固相萃取-氣相色譜法測定焦糖色素中4-甲基咪唑

摘 要：目的：建立固相萃取-氣相色譜法測定焦糖色素中4-甲基咪唑的方法。方法：樣品經(jīng)Chem Elut硅藻土柱凈化富集、二氯甲烷洗脫濃縮，采用DB-1701氣相色譜柱，氫火焰離子化檢測器測定。結(jié)果：4-甲基咪唑在100～500 μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.002 mg·mL-1，平均加標(biāo)回收率在100.2%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～0.5%。結(jié)論：該方法重現(xiàn)性好，操作簡單快速，定量準(zhǔn)確，能夠滿足分析檢測的需求，適合在焦糖色素質(zhì)量控制中使用。

關(guān)鍵詞：4-甲基咪唑；固相萃取；氣相色譜法；焦糖色素

Determination of 4-Methylimidazole in Caramel Pigment by Solid Phase Extraction and Gas Chromatography

CAI Huimin1， CAO Xinjie2*

（1.China Quality Certification Centre， Beijing 100070， China;

2.Beijing Pinggu District Market Supervision and Administration Inspection and Testing Center， Beijing 101200， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of 4-methylimidazole in caramel pigments by solid phase extraction and gas chromatography. Method： The samples were purified and concentrated by Chem Elut diatomite column， eluted and concentrated by dichloromethane， and determined by DB-1701 gas chromatographic column and hydrogen flame ionization detector. Result： 4-methylimidazole had a good linear relationship in the range of 100～500 μg·mL-1， the detection limit was 0.002 mg·mL-1， the average recovery rate was 100.2%～100.7%， and the relative standard deviation was 0.2%～0.5%. Conclusion： The method has good reproducibility， simple and rapid operation， accurate quantification， can meet the needs of analysis and detection， and is suitable for use in caramel color quality control.

Keywords： 4-methylimidazole; solid phase extraction; gas chromatography; caramel pigment

焦糖色素是一種在食品中應(yīng)用范圍十分廣泛的著色劑[1-3]。焦糖色素可以分為天然和人工合成兩大類[4-6]。4-甲基咪唑是以亞硫酸銨為原料生產(chǎn)人工合成焦糖色素的副產(chǎn)物，為含氮雜環(huán)咪唑類化合物[7]。大劑量使用4-甲基咪唑，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物致癌[8]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 焦糖色》（GB 1886.64—

2015）中規(guī)定，以氨法焦糖和亞硫酸銨法合成的焦糖色素中的4-甲基咪唑含量不得超過200 mg·kg-1[9]。而這兩類焦糖色素普遍應(yīng)用在醬油、醋、料酒、啤酒、碳酸飲料和茶類飲料中[10-11]。因此，準(zhǔn)確快速地測定焦糖色素中的4-甲基咪唑具有十分重要的意義。

目前，國內(nèi)外普遍使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定4-甲基咪唑[12]。本研究擬采用固相萃取-氣相色譜法檢測焦糖色素中的4-甲基咪唑，建立一種重現(xiàn)性好、簡單、快速、準(zhǔn)確地測定焦糖色素中4-甲基咪唑的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

焦糖色素，市售。

二氯甲烷；三氯甲烷；丙酮；乙腈（色譜純）；氫氧化鈉（3 mol·L-1）；Chem Elut硅藻土柱；4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.E 99.06%）。

Agilent 7890氣相色譜儀，美國安捷倫科技公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氣相色譜分析條件

色譜柱為DB-1701毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，

0.25 μm）。升溫程序：初始溫度為70 ℃，以

10 ℃·min-1升至170 ℃并保持3 min，再以

20 ℃·min-1升至280 ℃。進(jìn)樣口和檢測器溫度分別為250 ℃和280 ℃。使用氫氣流量為40 mL·min-1，空氣流量為350 mL·min-1，氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為

1.0 mL·min-1。采用分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣體積為1 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg·mL-1）：稱取50.0 mg 4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL容量瓶中，用少量丙酮，冷藏保存，有效期為12個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作液：將4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用丙酮稀釋至

100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1和500 μg·mL-1。

1.2.3 樣品前處理

稱取5.00 g焦糖色素，加入2.5 mL氫氧化鈉溶液混勻，轉(zhuǎn)移至硅藻土柱。用二氯甲烷清洗燒杯并轉(zhuǎn)移至柱中，靜置10 min。收集50 mL洗脫液，濃縮至2 mL后移入5 mL容量瓶，用丙酮洗滌并定容至刻度，混勻備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的優(yōu)化

本研究考察HP-INNOWAX、HP-5MS、DB-1701

3種色譜柱對(duì)4-甲基咪唑峰型的影響。結(jié)果表明，HP-INNOWAX和HP-5MS色譜柱的響應(yīng)高但拖尾嚴(yán)重，峰形差。而DB" -1701色譜柱的基線平穩(wěn)，響應(yīng)值高，分離效果和峰型良好。

2.2 洗脫劑的選擇

在空白樣品中加入4-甲基咪唑（100 mg·kg-1），制備樣品S1，并優(yōu)化前處理方法。使用50 mL不同洗脫劑（二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮和乙腈）進(jìn)行洗脫，以回收率評(píng)估效果。樣品的回收率不宜過高，否則可能會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。由表1可知，二氯甲烷的洗脫效果最佳，回收率為101.1%，精密度較高。綜合考慮，選擇二氯甲烷作為最終洗脫溶劑。

2.3 洗脫劑用量的優(yōu)化

研究考察不同洗脫劑用量（10 mL、20 mL、

50 mL、80 mL和100 mL）對(duì)4-甲基咪唑回收率的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。由表2可知，隨著洗脫劑用量的增加，4-甲基咪唑的回收率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這可能是由于雜質(zhì)增多導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮精密度、節(jié)約試劑和檢測效率，本研究選擇洗脫劑體積為50 mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行上機(jī)測定，以4-甲基咪唑的濃度為橫坐標(biāo)，以4-甲基咪唑的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，4-甲基咪唑的線性回歸方程為y=3.101 98×10-1x-1.292 98，R2=0.999 9。當(dāng)信噪比為3時(shí)，4-甲基咪唑的檢出限為0.002 mg·mL-1。

2.5 回收率及精密度

在空白樣品中分別添加50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和500 mg·kg-1的4-甲基咪唑，根據(jù)1.2.3的前處理方法和1.2.1的氣相色譜分析條件進(jìn)行檢測，平行測定3次，計(jì)算4-甲基咪唑的回收率及精密度。回收率以及精密度結(jié)果見表3。

2.6 樣品測定

取市售焦糖色素樣品3份，分別根據(jù)1.2.3的前處理方法和1.2.1的氣相色譜分析條件進(jìn)行檢測，平行測定3次，分別計(jì)算4-甲基咪唑的含量。由表4可知，3份市售焦糖色素樣品都含有較高含量的4-甲基咪唑，但都不超過GB 1886.64—2015中規(guī)定的含量要求（200 mg·kg-1）。

3 結(jié)論

本文開發(fā)了一種使用Chem Elut硅藻土柱和二氯甲烷洗脫的前處理技術(shù)，結(jié)合氣相色譜-氫火焰離子化檢測器來檢測焦糖色素中的4-甲基咪唑。結(jié)果顯示，該方法具有良好的重現(xiàn)性、操作簡便、快速且定量準(zhǔn)確，能夠滿足分析檢測要求，并適用于焦糖色素的質(zhì)量控制。此技術(shù)可廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)現(xiàn)場，為人工合成焦糖色素的質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]林曉珊，杭義萍，吳惠勤，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[J].分析試驗(yàn)室，2011，30（11）：85-88.

[2]SHIH Y H，LIRIO S，LI C K，et al.Determination of imidazole derivatives by micellar electrokinetic chromatography combined with solidphase microextraction using activated carbon-polymer monolith as adsorbent[J].J Chromatogr A，2016，1428：336-345.

[3]PETRUCI J F S，PEREIRA E A，CARDOSO A A.Determination of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in caramel colors by capillary electrophoresis[J].J Agr Food Chem，2013，61（9）：2263-2267.

[4]孟穎.焦糖色素著色食品中甲基咪唑測定方法的研究及應(yīng)用[D].太原：山西大學(xué)，2014.

[5]XU X B，LIU D B，YU S J，et al.Separation and determination of 4-methylimidazole， 2-methylimidazole and 5-hydroxymethylfurfural in beverages by amino trap column coupled with pulsed amperometric detection[J].Food Chem，2015，169：224-229.

[6]王淼，陳海珍.高效液相色譜法測定焦糖中4-甲基咪唑的含量[J].中國處方藥，2015，13（10）：

25-26.

[7]吳翠華，鄭學(xué)殷，李巧琪，等.QuEChERS結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定醬油中的4-甲基咪唑[J].當(dāng)代化工，2018，47（3）：653-656.

[8]MORITA T，UNEYAMA C.Genotoxicity assessment of 4-methylimidazole：regulatory perspectives[J].Genes Environ，2016，38（1）：20.

[9]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 焦糖色：GB 1866.64—2015[S/OL].（2015-11-13）[2024-10-22].http：//down.foodmate.net/standard/yulan.php？itemid=48439.

[10]李美玲，王卓琳，黎慶濤，等.焦糖色素及其研究進(jìn)展[J].中國調(diào)味品，2019，44（9）：183-187.

[11]龐美蓉，林欽，戴明，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同步檢測食品中的2-甲基咪唑及4-甲基咪唑[J].分析測試學(xué)報(bào)，2016，35（8）：943-948.

[12]王愛軍.氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定焦糖色中4-甲基咪唑[J].食品工業(yè)，2019，40（7）：321-323.

作者簡介：蔡慧敏（1991—），女，內(nèi)蒙古鄂爾多斯人，碩士，工程師。研究方向：食品安全分析。

通信作者：曹新杰（1988—），女，北京人，碩士，工程師。研究方向：食品加工與安全。E-mail： 729858032@qq.com。