沙棘玫瑰醋高產酸菌株的分離和篩選及分子生物學鑒定

摘要：醋酸菌是果醋發(fā)酵過程中產生醋酸及其風味衍生物的重要微生物，具有耐醇性或耐溫性的高產酸醋酸菌對提高發(fā)酵型果醋質量意義重大。為了解決沙棘玫瑰醋風味品質差的問題，篩選適合發(fā)酵的醋酸菌，為促進沙棘玫瑰醋風味品質的提高及研發(fā)復合發(fā)酵菌劑提供理論支持。以浙江玫瑰醋醋醪為菌源，篩選出適合沙棘玫瑰醋生產的高產酸專用菌種。結果表明，根據(jù)菌落形態(tài)及生理生化試驗分離篩選出4株高產酸醋酸桿菌（Acetobacter），其中菌株SJC01、SJC04的產酸量均達到42.00 g/L以上，能耐受體積分數(shù)4%乙酸溶液、體積分數(shù)0.5%氯化鈉溶液、體積分數(shù)6.0%乙醇溶液，且分別能在12～36、 24～48 h內進入迅速生長期。通過16SrDNA序列分子生物學鑒定，菌株SJC01為果實醋桿菌（Acetobacter pomorum），菌株SJC04為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurians）。

關鍵詞：沙棘玫瑰醋；醋酸桿菌；高產酸；分離篩選；菌種鑒定

中圖分類號：TS255.4" " " " " "文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2097-2172（2025）01-0060-07

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2025.01.010

Isolation， Screening and Molecular Biological Identification of

High-acid-producing Strains for Seabuckthorn Rose Vinegar

ZHANG Haiyan KANG Sanjiang CHEN Zhixi YUAN Jing GOU Lina

（1. Agricultural Product Storage and Processing Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Science， Lanzhou

Gansu 730070， China; 2. Huachi Gannong Biotechnology Co.， Ltd.， Huachi Gansu 745600， China）

Abstract：" Acetic acid bacteria are key microorganisms in fruit vinegar fermentation， producing acetic acid and its flavor derivatives. High-acid producing acetic acid bacteria with ethanol or temperature tolerance are crucial for improving the quality of fermented fruit vinegar. To address the issue of poor flavor quality in seabuckthorn rose vinegar， acetic acid bacteria suitable for fermentation were screened to enhance its flavor quality and support the development of compound fermentation agents. Using Zhejiang rose vinegar mash as the bacterial source， high-acid-yielding strains specifically suited for seabuckthorn rose vinegar production were screened. Results showed that four strains were preliminarily identified as Acetobacter according to colony morphology and physiological and biochemical tests. Strong acid production abilities were demonstrated by strains SJC01 and SJC04， with acid production more than 42.00 g/L. Tolerance tests were carried out on strains with high acid production. Strains SJC01 and SJC04 were found to tolerate 4.0% acetic acid， 0.5% sodium chloride， and 6.0% ethanol solutions. Growth curves revealed that the logarithmic growth phase was reached within 12 to 36 hours and 24 to 45 hours by strains SJC01 and SJC04， respectively. Molecular identification using 16SrDNA sequencing revealed that strain SJC01 was Acetobacter pomorum and strain SJC04 was Acetobacter pasteurians.

Key words：" Seabuckthorn rose vinegar; Acetic acid bacteria; High-acid-yielding; Isolation and screeninga; Identification of strain

沙棘為藥食同源植物［1 ］，根、莖、葉、花、果，特別是沙棘果實含有豐富的營養(yǎng)物質和生物活性物質，入藥具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效［2 ］，可以廣泛應用于食品、醫(yī)藥、輕工、航天、農牧漁業(yè)等國民經濟的許多領域［3 ］。沙棘果汁占果實的65%以上，含有豐富的水溶性維生素、脂肪酸、微量元素、亞油素、糖類、有機酸等營養(yǎng)物質和黃酮、超氧化物等活性物質以及人體所需的各種氨基酸［4 - 5 ］，可加工成果汁、果醋、酵素、果酒等產品，有著廣闊的發(fā)展?jié)摿Γ? ］。

果醋富含多種小分子有機酸、酚類物質、維生素、氨基酸及礦物元素等營養(yǎng)物質，具有緩解人體疲勞、促進腸道代謝、降血脂和預防高血壓等功效［7 ］。高酸度是發(fā)酵型果醋的重要品質指標，專用醋酸菌是決定高酸度果醋質量與產量的主要因素，是提高品質、增強風味與香氣的基礎［8 - 9 ］。姬玉丹［10 ］篩選出一株乙醇轉化率高、產酸能力強的青梅果醋優(yōu)良醋酸發(fā)酵菌種J-27，提高了青梅果醋的品質；何宇寧［11 ］選育出的菠蘿蜜果醋發(fā)酵醋酸菌Aa941的耐乙醇和耐高溫性能均優(yōu)于商業(yè)菌株As1.41；周滟晴等［12 ］對高產酸果醋醋酸菌的篩選鑒定及其耐醇和耐溫性進出行了研究，豐富了果醋醋酸菌種庫；李華敏等［13 ］篩選的蘋果醋專用醋酸桿菌產酸性能及風味品質較好。然而，有關沙棘果醋專用醋酸菌選育的研究較少。沙棘果實酸度高，是釀造沙棘果醋的優(yōu)良原料［14 ］，沙棘玫瑰醋是采用浙江玫瑰醋生產工藝釀造的沙棘果醋，因其色澤鮮艷，具有淺玫瑰色，故而得名。沙棘玫瑰醋不僅保留了原料中的大部分營養(yǎng)物質，且提高了多肽、氨基酸、有機酸等對人體有益的物質含量［15 ］。但本課題組研究發(fā)現(xiàn)，由于專用釀造醋酸菌的缺乏，使得沙棘玫瑰醋釀造過程中存在產酸能力不足、乙醇轉化率低、典型性風味缺失等問題，因而選育沙棘玫瑰醋專用高產酸醋酸菌具有重要意義。為此，我們以浙江玫瑰醋醋醪為菌源，分離篩選耐受性好、產酸量高的優(yōu)良醋酸菌株，同時以產酸量和菌株生長情況為指標，對其在沙棘玫瑰醋中的發(fā)酵特性進行分析研究，并通過16SrDNA對優(yōu)良菌株進行菌種鑒定，以期解決沙棘玫瑰醋存在的問題，并為沙棘玫瑰醋的生產提供理論依據(jù)。

1" "材料與方法

1.1" "材料與試劑

供試浙江玫瑰醋醋醪采集自浙江五味和食品有限公司；對照菌株為商業(yè)巴氏醋桿菌20001，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

醋酸菌分離培養(yǎng)基（酵母浸粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、碳酸鈣20 g/L、溴甲酚紫0.015 g/L、瓊脂15 g/L，pH 6.8±0.2，25 ℃）、發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖10 g/L、酵母粉10 g/L，pH 5.5，25 ℃）購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；無水乙醇購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2" "儀器與設備

B302生物顯微鏡由重慶奧特光學儀器有限責任公司提供，LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科學儀器有限公司提供，YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋由上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠提供，MDF-U3386S超低溫冰箱由青島海爾集團提供，SW-CJ-2D潔凈工作臺由蘇州凈化設備有限公司提供，PB-10型精密pH計由賽多利斯科學儀器（北京）有限公司提供，QL-861旋渦振蕩器由江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠提供，ABI-2720 pcr儀、ABI 3730XL測序儀由美國Applied Biosystems公司提供。

1.3" "試驗方法

1.3.1" " 菌株分離篩選" " 參照曹施靜等［16 ］的方法，略有改動。稱取20 g浙江玫瑰醋醋醪，置于裝有80 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，于30 ℃、200 r/min 充分振蕩20 min。取2 mL菌懸液裝入含有8 mL無菌生理鹽水的試管中進行濃度稀釋。將10-4～10-6梯度的溶液吸取0.2 mL涂布于分離培養(yǎng)基平板中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72 h后，挑選變色圈清晰且生長良好的單菌落進行3～5次分離純化，對符合條件的單菌落進行編號。

1.3.2" " 菌落及細胞形態(tài)研究" " 參照馮荊舒等［17 ］的方法，略有改動。將篩選的菌株在分離培養(yǎng)基平板中劃線，于30 ℃培養(yǎng)72 h后，觀察并記錄單菌落特征，包括透明度、顏色、表面情況、邊緣狀態(tài)等；將分離純化的菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體細胞形態(tài)。

1.3.3" " 生理生化試驗" " 發(fā)酵葡萄糖、產葡萄糖、接觸酶、氧化酶、甘油生酮、運動性、產水溶性色素、乳酸氧化、乙酸氧化、乙醇氧化等試驗均" " 參照王超敏等［18 ］的方法進行。

1.3.4" " 定性和定量試驗" " 參照曹施靜等［16 ］的方法進行。

定性試驗：將振蕩培養(yǎng)好的菌液，用0.1 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，滴入4～5滴5%的FeCl3溶液，水浴加熱5 min后，若出現(xiàn)紅褐色沉淀，則為醋酸菌。

定量實驗：將振蕩培養(yǎng)好的菌液，參照GB 12456 — 2021《食品安全國家標準" "食品中總酸的測定》測定產酸量。

1.3.5" " 醋酸菌耐受性試驗" " 分別將體積分數(shù)為2%、3%、4%、5%、6%的乙酸溶液，體積分數(shù)為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的氯化鈉溶液，體積分數(shù)為2%、4%、6%、8%、10%的乙醇溶液接入到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，并接入10%的菌懸液，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每隔12 h測定生長量（OD600值）和產酸量，直至穩(wěn)定。

1.3.6" " 生長曲線測定" " 將篩選出的優(yōu)良菌株接種于液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，同時將10-4～10-6梯度的菌液分別吸取1 mL均勻涂布至醋酸菌分離培養(yǎng)基平板，于30 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔12 h分別測定OD600值和活菌數(shù)。

1.3.7" " 分子生物學鑒定" " 將篩選出的優(yōu)良菌株進行測序，測序引物選用細菌16SrDNA的通用引物27F和1492R。測序結果在NCBI中比對，并采用MEGA 11.0軟件進行多序列比對，選擇相似度最高的序列作為物種鑒定結果。

1.4" "數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 26.0等軟件進行數(shù)據(jù)分析處理和作圖。

2" "結果與分析

2.1" "菌落及細胞形態(tài)

醋酸桿菌是一類能使糖類和酒精氧化成醋酸等產物的短桿菌［19 ］。采用稀釋平板分離法和劃線分離法，從浙江玫瑰醋醋液及醋醪中分離得到4株具有典型醋酸菌特征的菌株，分別命名為SJC01、SJC02、SJC03、SJC04。醋酸菌菌體生長旺盛，菌落的細胞形態(tài)主要為橢圓狀、短桿狀，米白色，表面平滑，邊緣整齊，培養(yǎng)基內無色素產生。其中典型醋酸菌菌株SJC01和SJC02的菌落及細胞形態(tài)見圖1。

2.2" "生理生化試驗結果

從表1可以看出，4株菌株在發(fā)酵葡萄糖、產葡萄糖、接觸酶、甘油生酮、乳酸氧化、乙酸氧化、乙醇氧化試驗中均為陽性反應，在氧化酶、產水溶性色素試驗中為陰性反應；運動性試驗除菌株SJC02為陽性反應外，其余均為陰性。綜合以上生理生化試驗結果，對照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［20 - 21 ］，初步確定SJC01、SJC02、SJC03、SJC04菌株為醋酸桿菌屬（Acetobacter）。

2.3" "定性試驗結果

從表2可以看出， SJC01和SJC04菌株均能產生明顯的紅褐色沉淀，SJC02菌株紅褐色較明顯，SJC03菌株紅褐色不太明顯，說明4株菌株均屬于醋酸桿菌屬。

2.4" "定量試驗結果

產酸量是反應醋酸菌品質的重要指標，篩選產酸能力較強的醋酸菌對提高沙棘玫瑰醋酸度，改善其釀造工藝具有重要作用［22 ］。從圖2可以看出，菌株SJC01、SJC04的產酸能力較強，產酸量分別為43.50、42.63 g/L，顯著高于對照菌株商業(yè)巴氏醋桿菌20001（P lt; 0.05）；菌株SJC02產酸能力與對照菌株商業(yè)巴氏醋桿菌20001（35.45 g/L）差異不顯著（P gt; 0.05），產酸量為35.22 g/L；菌株SJC03的產酸量為21.05 g/L，顯著低于對照菌株（P lt; 0.05）。說明菌株SJC01、SJC04產酸能力明顯優(yōu)于SJC02、SJC03。

2.5" "醋酸菌耐受性試驗結果

通過產酸定量試驗，確定菌株SJC01、SJC02和SJC04為優(yōu)良菌株，對其分別進行耐乙酸、耐氯化鈉、耐乙醇能力分析。

2.5.1" " 耐乙酸能力" " 從圖3可以看出，隨著乙酸濃度不斷增加，4株菌株產酸量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當乙酸濃度為3%時，菌株SJC02和對照菌株商業(yè)巴氏醋桿菌20001產酸量均達到最大值，分別為36.22 、33.67 g/L；當乙酸濃度為4%時，菌株SJC01、SJC04的產酸量均達到最大值，產酸量分別為41.19 、40.01 g/L，顯著高于對照菌株（P lt; 0.05）；當乙酸濃度從2%增至3%時，所有菌株生長量及產酸量受到影響較?。划斠宜釢舛葹?%時，菌株SJC02及對照菌株商業(yè)巴氏醋桿菌20001的生長量受到明顯抑制，而菌株SJC01、SJC04生長量較高，分別為0.565和0.598；當乙酸濃度繼續(xù)升高至6%時，菌株SJC01和SJC04的產酸量均低于30.00 g/L ，與對照菌株和SJC02相比差異均達顯著水平（P lt; 0.05），而菌株SJC02和對照菌株的產酸量低于20.00 g/L，說明過酸或堿性的環(huán)境均會影響醋酸菌生長，這可能與醋酸菌機體內的酶有關，不適宜的環(huán)境會導致相關酶活性降低，從而影響醋酸菌產酸能力［23 ］。通過對比可知，菌種SJC01和SJC04在乙酸濃度下生長量及產酸量優(yōu)于其他菌株，擁有較好的耐乙酸能力。

2.5.2" " 耐氯化鈉能力" " 由圖4可以看出，氯化鈉濃度從0.1%增加至0.5%時，對菌株生長及產酸量的影響較小。氯化鈉濃度為0.5%時，對照菌株商業(yè)巴氏醋桿菌20001生長量及產酸量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，在濃度為0.9%時產酸量僅為5.24 g/L；氯化鈉濃度從0.5%增至0.9%時，菌株SJC01、SJC04生長量和產酸量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，在濃度為0.9%時，生長量分別為0.677、0.525，產酸量分別為20.96 、16.23 g/L，與對照菌株和菌株SJC02相比差異顯著（P lt; 0.05）。說明醋酸菌在氯化鈉濃度較低時仍可以生長，但隨著濃度增加生長會受到嚴重抑制，影響其產酸能力［24 ］。綜上所述，氯化鈉對菌株SJC01和SJC04生長影響較大，因此在培養(yǎng)時氯化鈉濃度盡量控制在0.5%以內，保證菌株較好的產酸及生長，且在不同濃度的氯化鈉溶液中，菌株SJC01和SJC04生長量和產酸量優(yōu)于其他菌株，擁有較好的氯化鈉耐受性。

2.5.3" " 耐乙醇能力" " 從圖5可以看出，隨著乙醇濃度的增加，各菌株生長量呈逐漸下降趨勢，產酸量先增加后降低。對照菌株商業(yè)巴氏醋桿菌20001在乙醇濃度為4%時達到最大產酸量，菌株SJC01、SJC02、SJC04均在乙醇濃度為6%時產酸量最高，分別為40.01 、35.01、41.21 g/L，顯著高于對照菌株（P lt; 0.05）；隨著乙醇濃度的持續(xù)升高，所有菌株的生長量及產酸量呈下降趨勢，當乙醇濃度增至10%時，對照菌株和菌株SJC01、SJC02、SJC04的生長量分別為0.401、0.913、0.775、0.824，產酸量分別為12.70、25.28、20.01、23.86 g/L。因此，適宜濃度的乙醇有促進醋酸菌生長的作用，當初始乙醇添加量達到醋酸菌耐受臨界點時，菌株的生長變化慢，導致其產酸量下降［25 ］。綜合對比，菌株SJC01和SJC04在高乙醇濃度下生長量及產酸量優(yōu)于其他菌株，擁有較好的乙醇耐受性。

2.6" "生長曲線測定分析

對篩選的2株耐受性較強的菌株SJC01、SJC04進行活菌數(shù)和生長曲線測定分析，由結果（圖6）可以看出，菌株SJC01在12～36 h生長繁殖速度快，處于對數(shù)期，OD600值最大為1.643，活菌數(shù)最大濃度為8.31 log CFU/mL；36～60 h處于穩(wěn)定期，隨后逐漸進入衰亡期。菌株SJC04在24～48 h 生長繁殖速度快，處于對數(shù)期，OD600值最大為1.931，活菌數(shù)最大濃度為8.90 log CFU/mL；48～72 h處于穩(wěn)定期，之后逐漸進入衰亡期。綜上所述，醋酸菌菌株SJC01、SJC04能在較短時間內進入對數(shù)期，在此階段菌株的菌體以幾何數(shù)量級增長，對發(fā)酵環(huán)境具有強大的抵抗力。

2.7" "分子生物學鑒定

將菌株SJC01和SJC04的16SrDNA序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行對比發(fā)現(xiàn)，SJC01與序列號為MW928433.1的Acetobacter pomorum的同源性最高，相似度為99.86%；SJC04與序列號為NR_178820.1的Acetobacter pasteurianus同源性最高，相似度99.84%（表3）。因此可確定篩選出的SJC01為果實醋桿菌（Acetobacter pomorum），SJC04為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurians）。

3" "討論與結論

沙棘是兼具生態(tài)和營養(yǎng)保健作用以及藥用價值的植物，因此，隨著沙棘在食品學、營養(yǎng)學、醫(yī)學、農林學、運動科學等方面的深入研究，沙棘被認為是一種高級營養(yǎng)保健品的重要原料，開發(fā)沙棘加工產品已經成為新的研究方向［26 ］。沙棘玫瑰醋具有殺菌消炎的功效，且能有效改善動脈血壓、總血漿膽固醇對心血管臟器產生的不良影響，能夠刺激腸道微生物菌群，改善其生長活動環(huán)境。隨著現(xiàn)代生物發(fā)酵加工技術的逐步推廣應用，沙棘精深加工水平得到進一步提升［27 ］。沙棘玫瑰醋的成功開發(fā)，不僅能提高沙棘資源的利用率及其商品價值，進一步加強生態(tài)建設和促進農民增收，還能充分發(fā)揮沙棘特殊的保健功效，滿足人們對高品質生活的需求［28 ］。解決沙棘玫瑰醋釀造過程中存在的適宜菌株缺乏的關鍵技術問題具有緊迫的現(xiàn)實意義。醋酸菌是果醋發(fā)酵過程中產生醋酸及其風味衍生物的重要微生物，具有耐醇性或耐溫性的高產酸醋酸菌對提高我國發(fā)酵型果醋質量具有重要意義［12 ］。目前醋酸菌的選育主要集中在提高醋酸產量方面，而果醋的研究開發(fā)對醋酸菌的要求是發(fā)酵過程中較好地保持水果中原有的風味物質、營養(yǎng)物質與功能性成分，使果醋中各物質配比均衡達到營養(yǎng)保健的目的［29 ］。而在本研究中，未開展接種強化發(fā)酵應用試驗研究，后期可將篩選出來的優(yōu)良菌株SJC01和SJC04強化應用到沙棘玫瑰醋的實際生產中，研究其在沙棘玫瑰醋釀造過程中微生物群落變化及對風味形成機制的影響等。因此，有關篩選出的醋酸菌菌株SJC01、SJC04對沙棘玫瑰醋代謝產物的影響有待于進一步研究。

本試驗以浙江玫瑰醋醋醪為菌源，篩選得到4株醋酸桿菌菌株，經定性試驗、耐受性試驗等篩選出2株產酸能力達到42.00 g/L以上，能耐受體積分數(shù)4%乙酸溶液、體積分數(shù)0.5%氯化鈉溶液、體積分數(shù)6%乙醇溶液的優(yōu)良醋酸菌菌株SJC01、SJC04，進一步對活菌數(shù)和生長曲線進行分析，發(fā)現(xiàn)菌株SJC01在12～36 h、菌株SJC04在24～48 h生長繁殖速度快，具有在短時間內進入迅速生長期的特性。經16SrDNA序列分子生物學鑒定，菌株SJC01為果實醋桿菌，菌株SJC04為巴氏醋桿菌。

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