青城山老臘肉溶酪大球菌的篩選及其對(duì)臘肉品質(zhì)的影響

摘要：以青城山老臘肉為研究對(duì)象，從中分離并篩選出具有優(yōu)秀發(fā)酵潛力的溶酪大球菌，同時(shí)研究該菌株對(duì)傳統(tǒng)臘肉發(fā)酵過(guò)程中品質(zhì)及蛋白質(zhì)降解的影響。首先，基于功能性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，評(píng)判初篩菌株的產(chǎn)蛋白酶能力。其次，對(duì)產(chǎn)蛋白酶菌株進(jìn)行安全性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和分子生物學(xué)鑒定。最后，將篩選出的溶酪大球菌作為發(fā)酵劑，以低（10⁶ CFU/g）、中（10⁷ CFU/g）、高（10⁸ CFU/g）3個(gè)濃度接種臘肉，以探究溶酪大球菌對(duì)臘肉品質(zhì)和蛋白質(zhì)降解的影響。分離出100株葡萄球菌，對(duì)60株產(chǎn)蛋白酶菌株進(jìn)行安全性驗(yàn)證，共篩選出15株產(chǎn)蛋白酶及安全性實(shí)驗(yàn)呈陰性的菌株，對(duì)這15株葡萄球菌進(jìn)行16S rDNA同源性對(duì)比鑒定，將同源性最高的菌株命名為溶酪大球菌。與自然發(fā)酵組相比，接種溶酪大球菌的臘肉具有較高的pH、紅度值、黃度值和羰基值，較低的水分含量和巰基值。接種溶酪大球菌能顯著改善臘肉的品質(zhì)特性，同時(shí)能顯著促進(jìn)臘肉蛋白質(zhì)的降解，有助于改善臘肉的風(fēng)味，具有潛在的風(fēng)味改善能力。該研究為接種發(fā)酵改善臘肉品質(zhì)特性提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：分離篩選；臘肉；溶酪大球菌；接種發(fā)酵；品質(zhì)特性

中圖分類號(hào)：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）01-0099-08

Screening of Macrococcus caseolyticus from Chinese Qingcheng Mountain Traditional Bacon and Its Effect on Quality of Bacon

ZHAO Zhi-ping¹， MO Xiao-qin¹， ZHANG Yu-lin¹， WANG Xin-yi¹， JIA Xiao-han^1，2， CHEN Hong-fan^1，2， LIU Da-yu¹， NIE Xin^2*

（1.Key Laboratory of Meat Processing in Sichuan Province， College of Food and Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China; 2.College of Culinary and Food Science Engineering， Sichuan Tourism University， Chengdu 610100， China）

Abstract： With Chinese Qingcheng Mountain traditional bacon （CQTB） as the research object， Macrococcus caseolyticus with excellent fermentation potential is isolated and screened from it， and the effects of the strain on the quality and protein degradation during the fermentation of CQTB are studied. Firstly， based on functional verification experiment， the protease-producing ability of the selected strain is evaluated. Secondly， the safety experiment verification and molecular biology identification of the protease-producing strain are conducted. Finally， the screened Macrococcus caseolyticus is used as the fermentation agent to inoculate bacon at three concentrations： low （10⁶ CFU/g）， medium （10⁷ CFU/g） and high （10⁸ CFU/g）， in order to investigate the effects of Macrococcus caseolyticus on the quality of bacon and the degradation of protein. 100 strains of Staphylococcus are isolated， and 60 protease-producing strains are subjected to safety verification. A total of 15 protease-producing strains which are negative in safety experiment are screened. The 16S rDNA homology of the 15 strains of Staphylococcus is compared and identified， and the strain with the highest homology is named Macrococcus caseolyticus. Compared with the naturally fermented group， the bacon inoculated with Macrococcus caseolyticus has higher pH， redness value， yellowness value and carbonyl value， as well as lower moisture content and sulfhydryl value. Inoculating Macrococcus caseolyticus could significantly improve the quality characteristics of bacon， and significantly promote the degradation of protein in bacon at the same time， which contributes to the improvement of the flavor of bacon， indicating that Macrococcus caseolyticus has the potential ability to improve flavor. This study has provided a certain theoretical basis for improving the quality characteristics of bacon through inoculated fermentation

Key words： isolation and screening; bacon; Macrococcus caseolyticus; inoculated fermentation; quality characteristics

收稿日期：2024-08-19

基金項(xiàng)目：四川省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2023YFN0014）；川菜工業(yè)化四川省高等學(xué)校工程研究中心開(kāi)放基金（GCZX22-01）；烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（PRKX2022Z05）；四川旅游學(xué)院博士訓(xùn)練營(yíng)專項(xiàng)科研基金（2023CTUBSZD05）；四川旅游學(xué)院川味預(yù)制菜與營(yíng)養(yǎng)功能開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（22SCTUTP01）

作者簡(jiǎn)介：趙志平（1981—），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向：肉類食品加工與安全。

*通信作者：聶鑫（1985—），女，副研究員，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

中國(guó)臘肉是中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵肉制品之一，是以豬肉等動(dòng)物肉類為原料，經(jīng)腌制、風(fēng)干、發(fā)酵等一系列工序制作而成的一種非即食肉制品^[1]。中國(guó)臘肉的制作歷史悠久，具有咸香味濃、肉質(zhì)緊實(shí)、色澤清亮、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，在四川、湖南、貴州等地頗受推崇^[2]。在中國(guó)臘肉的發(fā)酵過(guò)程中，微生物代謝產(chǎn)生的脂、蛋白酶和過(guò)氧化氫酶等活性成分會(huì)導(dǎo)致臘肉中的脂肪和蛋白質(zhì)水解，形成脂肪酸、小分子肽、游離氨基酸等風(fēng)味前體物質(zhì)^[3]。

中國(guó)市場(chǎng)上腌臘肉制品的發(fā)酵方式多以傳統(tǒng)發(fā)酵為主。這類肉制品中的微生物在自然條件下發(fā)酵代謝，發(fā)酵受地區(qū)和氣候因素影響，難以進(jìn)行精準(zhǔn)控制。此外，自然發(fā)酵易受雜菌污染，導(dǎo)致臘肉品質(zhì)參差不齊，貨架期不穩(wěn)定，具有潛在的質(zhì)量和安全隱患^[4]。微生物在腌臘肉生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，如葡萄球菌通過(guò)調(diào)節(jié)和平衡谷氨酸、賴氨酸和丙氨酸等關(guān)鍵FAAs的水平來(lái)塑造熏肉的風(fēng)味^[5]。發(fā)酵肉制品中的微生物主要包括乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌和微球菌^[6]。這些微生物作為發(fā)酵劑在腌制肉制品中得到較廣泛的應(yīng)用，Zhang等^[6]將傳統(tǒng)酸肉中分離出的彎曲乳桿菌LAB26和戊酸乳球菌SWU73571制備成混合發(fā)酵劑并用于酸肉的加工，顯著提高了發(fā)酵酸肉的質(zhì)量和安全性。Xiao等^[7]研究了植物乳桿菌R2和木糖葡萄球菌A2接種后對(duì)中國(guó)干發(fā)酵香腸微生物群落、脂肪分解、蛋白水解和揮發(fā)性物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，接種發(fā)酵劑顯著促進(jìn)了游離脂肪酸的釋放，并對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)有顯著的改善作用。

在中國(guó)臘肉的自然發(fā)酵過(guò)程中，明確本土核心微生物與發(fā)酵品質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。微生物發(fā)酵劑可以增強(qiáng)臘肉的風(fēng)味并縮短發(fā)酵時(shí)間，提取肉制品中的本土微生物作為肉制品發(fā)酵劑有助于提高肉制品的綠色加工水平，并對(duì)肉制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。目前，葡萄球菌屬在臘肉品質(zhì)改善中的應(yīng)用較廣泛，但是菌株應(yīng)用較單一，多為肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌等常見(jiàn)菌屬^[8-9]。本研究以四川青城山老臘肉為原料，對(duì)其中的發(fā)酵微生物進(jìn)行篩選、分離、純化，并進(jìn)行生物學(xué)鑒定和發(fā)酵特性研究，首次篩選出具有高蛋白酶活性、無(wú)致病性的溶酪大球菌并進(jìn)行臘肉發(fā)酵特性的研究，擬為中國(guó)傳統(tǒng)肉制品發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)以及工業(yè)化應(yīng)用提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青城山老臘肉：四川省都江堰市青城山趙氏老臘肉；新鮮豬后腿肉：成都市龍泉驛區(qū)十陵街道好樂(lè)購(gòu)超市；脫脂奶粉（生物試劑）：碧云天生物技術(shù)有限公司；三丁酸甘油酯：山東拓普生物工程有限公司；凍干兔血漿、DNA酶瓊脂（均為生物試劑）：青島海博生物技術(shù)有限公司；L-組氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸（均為生物試劑）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；溴甲酚紫（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCA224i-1OCN型賽多利斯萬(wàn)分之一天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GHT-DDC型超凈工作臺(tái) 濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠；GR60DA型高壓蒸汽滅菌鍋 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HD-SYC型水浴恒溫振蕩器 湖南昊德儀器設(shè)備有限公司；3730XL型測(cè)序儀、2720 Thermal Cycler型PCR儀 愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司；5810R型板式離心機(jī) 艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司；JY04S-3C型凝膠成像裝置、JY300C Power Supply型電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Testo 205型pH計(jì) 德圖儀表（深圳）有限公司；CR-10型色差儀 柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；HD-5型智能水分活度測(cè)量?jī)x 無(wú)錫市華科儀器儀表有限公司；Multiskan SkyHigh型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Sorvall X1 Pro型離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶酪大球菌的分離

在無(wú)菌條件下取25 g青城山老臘肉，將其剪碎成顆粒，放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL 0.9%無(wú)菌生理鹽水，并放入無(wú)菌均質(zhì)器中拍打5 min，得到稀釋度為10^－1的樣品液，取100μL樣品液加入盛有900μL無(wú)菌生理鹽水的1.5 mL無(wú)菌離心管中，繼續(xù)此操作將樣品稀釋至10^－3，10^－4梯度。將樣品稀釋液涂布于甘露醇培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)48 h，獲得具有單菌落的葡萄球菌平板。

1.3.2 蛋白酶活性的測(cè)定

將篩選得到的純菌落接種于蛋白酶培養(yǎng)基，在30℃下培養(yǎng)3 d。觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，以確定是否具有蛋白酶活性。

1.3.3 凝固酶的檢測(cè)

將篩選得到的純菌活化培養(yǎng)，取500μL活化2代的菌液，加入到凍干兔血漿中（菌液與生理鹽水體積比為1∶1），混勻后于37℃倒置培養(yǎng)6 h，每30 min觀察一次。若凝固體積大于50%，判定為凝固酶陽(yáng)性；無(wú)凝固或凝固體積小于50%判定為陰性。

1.3.4 DNA酶的檢測(cè)

將篩選得到的純菌落活化培養(yǎng)，取活化2代的菌液，劃線接種于DNA酶培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基表面滴加1 mol/L的鹽酸。若在菌落周圍生成明顯透明環(huán)，表示該菌株具有DNA酶活性，則判定該菌株DNA酶呈陽(yáng)性。

1.3.5 氨基酸脫羧酶的檢測(cè)

將分離純化培養(yǎng)的純菌落分別接種于L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)基顏色變化，若變成紫色則氨基酸脫羧酶為陽(yáng)性，變?yōu)辄S色則為陰性。

1.3.6 葡萄球菌的鑒定

使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit D5625-01試劑盒對(duì)青城山老臘肉中總DNA進(jìn)行提取，以細(xì)菌的基因組DNA為模板，使用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取2μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。最后將測(cè)序結(jié)果經(jīng)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)。

1.3.7 發(fā)酵劑的制備

將分離得到的溶酪大球菌的單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后以2%的比例將菌懸液接種至新的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 h，此時(shí)菌株處于穩(wěn)定期。以10^－3，10^－4，10^－5，10^－6，10^－7，10^－8 CFU/g梯度稀釋菌懸液后涂布于甘露醇培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)36 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。在600 nm波長(zhǎng)處，通過(guò)涂板計(jì)算對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)，以10⁶，10⁷，10⁸ CFU/g為接種量計(jì)算需要加入的菌液體積，低、中濃度接種組（10⁶，10⁷ CFU/g）添加生理鹽水以保證與高濃度接種組（10⁸ CFU/g）體積一致。

1.3.8 接種溶酪大球菌臘肉的制作

制作臘肉輔料：食鹽（3.5%）、白砂糖（1.5%）、醬油（4%）、花椒粉（0.5%）和辣椒粉（0.75%）。取新鮮豬后腿肉，將菌液均勻地噴至肉表面且不斷翻轉(zhuǎn)以保證菌液能更好地滲透進(jìn)肉的內(nèi)層，以不添加菌液的樣品為對(duì)照。待配料和菌液與肉混合完成后，將肉樣于常溫干燥的環(huán)境下腌制4 d，每天早、晚各翻轉(zhuǎn)一次，以確保腌制充分。腌制結(jié)束后，將臘肉于自然條件下風(fēng)干14 d即為成熟期臘肉。取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)為腌制前期（0 d）、腌制末期（4 d）、風(fēng)干中期（11 d）和成熟期（18 d）。定義接種溶酪大球菌為MA組，其中接種量10⁶，10⁷，10⁸ CFU/g的組別分別為MA-低、MA-中、MA-高組。

1.3.9 微生物分析

菌落總數(shù)參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。葡萄球菌數(shù)參考GB 4789.10—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.10 水分活度、水分含量和pH

水分活度：將待測(cè)臘肉樣品切碎后均勻鋪滿測(cè)量皿，以飽和氯化鈉溶液校準(zhǔn)后經(jīng)水分活度儀直接測(cè)定。

水分含量：采用GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法測(cè)定。

pH：采用插入式pH計(jì)經(jīng)堿水校準(zhǔn)后直接測(cè)定。

1.3.11 臘肉的色度

將色差儀進(jìn)行空白板校準(zhǔn)后直接進(jìn)行測(cè)定。

1.3.12 羰基和總巰基

羰基：精確稱取0.1 g臘肉于離心管中，加入0.9 mL 0.9%生理鹽水，在4℃、2 500 r/min條件下離心10 min，取0.45 mL上清液與0.05 mL生理鹽水混勻，11 000 r/min離心10 min。取上清液，以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定^[10]。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，參照Levine等^[11]和馮鈺敏等^[12]的方法：取0.1 mL上清液與0.4 mL 2，4-二硝基苯肼的鹽酸胍溶液混合，于37℃陰暗處反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，12 000 r/min離心10 min，取1 mL無(wú)水乙醇-乙酸乙酯溶液（體積比1∶1）反復(fù)洗滌蛋白沉淀直至黃色全部消失，加入1.2 mL鹽酸胍溶液后于37℃下水浴15 min，渦旋振蕩使沉淀完全溶解，12 000 r/min離心15 min，取上清液于370 nm處測(cè)定吸光度，并做空白對(duì)照。

總巰基：參照Park等^[13]的方法提取肌原纖維蛋白，依據(jù)盧驍?shù)?sup>[14]的方法并稍作改進(jìn)，測(cè)定總巰基的含量，具體步驟：結(jié)合蛋白濃度，以20 mmol/L磷酸鹽緩沖液與0.6 mol/L NaCl溶液將肌原纖維蛋白濃度調(diào)整為2 mg/mL。取1 mL經(jīng)調(diào)整后的肌原纖維蛋白溶液，加入9 mL緩沖液（8 mol/L尿素、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA，pH 7.0），隨后加入0.4 mL 1 g/L Ellman溶液，混勻后在40℃下反應(yīng)25 min，于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各指標(biāo)顯著性通過(guò)IBM SPSS Statistics 27可視化分析，并使用Origin 2023繪制柱狀圖和折線圖。通過(guò)MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶酪大球菌的篩選

2.1.1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選

對(duì)初步篩選的100株菌株進(jìn)行蛋白酶活性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1中A，其中有60株菌株能夠產(chǎn)蛋白酶以分解蛋白質(zhì)，形成透明圈，且透明圈直徑大多數(shù)達(dá)到1.5 cm以上。參照馬咸瑩等^[15]的方法，以透明圈的直徑與待測(cè)球菌菌落直徑的比值作為評(píng)判球菌蛋白酶高低的標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)對(duì)比研究，確定更適合用作發(fā)酵劑的菌株。

2.1.2 凝固酶陰性葡萄球菌的篩選

凝固酶是判斷葡萄球菌有無(wú)致病性的一個(gè)重要指標(biāo)，凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CNS）廣泛存在于發(fā)酵肉制品中，CNS常被用作功能性發(fā)酵劑^[16]，CNS對(duì)產(chǎn)品顏色的形成、防止酸敗以及影響香氣的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成有關(guān)鍵作用^[17]。對(duì)產(chǎn)蛋白酶的菌株進(jìn)行凝固酶實(shí)驗(yàn)，60株菌株均呈凝固酶陰性。

2.1.3 DNA酶陰性葡萄球菌的篩選

對(duì)60株凝固酶陰性菌株進(jìn)行DNA酶實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)DNA酶的菌株可使長(zhǎng)鏈DNA水解成寡核苷酸鏈，長(zhǎng)鏈DNA會(huì)被酸沉淀，寡核苷酸可溶于酸，在平板上加入鹽酸后，菌落周圍會(huì)出現(xiàn)透明環(huán)，見(jiàn)圖1中B。60株菌中有15株菌（7號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、14號(hào)、23號(hào)、36號(hào)、47號(hào)、52號(hào)、53號(hào)、54號(hào)、77號(hào)、78號(hào)、84號(hào)、87號(hào)和92號(hào)）呈DNA酶陽(yáng)性，其他菌株呈DNA酶陰性。

2.1.4 氨基酸脫羧酶陰性葡萄球菌的篩選

菌株分泌的氨基酸脫羧酶代謝氨基酸會(huì)產(chǎn)生生物胺^[18]，若人體攝入食品中生物胺含量較高，將很難被小腸黏膜內(nèi)的胺氧化分解代謝，從而對(duì)人體健康造成損傷^[19]。本研究主要選取了L-組氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸3種氨基酸進(jìn)行氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)。對(duì)45株DNA酶呈陰性的菌株進(jìn)行氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，共篩選出15株氨基酸脫羧酶呈陰性的菌株。

2.1.5 菌種鑒定和生長(zhǎng)曲線測(cè)定

使用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)待測(cè)菌株以及經(jīng)NCBI比對(duì)下的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖2中A，其中65號(hào)菌株與Macrococcus caseolyticus subsp. hominis strain CCM 7927 16S ribosomal RNA complete sequence同源性最高，因此被鑒定為溶酪大球菌（MA）菌株，命名為Macrococcus caseolyticus S1。對(duì)分離自本土肉制品中的細(xì)菌，通常在進(jìn)行功能性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)前需測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。在對(duì)數(shù)期內(nèi)，細(xì)菌呈幾何倍數(shù)增長(zhǎng)，此階段細(xì)菌的形態(tài)、大小以及生理活性都十分典型，細(xì)菌的鑒定通常選用此階段。穩(wěn)定期由于細(xì)菌代謝產(chǎn)物堆積以及pH下降，使得細(xì)菌增殖速度減慢，且死亡數(shù)目逐漸上升，細(xì)菌的增殖數(shù)目與死亡數(shù)目趨于動(dòng)態(tài)平衡。衰亡期的細(xì)菌增殖減慢或停止，死亡數(shù)超過(guò)活菌數(shù)，此階段細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)菌變長(zhǎng)、扭曲和發(fā)生畸形等，細(xì)菌代謝活動(dòng)停滯。由圖2中B可知，溶酪大球菌在0～1 h內(nèi)增長(zhǎng)較平緩，在2～13 h內(nèi)迅速增長(zhǎng)，此時(shí)處于對(duì)數(shù)期，溶酪大球菌在13 h后處于穩(wěn)定期。

2.2 微生物分析

臘肉各加工階段菌落總數(shù)見(jiàn)圖3中A，菌落總數(shù)先上升后下降。0 d時(shí)，添加MA使得菌落總數(shù)顯著高于自然發(fā)酵組。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，MA-中和MA-高組菌落總數(shù)均顯著高于自然發(fā)酵組，MA-低組比自然發(fā)酵組低，這可能是由于添加中、高濃度的MA具有數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，與其他微生物在腌制過(guò)程的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)中占據(jù)了主導(dǎo)地位^[20]。4～11 d階段添加MA組下降，而自然發(fā)酵組上升，這可能是由于添加MA作為優(yōu)勢(shì)菌抑制了雜菌的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，以溶酪大球菌為發(fā)酵劑可顯著提升臘肉的菌落總數(shù)。

臘肉各加工階段球菌數(shù)量見(jiàn)圖3中B，隨著發(fā)酵的進(jìn)行球菌數(shù)量先上升后下降。0 d時(shí)，添加MA的3個(gè)處理組球菌數(shù)量顯著高于自然發(fā)酵組。0～4 d時(shí)，球菌數(shù)量快速增長(zhǎng)。進(jìn)入風(fēng)干期后，球菌數(shù)量下降，可能是由于水分的散失和可發(fā)酵底物的消耗不利于葡萄球菌的生長(zhǎng)，使得葡萄球菌數(shù)量減少。

2.3 水分和pH

水分含量變化見(jiàn)圖4中A，0 d時(shí)，各組無(wú)顯著差異，4 d時(shí)，添加MA各組均顯著低于自然發(fā)酵組，可能是MA消耗水分導(dǎo)致含量偏低。18 d時(shí)，MA-高組水分含量顯著低于自然發(fā)酵組，這可能是由于MA產(chǎn)生的蛋白酶具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解能力，而蛋白質(zhì)是一類具有較強(qiáng)持水能力的大分子^[21]。并且保持較低的水分含量更有利于抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)^[6]。水分活度（Aw）的變化見(jiàn)圖4中B，Aw與水分含量表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。腌制初期，由于MA代謝活動(dòng)較弱，各組Aw無(wú)顯著性差異。4 d時(shí)，MA-中和MA-高組Aw顯著低于自然發(fā)酵組和MA-低組，可能是MA代謝產(chǎn)酸后游離出大量自由水，自由水?dāng)U散速率增加，使Aw降低。進(jìn)入風(fēng)干期之后，游離水和結(jié)合水散失，Aw下降。

臘肉各加工階段pH的變化見(jiàn)圖4中C。0 d時(shí)，由于添加的MA代謝活動(dòng)較弱，各組間pH無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。4 d時(shí)，pH下降，MA-中和MA-高組均顯著低于自然發(fā)酵組（P＜0.05），這可能是由于作為發(fā)酵劑的MA在腌制過(guò)程中通過(guò)代謝作用利用臘肉中的碳水化合物形成有機(jī)酸，其中乳酸的過(guò)度積累使得中、高濃度組pH下降程度更大^[22]。11 d時(shí)，各組pH逐漸回升，11 d和18 d時(shí)，MA-中和MA-高組pH均顯著高于其他組（P＜0.05）。在上述球菌篩選實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)分離出的MA具有產(chǎn)蛋白酶的能力，根據(jù)之前的研究推測(cè)，MA雖能通過(guò)產(chǎn)蛋白酶從而分解蛋白質(zhì)以產(chǎn)生氨基酸，但脫氨反應(yīng)也同時(shí)進(jìn)行，堿性物質(zhì)的生成速率大于產(chǎn)酸物質(zhì)的生成速率，同時(shí)伴隨著水分的流失^[23-24]，這可能是MA-中和MA-高組pH顯著高于自然發(fā)酵組的原因。

2.4 臘肉的色度

臘肉加工過(guò)程中L^*值的變化見(jiàn)圖5中A。L^*值先上升后下降。0 d時(shí)，各組L^*值均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），4 d時(shí)，MA-中和MA-高組的L^*值均顯著高于自然發(fā)酵組（P＜0.05），可能是添加的MA代謝活動(dòng)較強(qiáng)。11 d時(shí)，風(fēng)干1周后，水分散失，使臘肉表面對(duì)光的折射強(qiáng)度減弱，導(dǎo)致L^*值下降。18 d時(shí)，MA-高組臘肉L^*值顯著低于自然發(fā)酵組（P＜0.05），這可能是由于高濃度的MA代謝活動(dòng)會(huì)加快臘肉中水分的損失速率，導(dǎo)致L^*值偏低。

臘肉加工過(guò)程中a^*值的變化見(jiàn)圖5中B。a^*值先上升后下降。在0 d時(shí)，由于添加的MA代謝活動(dòng)較弱，各組a^*值無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。4 d時(shí)，MA-低組與自然發(fā)酵組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但MA-中和MA-高組均顯著高于自然發(fā)酵組（P＜0.05），這可能是由于在腌制過(guò)程中MA-中組和MA-高組代謝產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，將臘肉中的亞硝酸鹽還原成NO后，與肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白。但本研究在制作臘肉過(guò)程中未添加亞硝酸鹽，在腌制期內(nèi)a^*值存在顯著性差異，可能是MA具有表達(dá)NO合成酶的基因序列，致使一氧化氮合成酶在有氧合NADPH的情況下利用L-精氨酸的胍基氮合成NO^[25]，隨后與肌紅蛋白結(jié)合生成亞硝基肌紅蛋白以達(dá)到護(hù)色效果。進(jìn)入風(fēng)干期后（11 d），a^*值持續(xù)下降，可能是隨著水分含量的減少，色素不斷濃縮，使a^*值下降。

臘肉加工過(guò)程中b^*值的變化見(jiàn)圖5中C。b^*值先上升后下降，在0 d時(shí)，所有組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），4 d時(shí)添加MA組均顯著高于自然發(fā)酵組（P＜0.05），但在11 d和18 d時(shí)，MA-高組b^*值顯著低于自然發(fā)酵組，這可能是由微生物作用下的氧氣消耗和氧合肌紅蛋白的減少引起的。

此外，添加MA濃度越高，a^*值和b^*值在風(fēng)干期（11 d和18 d）下降得越快。這是因?yàn)樾柩跷⑸飻?shù)量增加，臘肉發(fā)酵過(guò)程中過(guò)多的需氧微生物會(huì)消耗臘肉表面的氧氣，從而降低氧合肌紅蛋白向高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化的速度^[26]。

2.5 羰基和總巰基

蛋白質(zhì)羰基含量是評(píng)估肉類和肉制品中蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)^[27]，羰基含量越高表明臘肉中蛋白質(zhì)氧化程度越高^[28]。臘肉加工過(guò)程中羰基含量變化見(jiàn)圖6中A。0 d時(shí)各組羰基含量無(wú)顯著性差異（P＜0.05），到4，11，18 d時(shí)，添加MA組顯著高于自然發(fā)酵組（P＜0.05），表明MA產(chǎn)生的蛋白酶可有效分解蛋白質(zhì)，同時(shí)羰基自由基被氧化，使肽鏈羰基含量上升^[29]。羰基含量變化趨勢(shì)表明，臘肉加工過(guò)程中羰基含量逐漸升高，MA可顯著提高臘肉各加工階段的羰基含量。

總巰基含量可反映肉類和肉制品中的蛋白質(zhì)氧化程度?？値€基含量變化見(jiàn)圖6中B。0 d時(shí)，各組總巰基含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），隨著加工過(guò)程的推進(jìn)，添加MA組顯著低于自然發(fā)酵組，產(chǎn)生的蛋白酶加劇了蛋白質(zhì)間的水解反應(yīng)，同時(shí)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，使得巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵或者氧化成磺酸、亞磺酸和次磺酸^[30]。

3 結(jié)論

本研究將青城山臘肉中分離出的MA以不同濃度接種到臘肉中，添加MA組顯著降低了臘肉的水分含量、色度和巰基含量，顯著增加了臘肉的pH和羰基含量，對(duì)臘肉的水分活度無(wú)顯著影響。添加MA組羰基含量隨著加工的進(jìn)行顯著升高，總巰基含量顯著降低，說(shuō)明MA作為發(fā)酵劑可以產(chǎn)生蛋白酶以分解蛋白質(zhì)。菌落總數(shù)和球菌數(shù)量變化趨勢(shì)表明，添加MA改變了臘肉加工過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)，各加工階段中、高濃度MA組菌落總數(shù)及球菌數(shù)量高于自然發(fā)酵組。MA在臘肉發(fā)酵中表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，它不僅能提高臘肉的發(fā)酵效率和食品安全性，而且具有改善臘肉風(fēng)味和品質(zhì)的潛在特性，在未來(lái)發(fā)酵臘肉的工業(yè)化體系中，使用MA可能帶來(lái)更高的質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益，后續(xù)將進(jìn)行更多關(guān)于MA對(duì)臘肉風(fēng)味影響的研究，并對(duì)其可實(shí)用性進(jìn)行綜合評(píng)估。

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