枇杷核水提物的體外活性及人體美白功效研究

[摘要]目的：探討枇杷核水提物的體外活性、對(duì)人體皮膚美白的功效及安全性。方法：通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）自由基清除實(shí)驗(yàn)、小鼠黑素瘤B16細(xì)胞活性、黑色素含量以及酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)，考察枇杷核水提物的體外抗氧化、美白作用；選取色素沉著斑志愿者30例，隨機(jī)選擇一側(cè)半臉為枇杷核水提物治療組，另側(cè)半臉為陰性對(duì)照組。比較治療8周后皮膚個(gè)體類型角（Individual type angle，ITA°）、皮膚黑色素（MI）指標(biāo)。結(jié)果：枇杷核水提物可清除DPPH和ABTS自由基，半抑制濃度（IC50）值分別是7.98 mg/ml和1.11 mg/ml，在2.5～100 mg/ml濃度對(duì)小鼠B16細(xì)胞活力無影響，能減少細(xì)胞黑色素生成及抑制酪氨酸酶活性。人體美白功效試驗(yàn)：治療組治療8周后ITA°[（34.02±7.03）]高于治療前[（27.07±5.89）]，治療8周后MI[（162.7±40.20）]低于治療前[（162.7±40.20）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組治療后ITA°和MI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：枇杷核水提物有良好的體外抗氧化、抑制黑色素生成、酪氨酸酶活性作用且無明顯細(xì)胞毒性。人體試驗(yàn)顯示有美白作用且無不良反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]枇杷核水提物；體外活性；人體功效；美白；功效研究

[中圖分類號(hào)]R285" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號(hào)]1008-6455（2025）01-0010-05

Study on the in Vitro Activity and Human Whitening Effect of Loquat Seed Water Extract

ZHOU Lanhua1， LI Yihong2， ZHAO Rui1， SUN Yuhan2， ZHANG Meina1， YUAN Zhenshuang2，

ZHU Xichun1， LIU Wei3， HUANG Jianmei2

（ 1.Department of Dermatology， Beijing Jingcheng Dermatology Hospital， Beijing 100101， China; 2.Faculty of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China; 3. Department of Dermatology， Air Force Medical Center， PLA， Beijing 100142， China ）

Abstract： Objective" To investigate the in vitro activity， skin whitening efficacy and safety of loquat seed aqueous extract. Methods" The antioxidant and whitening effects of loquat seed aqueous extract were investigated by 1，1-dipheny l-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH）， 2，2'-diaminobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diamine salt （ABTS） radical scavenging assay， mouse melanoma B16 cell activity， melanin content and tyrosinase activity assay;Thirty volunteers with pigmented spots were enrolled in the study. One side of the face was randomly selected as the loquat seed extract group， and the other side as the negative control group. Skin individual type angle （ITA°） and skin melanin （MI） were compared after 8 weeks of treatment. Results" Aqueous extract of loquat seed could scavenge DPPH and ABTS free radicals with IC50 values of 7.98 mg/ml and 1.11 mg/ml， respectively. It had no effect on the viability of mouse B16 cells， but could inhibit the production of melanin and the activity of tyrosinase.Human body whitening efficacy test： ITA degree [（34.02±7.03）] after 8 weeks of treatment was higher than before [（27.07±5.89）]， MI[（162.7±40.20）] after 8 weeks of treatment was lower than before [（162.7±40.20）]， and the difference was statistically significant（P＜0.05）. ITA° and MI were significantly different between the two groups after treatment （P＜0.05）. Conclusion" The aqueous extract of loquat seed has good effects of antioxidation， melanogenesis inhibition and tyrosinase activity in vitro and has no obvious cytotoxicity. Human trials show that it has whitening effect and no adverse reactions.

Key words： aqueous extract of loquat seed; in vitro activity; human body efficacy; whitening; efficacy study

美白劑的開發(fā)成為近年來化妝品行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)，而目前常用的美白劑種類有限，如熊果苷、曲酸、氨甲環(huán)酸、維生素C等，存在穩(wěn)定性不足、皮膚刺激性等缺點(diǎn)[1-2]。枇杷屬蕃薇科，枇杷核其種子內(nèi)含氨基酸、維生素、多酚類、黃酮類和三萜類化合物等成分[3-4]。成分分析表明，枇杷核具有潛在的延緩衰老、抗氧化、抗炎、防止皮膚變黑、保濕以及營(yíng)養(yǎng)皮膚的功效[3-7]。本研究通過探討枇杷核水提物的體外活性、對(duì)人體皮膚美白的功效及安全性。為其作為美白劑的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1" 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和材料：多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南省予華儀器有限公司）。鮮枇杷核（福建省莆田市祥云堂藥業(yè)提供）；苯乙基間苯二酚（377，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，APEXBIO 公司）；2，2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；MTT（LABLEAD公司）；酪氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）

1.1.2 細(xì)胞株：小鼠黑素瘤B16細(xì)胞（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供）。

1.2 方法

1.2.1 枇杷核水提物的制備和成分分析

1.2.1.1 枇杷核水提物的制備：鮮枇杷核100 g，稱取并加入1 000 ml去離子水，80℃加熱回流1 h，重復(fù)2次。過濾后合并續(xù)濾液，70℃旋蒸濃縮，-80℃冷凍成固體后放入凍干機(jī)得枇杷核提取物凍干粉。取凍干粉適量，去離子水充分溶解，得到枇杷核水提液。

1.2.1.2 枇杷核水提物的成分分析：過色譜柱，質(zhì)譜檢測(cè)分析。

1.2.2 枇杷核水提物抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)：取0.1 mmol/L DPPH與等體積不同質(zhì)量濃度的枇杷核水提物溶液混合，暗室室溫反應(yīng)30 min，波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定其吸光度，記為Ai，空白的吸光值為A0，Aj為無DPPH時(shí)枇杷核水提物的吸光值。DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。

1.2.2.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)：取等體積的ABTS和K2S2O8溶液混合，用PBS稀釋至734 nm處吸光度為0.7左右，再與等體積不同質(zhì)量濃度的枇杷核水提物溶液混合，靜置，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)吸光度，記為Ai，空白的吸光值為A0，Aj為無ABTS時(shí)枇杷核水提物的吸光值。ABTS自由基清除率%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。

1.2.3 基于小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的美白實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 B16細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)：96孔板接種培養(yǎng)B16細(xì)胞，設(shè)置空白對(duì)照組及不同濃度給藥組。加入不同濃度（9個(gè)濃度）的枇杷核水提物培養(yǎng)基溶液。孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.3.2 B16細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)：采用MTT法測(cè)定B16細(xì)胞活力。96孔板接種培養(yǎng)B16細(xì)胞。設(shè)置空白對(duì)照組及不同濃度給藥組。加入不同濃度（8個(gè)濃度）的枇杷核水提物培養(yǎng)基溶液，孵育24 h。先后加入MTT（5 mg/ml）、DMSO溶液，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光值。A為給藥組的平均吸光度值；B為對(duì)照組（不給藥）的平均吸光度值；C為調(diào)零組（只含有DMSO）的平均吸光度值。細(xì)胞相對(duì)存活率=（A-C）/（B-C）×100%。

1.2.3.3 B16細(xì)胞黑色素含量實(shí)驗(yàn)：采用NaOH裂解法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)黑色素含量。12孔板接種培養(yǎng)B16細(xì)胞。設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組及不同濃度給藥組。孵育后分離細(xì)胞，離心，加入NaOH溶液（含10% DMSO），80℃水浴孵育，離心取上清液于酶標(biāo)儀下檢測(cè)405 nm處吸光度。A為給藥組的平均吸光度值；B為對(duì)照組的平均吸光度值；C為調(diào)零組（只10%DMSO的1 mol/L的NaOH溶液）的平均吸光度值。細(xì)胞內(nèi)黑色素含量（%）=（A-C）/（B-C）×100%。

1.2.3.4 酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)：選用L-Dopa氧化法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性。B16細(xì)胞接種孵育、給藥再孵育均與“1.2.3.3”項(xiàng)下相同。96孔板中加入細(xì)胞裂解離心后的上清液，加L-Dopa溶液（5 mmol/L），37℃孵育。475 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度至其穩(wěn)定。給藥組平均吸光度值為A；對(duì)照組為B。細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性（%）=A/B×100%。

1.2.4 人體美白功效測(cè)試

1.2.4.1 研究對(duì)象：選取2022年7月-2023年10月筆者醫(yī)院門診的32例年齡18～60歲面部褐色沉著斑患者。知情同意后入選。其中2例因個(gè)人原因退出。最終有效數(shù)據(jù)30例，皆為女性，平均年齡（28.4±8.7）歲。每人半側(cè)臉按隨機(jī)數(shù)字法進(jìn)行分組，一側(cè)半臉為枇杷核水提物治療組（產(chǎn)品A組），另側(cè)半臉為對(duì)照組（產(chǎn)品B組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60歲；②雙側(cè)面部擬受試區(qū)域皮膚至少各有一處對(duì)稱性的褐色色素沉著斑片，且直徑不小于3 mm（非雀斑、色素痣）；③患者對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病或其他皮膚病者；②有嚴(yán)重皮膚過敏史者；③近1個(gè)月內(nèi)接受過任何形式的面部皮膚治療、果酸、激光或美容手術(shù)者，試驗(yàn)期間無法避免紫外線曝曬者；④受試部位1個(gè)月內(nèi)有外涂抗炎藥物者；⑤近1個(gè)月內(nèi)參加藥物臨床試驗(yàn)者或其他化妝品功效評(píng)價(jià)者；⑥妊娠或哺乳期婦女。

1.2.4.2 試驗(yàn)樣品：具體如下。①產(chǎn)品A（治療組）：枇杷核水提物溶液（濃度為80 mg/ml）、促滲劑（0.4%N-甲基吡咯烷酮）；②產(chǎn)品B（對(duì)照組）：無菌水、促滲劑（0.4%N-甲基吡咯烷酮）、調(diào)色劑（0.10 mg/ml焦糖色素）。

1.2.4.3 測(cè)試儀器：皮膚色度儀（德國(guó)CK公司型號(hào)：MPA4，包含Mexameter MX18、Skin Colorimeter CL400探頭）、ViewSkin皮膚圖像分析儀（中國(guó)安德公司）。

1.2.4.4 環(huán)境條件：測(cè)試環(huán)境處于恒溫恒濕，溫度20℃～22℃，濕度40%～60%。

1.2.4.5 測(cè)試方法：采用隨機(jī)、雙盲、半臉對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)。具體操作如下：產(chǎn)品使用由患者在家中進(jìn)行。每天早晚各1次，使用前先清潔面部并擦干，按分組分別給予兩側(cè)面部1 ml的產(chǎn)品Ａ和產(chǎn)品Ｂ涂抹，涂抹后立即用水溶面膜紙覆蓋15 min。研究者在第0天、第4周、第8周與每位患者約定在醫(yī)院對(duì)其皮膚生物特性進(jìn)行評(píng)估，測(cè)量左右面部的皮膚個(gè)體類型角、皮膚黑色素指標(biāo)，取平均值（重復(fù)測(cè)定3次）。個(gè)體類型角（ITA°）：皮膚色度儀顏色探頭（CL400）測(cè)得。ITA°大小與膚色深淺度呈單調(diào)遞減關(guān)系。黑色素指數(shù)（MI）：皮膚色度儀黑色素探頭（MX18）測(cè)得。MI值大小與皮膚黑色素含量多少呈單調(diào)遞增關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graph prism 8.0、SPSS 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和可視化分析。計(jì)量數(shù)據(jù)表示為：均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s），并進(jìn)行正態(tài)分布性檢驗(yàn)和基于均值的方差齊性檢驗(yàn)（α=0.05），符合正態(tài)分布要求和方差齊性，采用單因素方差分析、自身對(duì)照前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，否則采用兩個(gè)相關(guān)樣本秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 枇杷核水提物的成分分析：質(zhì)譜分析共鑒定得到99種化合物。營(yíng)養(yǎng)成分包括脂肪酸類化合物棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸等7種和氨基酸類化合物。功能成分包括糖苷類化合物苦杏仁苷和異柚葡糖苷2種，酚酸類化合物綠原酸、阿魏酸、龍膽酸等12種，揮發(fā)油類化合物苯甲酸、苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯等16種，黃酮類化合物槲皮素、蘆丁、山柰酚等15種，和三萜類化合物熊果酸、樺木酸、齊墩果酸等26種。

2.2 枇杷核水提物抗氧化活性的測(cè)定：枇杷核水提物能清除DPPH（見圖1A）和ABTS（見圖1B）自由基，半抑制濃度（IC50）值分別是7.98 mg/ml和1.11 mg/ml。具有抗氧化活性。見圖1。

2.3 枇杷核水提物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的美白實(shí)驗(yàn)

2.3.1 B16細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組B16細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常。主要為兩極的貼壁生長(zhǎng)的上皮型細(xì)胞。加入不同濃度的枇杷核水提物后，細(xì)胞形態(tài)均未出現(xiàn)明顯變化。見圖2。

2.3.2 B16細(xì)胞活力測(cè)定：經(jīng)不同濃度枇杷核水提物（2.5～100 mg/ml）處理24 h，與空白組相比，B16細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此濃度范圍對(duì)B16細(xì)胞無毒性。見圖3。

2.3.3 B16細(xì)胞黑色素含量抑制實(shí)驗(yàn)：枇杷核水提物抑制B16細(xì)胞黑色素生成，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

2.3.4 B16細(xì)胞酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)：枇杷核水提物明顯抑制B16細(xì)胞的酪氨酸酶活性，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

2.4 人體美白功效測(cè)試結(jié)果

2.4.1 患者基本情況及不良反應(yīng)：30例色斑患者完成試驗(yàn)，未發(fā)生不良反應(yīng)。

2.4.2 皮膚個(gè)體類型角和黑色素客觀指標(biāo)比較：治療前枇杷核治療組（產(chǎn)品A）與對(duì)照組（產(chǎn)品B）ITA°和MI平均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療8周后治療組ITA°平均值均較治療前上升，MI平均值均較治療前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組ITA°和MI平均值較治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后治療組和對(duì)照組ITA°和MI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1～2。

3" 討論

本研究采用加熱回流提取法獲得枇杷核水提物，液質(zhì)聯(lián)用初步分析水提物的主要成分為三萜類、黃酮類、多酚類、脂肪酸類等物質(zhì)。本研究選用了DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)來測(cè)定枇杷核水提取物的抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示清除效果明顯。其原因可能與枇杷核中黃酮、多酚類還原類物質(zhì)可與自由基的單電子配對(duì)而清除自由基相關(guān)[5-8]。基于氧化應(yīng)激在色斑的形成中起到重要作用[14]，提示有體外抗氧化功能的枇杷核水提物具有潛在的美白功效。

黑色素的多少和皮膚顏色深淺呈單調(diào)遞增關(guān)系，過多的黑色素會(huì)導(dǎo)致膚色變黑、出現(xiàn)色斑，甚至?xí)鹌つw癌變。酪氨酸酶起到了調(diào)控皮膚黑色素生成的速度及數(shù)量的關(guān)鍵作用。本研究采用與人體黑素細(xì)胞生理上較為接近的小鼠黑素瘤B16細(xì)胞作為研究模型，通過測(cè)定細(xì)胞增殖率、黑色素含量以及酪氨酸酶活性，在細(xì)胞水平檢測(cè)了枇杷核水提物的體外美白活性，對(duì)枇杷核水提物的細(xì)胞安全性和美白作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，枇杷核水提物在濃度為2.5～80 mg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用。為枇杷核水提物應(yīng)用安全性提供了依據(jù)。并發(fā)現(xiàn)枇杷核水提物能抑制小鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑色素的生成及酪氨酸酶的活性。其作用機(jī)制可能與其成分中含有不飽和脂肪酸α-亞麻酸和亞油酸能加速酪氨酸酶蛋白降解、含多酚類物質(zhì)可與酪氨酸轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，抑制酪氨酸酶的活性，從而阻止黑色素的生成，防止皮膚變黑或出現(xiàn)色斑[8-13]。皮膚氧自由基激發(fā)的氧化損傷及酪氨酸酶活性增強(qiáng)是誘導(dǎo)皮膚黑色素增多的主要因素[14]。體外實(shí)驗(yàn)顯示了枇杷核水提物的美白活性。在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黑色素含量、酪氨酸活性實(shí)驗(yàn)中都選取了苯乙基間苯二酚（377）作為陽(yáng)性對(duì)照物，源于377作為公認(rèn)的美白劑收錄于2015版化妝品準(zhǔn)用目錄，可強(qiáng)效抑制酪氨酸酶并具抗氧化功效[15]。

本研究還通過人體美白功效試驗(yàn)驗(yàn)證了枇杷核水提物的人體皮膚美白功效。試驗(yàn)采用隨機(jī)、雙盲、半臉對(duì)照的設(shè)計(jì)方案，結(jié)果評(píng)估采用了客觀指標(biāo)表示皮膚顏色的ITA°和黑色素含量的MI值，避免了主觀評(píng)價(jià)的缺點(diǎn)，增加了結(jié)果可靠性。半臉對(duì)照的試驗(yàn)方法有效減小了個(gè)體誤差。試驗(yàn)中30例患者均無不良反應(yīng)，也初步驗(yàn)證了枇杷核提取物原料使用的安全性。但本研究樣本量較少，僅30例，結(jié)果有一定局限性。如樣本量進(jìn)一步擴(kuò)大，可進(jìn)一步驗(yàn)證枇杷核水提物的人體美白功效性及安全性，為新美白劑的開發(fā)應(yīng)用提供更多的依據(jù)。

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[收稿日期]2023-12-19

本文引用格式：周瀾華，李憶紅，趙蕊，等.枇杷核水提物的體外活性及人體美白功效研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2025，34（1）：10-14.