS M， et al. Overexpression of arginase in Arabidopsis thaliana influences defence responses against Botrytis cinerea［J］. Plant Biology， 2012， 14（Suppl 1）： 39-45.

［18］ YANG B J， RUAN R， CANTU D， et al. A comparative approach expands the protein-protein interaction node of the immune receptor XA21 in wheat and rice［J］. Genome， 2013， 56（6）： 315-326.

［19］ 左力旭. 西藏光核桃功效成分及制粉技術(shù)研究［D］. 天津： 天津科技大學， 2019.

［20］ 李媛蓉. 西藏光核桃嫁接繁育技術(shù)［J］. 安徽農(nóng)學通報， 2021， 27（7）： 56-57， 95.

［21］ 李亞斌. 核桃實生苗培育技術(shù)［J］. 安徽農(nóng)學通報， 2013， 19（9）： 65， 83.

［22］ 張新宇， 高燕寧. PCR引物設計及軟件使用技巧［J］. 生物信息學， 2004， 2（4）： 15-18， 46.

［23］ 孫佳， 劉躍華， 秦軻茹， 等. 人ANKRD49基因及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學分析［J］. 中國生物制品學雜志， 2021， 34（8）： 904-909， 916.

［24］ 季夢瑋， 滕飛翔， 周敏， 等. 原生動物AQPs系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建以及結(jié)構(gòu)分析［J］. 江蘇科技信息， 2019， 36（13）： 46-51.

［25］ CAO Q D， DAI B H， YANG Y， et al. ASFV pp62 protein has 9 dominant B-T cell combined epitopes［J］. Animal Husbandry and Feed Science， 2022， 14（4）： 13-20.

［26］ 譚妮. 蘋果樹腐爛病菌CAP蛋白VmPR1c功能域研究及作用靶標鑒定［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學， 2021.

［27］ 楊艷北，許晶，馬荊鄂，等. 沼澤紅假單胞菌相似菌株間差異功能模體的篩選和分析 ［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2022， 50 （3）： 73-78.

［28］ SPLITTSTOESSER W E. The appearance of arginine and arginase in pumpkin cotyledons. Characterization of arginase［J］. Phytochemistry， 1969， 8（4）： 753-758.

［29］ MICALLEF B J， SHELP B J. Arginine metabolism in developing soybean cotyledons： II. biosynthesis［J］. Plant Physiology， 1989， 90（2）： 631-634.

［30］ KING J E， GIFFORD D J. Amino acid utilization in seeds of loblolly pine during germination and early seedling growth （I. arginine and arginase activity）［J］. Plant Physiology， 1997， 113（4）： 1125-1135.

［31］ LIN J S， LAI E M. Protein-protein interactions： co-immuno-precipitation［M］//Methods in Molecular Biology. New York， NY： Springer New York， 2017： 211-219.

［32］ HASEGAWA P M， BRESSAN R A， ZHU J K， et al. Plant cellular and molecular responses to high salinity［J］. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 2000， 51： 463-499.

［33］ SERRANO R. Salt tolerance in plants and microorganisms： toxicity targets and defense responses［J］. International Review of Cytology， 1996， 165： 1-52.

［34］ CHE B N， CHENG C， FANG J J， et al. The recretohalophyte Tamarix TrSOS1 gene confers enhanced salt tolerance to transgenic hairy root composite cotton seedlings exhibiting virus-induced gene silencing of GhSOS1［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（12）： 2930.

Gene Cloning，Interacting Protein Screening and Stress Resistance Analysis of AmArg1 Gene from Amygdalus mira Koehne

BAI Jiexia， LI Jiaxin， LIU Lulu， LUO Qiuxiang

（Key Laboratory of Northeast Saline-alkali Vegetation Restoration and Reconstruction， Ministry of Education/School of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin 150040，China）

Abstract：In order to investigate the arginase 1 （AmArg1） of Amygdalus mira， the full-length ORF of the arginase 1，AmArg1was cloned and therefore， the deduced protein sequence was predicted for structure and physicochemical properties via bioinformatics analysis. The results showed that the protein was an acidic， non-secreted protein with no signal peptide structure. AmArg1 was transferred into yeast cells and it was non-toxic and non-self-activating for yeast cells. The interacting proteins， AmLhcb1 and AmRabB1b of AmArg1 were screened by yeast two hybrid assays， and their interactions were validated by BiFC analysis. Transgenic yeast in response to NaCl， mannitol， and CuSO4 stress was preliminarily explored， and found that over-expression of AmArg1 might increase the tolerance to these stresses.

Keywords：Amygdalus mira Koehne; interacting proteins; abiotic stress; AmArg1 gene