高效液相色譜-電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大米5種硒形態(tài)

摘 要：建立了一種采用高效液相色譜-電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亞硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）]

5種硒形態(tài)的分析方法。利用小麥粉質(zhì)控樣（ERM-BC210a）中硒代蛋氨酸的測(cè)定回收率分析優(yōu)化硒形態(tài)的提取效果；以O(shè)2作為反應(yīng)池氣體，在硒元素質(zhì)量轉(zhuǎn)移Se（m/z 80＞96）模式下，以Hamilton PRP-X100為分析柱，以5 mmol·L-1的檸檬酸溶液（pH=5.0）為流動(dòng)相，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)。結(jié)果表明，在0.5～200.0 μg·L-1，各硒形態(tài)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5；SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）檢出限分別為0.002、0.004、0.005、0.002 mg·kg-1和0.001 mg·kg-1；在0.025、0.100、0.250 mg·kg-1 3個(gè)加標(biāo)水平下，各硒形態(tài)的平均加標(biāo)回收率為79.9%～106.3%。10批海南地區(qū)大米中主要檢出的硒形態(tài)為SeMet，其他硒形態(tài)均未檢出。該方法準(zhǔn)確、靈敏，可滿足大米中硒形態(tài)的

定量分析。

關(guān)鍵詞：硒形態(tài)；大米；高效液相色譜-電感耦合等離子串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀

Determination of Five Selenium Species in Rice by High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Tandem Mass Spectrometry

FU Yufu， WEI Ying， LIU Dongni， KANG Rui， LIN Zhifan， GU Mantun*

（Institute of Food Testing， Hainan Academy of Inspection and Testing， Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety， State Administration for Market Regulation， Haikou 570314， China）

Abstract： A method was developed for the determination of five selenium forms in rice， including selenocystine （SeCys2）， methyl-selenocysteine （MeSeCys）， selenite [Se（Ⅳ）]， selenomethionine （SeMet） and selenate [Se（Ⅵ）]， by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The recovery rate of selenomethionine in wheat flour quality control sample （ERM-BC210a） was used to analyze and optimize the extraction effect of selenium morphology. O2 was used as the reaction cell gas， selenium mass transfer Se （m/z 80＞

96） mode， Hamilton PRP-X100 was used as the analytical column， and 5 mmol·L-1 citric acid solution （pH=5.0） was used as mobile phase and was detected by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The results showed that in 0.5 to 200.0 μg·L-1， the linear relationship between selenium morphology was good， and the correlation coefficients were greater than 0.999 5， and the detection limits of SeCys2， MeSeCys， Se（Ⅳ）， SeMet and Se（Ⅵ） were 0.002 mg·kg-1， 0.004 mg·kg-1， 0.005 mg·kg-1， 0.002 mg·kg-1 and

0.001 mg·kg-1， respectively. The average recoveries of selenium forms were from 79.9% to 106.3% at the three spike levels of 0.025 mg·kg-1， 0.100 mg·kg-1 and 0.250 mg·kg-1. SeMet was the main selenium form detected in 10 batches of rice from Hainan， while no other selenium forms were detected. This method is accurate and sensitive， which can meet the quantitative analysis of selenium form in rice.

Keywords： selenium species; rice; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry

硒元素是人體必需的一種微量元素，其通過抗氧防御機(jī)制參與人體免疫系統(tǒng)防御，增強(qiáng)抗病毒能力、排毒與抗氧化功能等[1]。飲食攝取是人體補(bǔ)硒最主要的途徑，但是我國(guó)是較嚴(yán)重的缺硒國(guó)家之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)有72%的地區(qū)缺硒，其中29%為嚴(yán)重缺硒地區(qū)[2]；2006年海南省地質(zhì)調(diào)查院首次宣布在海南島發(fā)現(xiàn)富硒土壤占全島總面積的28.14%，主要分布在海南島中東部地區(qū)[3]。海南硒資源位居全國(guó)前列，同時(shí)是糧食作物水稻的主要種植地區(qū)，但針對(duì)海南地區(qū)大米中的硒含量及硒形態(tài)的研究報(bào)道較少。

目前，測(cè)定大米中硒元素的方法較多，主要包括氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法（Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS）、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）等。其中，HG-AFS法操作簡(jiǎn)便，但靈敏度較低；ICP-MS法靈敏度高[4]，但其采用氦氣碰撞模式，由于氬原子離子、稀土雙電荷等對(duì)豐度最高的80Se有干擾[5]，常選用豐度較低的78Se作為硒元素的檢測(cè)質(zhì)量數(shù)，信號(hào)響應(yīng)較低。本研究采用的電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜（Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，ICP-MS/MS）技術(shù)具備兩組四極桿質(zhì)量過濾器，在O2反應(yīng)模式下，硒元素檢測(cè)質(zhì)量數(shù)可由80Se+轉(zhuǎn)換成80Se16O+，由此可消除多原子離子等干擾[6]，可使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、更靈敏；同時(shí)利用液相色譜技術(shù)與ICP-MS/MS相結(jié)合，在O2模式下，可使硒形態(tài)檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本研究建立同時(shí)測(cè)定海南大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亞硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）] 5種硒形態(tài)的高效液相色譜-電感耦合等離子串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS/MS）分析方法，以獲得更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米，產(chǎn)自海南?？?、瓊海、五指山等市縣，共計(jì)10批次。

SeCys2溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW 10087，（44.2±

1.0）μg·g-1，以Se計(jì)]、MeSeCys溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW 10088，（34.8±1.0）μg·g-1，以Se計(jì)]、Se（Ⅳ）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW 10032，（42.9±0.9）μg·g-1，

以Se計(jì)]、SeMet溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW 10034，（39.4±1.0）μg·g-1，以Se計(jì)]、Se（Ⅵ）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW 10033，（41.5±1.3）μg·g-1，以Se計(jì)]，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；小麥粉質(zhì)控樣[批號(hào)ERM-BC210a，硒代蛋氨酸標(biāo)示值（27.4±2.6）mg·kg-1]，英國(guó)LGC公司；胰蛋白酶γ（CAS：9002-07-7），國(guó)藥集團(tuán)；蛋白酶K（CAS：39450-01-6），麥克林；鏈蛋白酶E（CAS：9036-06-0），上海源葉生物；硝酸（優(yōu)級(jí)純），德國(guó)默克；三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TRIS-HCl，純度99%），阿法埃莎化學(xué)；氨水（色譜純），德國(guó)默克；Milli-Q超純水，德國(guó)默克。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent；8900型感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent；陰離子交換色譜柱Hamilton PRP-X100（150 mm×

4.6 mm，5 μm）；Thermo IonPac AS19（250 mm×

4 mm）；Thermo IonPac AS7（250 mm×4 mm）；MARS型微波消解儀，美國(guó)培安；XS204型電子分析天平，瑞士梅特勒；SHZ-C型恒溫振蕩水浴，上海龍躍；SK7200B 超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)；Multi reax（EX）渦旋混合器，德國(guó)海道夫；Million Q型超純水器，德國(guó)默克。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

精密稱取2 g大米粉于15 mL離心管中，加入鏈霉蛋白酶E 20 mg與樣品混勻，加入10 mL

75 mmol·L-1 Tris-HCl提取液，渦旋振蕩混勻

1 min，超聲30 min后，于37 ℃恒溫水浴振蕩4 h，10 000 r·min-1離心3 min，上清液過0.22 μm水系濾膜，濾液為待測(cè)液。

小麥粉質(zhì)控樣ERM-BC210a根據(jù)證書含量計(jì)算，準(zhǔn)確稱取0.3 g樣品于50 mL離心管中，后續(xù)操作同樣品一致。

1.3.2 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用電子分析天平分別稱取一定量的MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、SeCys2和Se（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用水稀釋并定容，分別得到質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ：各取1 mL的MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、SeCys2、Se（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水定容至10 mL的容量瓶中，得到1 μg·mL-1的5種混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅱ：取1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ，用水定容至10 mL的容量瓶中，得到

100 μg·L-1的3種混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅱ。

用移液槍分別吸取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ、Ⅱ，經(jīng)空白基質(zhì)溶液定容至1 mL，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.3 儀器條件參數(shù)

（1）ICP-MS/MS。射頻功率：1 550 W；掃描類型：串接；工作氣：Ar；霧化氣流速：

1.09 L·min-1；補(bǔ)償氣流速：0 L·min-1；輔助氣流速：

0.90 L·min-1；采樣深度：10.0 mm；反應(yīng)氣：O2；O2流速：30%；提取透鏡1：0 V；提取透鏡2：250 V；采集質(zhì)量數(shù)：80＞96（m/z）；積分時(shí)間：0.3 s。

（2）HPLC。色譜柱：Hamilton PRP-X100柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：5 mmol·L-1檸檬酸溶液，pH=5.0（氨水調(diào)pH值）；流速：

1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：50 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，利用Origin 2021軟件和Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

色譜分離提取樣品中的不同硒形態(tài)化合物，需要破壞大米中蛋白質(zhì)的肽鍵，使其處于游離態(tài)，并保證化合物的完整性，因此確保提取效果的關(guān)鍵在于提取方法的選擇[7]。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，大米中硒形態(tài)的提取方法有水提法、酸提法以及酶提法等[8]。本研究對(duì)比各方法的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用以

75 mmol·L-1 Tris-HCl緩沖液作為提取溶液的酶提法提取的硒形態(tài)化合物相對(duì)較穩(wěn)定，回收率較高。

研究表明，大米中硒的存在形態(tài)以SeMet為主，因此本研究選取小麥粉質(zhì)控樣中SeMet的回收率作為考察指標(biāo)進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。由圖1（a）可知，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，質(zhì)控樣回收率處于較高水平；之后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，質(zhì)控樣回收率變化不大，因此選擇超聲時(shí)間為30 min。

超聲后樣品在37 ℃下進(jìn)行水浴振蕩，不同振蕩時(shí)間下的回收率變化趨勢(shì)見圖1（b）。當(dāng)振蕩時(shí)間為4 h時(shí)，質(zhì)控樣回收率處于較高水平；之后隨著振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)，質(zhì)控樣回收率變化不大，因此選擇振蕩時(shí)間為4 h。

2.2 提取酶種類及加入量的優(yōu)化

本研究在10 mL 75 mmol·L-1 Tris-HCl提取溶液中加入蛋白酶K（記為K）、鏈霉蛋白酶E（記為E）、胰蛋白酶γ（記為γ）以及不同酶組合，考察不同酶組合提取條件下小麥粉質(zhì)控樣的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含有鏈霉蛋白酶E的組合提取條件下，小麥粉質(zhì)控樣的回收率在92%～98%；對(duì)比單一酶提取質(zhì)控樣回收率，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶γ＜蛋白酶K＜鏈霉蛋白酶E[如圖2（a）]?；诖耍疚倪M(jìn)一步考察鏈霉蛋白酶E加入量（10、15、20、25、

30 mg和35 mg）對(duì)質(zhì)控樣回收率的影響，結(jié)果表明當(dāng)鏈霉蛋白酶E加入量為20 mg時(shí)，質(zhì)控樣回收率可達(dá)到98%，繼續(xù)增加鏈霉蛋白酶E用量，質(zhì)控樣回收率變化不大[如圖2（b）]。考慮測(cè)試成本的因素，本研究選用加入20 mg鏈霉蛋白酶E作為提取酶。

2.3 流動(dòng)相和色譜柱優(yōu)化

采用HPLC進(jìn)行硒形態(tài)分離過程中，發(fā)現(xiàn)不同的硒形態(tài)在不同的pH值條件下的分離效果和保留時(shí)間有所差別，當(dāng)提高流動(dòng)相濃度或流動(dòng)相pH值時(shí)，可明顯縮短5種硒形態(tài)出峰時(shí)間，但前3個(gè)峰[SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）]的分離度會(huì)變差；相反，在合適條件下延長(zhǎng)5種形態(tài)出峰時(shí)間，分離度則變好。本研究考察了不同pH值（4、5、6、7）、不同濃度（2、5、10 mmol·L-1）的檸檬酸溶液對(duì)5種

硒形態(tài)的分離情況。結(jié)果表明，選擇pH=5、濃度為5 mmol·L-1的檸檬酸作為流動(dòng)相，既具有良好的分離度，又能有較為適宜的出峰時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了3種陰離子交換色譜柱Hamilton PRP-X100、Thermo IonPac AS19和Thermo IonPac AS7對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，Thermo IonPac AS19色譜柱無法實(shí)現(xiàn)5種硒形態(tài)化合物的有效分離，Thermo IonPac AS7色譜柱測(cè)試分離時(shí)間太長(zhǎng)，Hamilton PRP-X100則能在較短的時(shí)間內(nèi)完成5種硒形態(tài)的分離。

2.4 線性關(guān)系、檢出限

由圖3可知，本方法能夠在15 min內(nèi)完成5種

硒形態(tài)的完全分離，出峰順序依次為SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）。由表1可知，濃度為0.5～200.0 μg·L-1時(shí)，5種硒形態(tài)化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r在0.999 6～

1.000 0。SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）檢出限分別為0.002、0.004、0.005、0.002、

0.001 mg·kg-1。

2.5 精密度與回收率

采用空白海南地區(qū)大米樣品進(jìn)行3個(gè)不同濃度水平（0.025、0.100、0.250 mg·kg-1）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果見表2。5種硒形態(tài)的平均加標(biāo)回收率在79.9%～106.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～5.7%，滿足實(shí)際樣品分析要求，可實(shí)現(xiàn)SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）等

5種硒形態(tài)的準(zhǔn)確測(cè)定。

2.6 樣品測(cè)定

將海南地區(qū)所采集的10批大米樣品經(jīng)前處理研磨成粉，采用本文建立的方法對(duì)其中的硒形態(tài)進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明，有9批大米樣品中只檢出SeMet，SeMet含量為0.007 7～0.025 8 mg·kg-1，未檢出其他硒形態(tài)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符[9]。相較于其他硒形態(tài)，人體對(duì)食物中SeMet的生物利用效率較高[10]，后期可重點(diǎn)對(duì)富硒大米中SeMet的含量和功能進(jìn)行深入研究。

3 結(jié)論

本研究采用HPLC-ICP-MS/MS技術(shù)以O(shè)2作為反應(yīng)池氣體，在硒元素質(zhì)量轉(zhuǎn)移Se（m/z 80＞96）模式下，以Hamilton PRP-X100分析柱，以5 mmol·L-1的檸檬酸溶液（pH=5.0）作為流動(dòng)相，能夠在一次進(jìn)樣中實(shí)現(xiàn)5種硒形態(tài)SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）完全分離和在線測(cè)定。5種硒形態(tài)在0.5～200.0 μg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999 5，檢出限分別為0.002、0.004、0.005、0.002、0.001 mg·kg-1；在0.025、0.100、

0.250 mg·kg-1 3個(gè)加標(biāo)水平下，各硒形態(tài)的加標(biāo)回收率為79.9%～106.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～

5.7%。該方法適用于大米中SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）含量的測(cè)定。

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基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（320QN375）；國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全）課題資助項(xiàng)目（ZZ-2022002）。

作者簡(jiǎn)介：符郁馥（1985—），女，海南文昌人，碩士，高級(jí)工程師。研究方向：食品安全檢測(cè)。

通信作者：谷滿屯（1991—），男，河南信陽人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測(cè)。E-mail： 375552783@qq.com。