產(chǎn)CpxP蛋白枯草芽孢桿菌的發(fā)酵優(yōu)化及中試生產(chǎn)

摘 要：為獲得產(chǎn)CpxP蛋白枯草芽孢桿菌ZY1液體發(fā)酵的最佳條件并制備微生態(tài)菌劑，采用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)ZY1進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。結(jié)果表明：搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽分別為淀粉、豆粕、NaCl；最優(yōu)培養(yǎng)基配方為淀粉2.12 g/L、豆粕5.90 g/L、NaCl 5.21 g/L，活菌數(shù)達(dá)到9.63×108 CFU/mL，比培養(yǎng)基優(yōu)化前提高了11.04倍；搖瓶發(fā)酵條件最佳初始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量分別為7.0、37 ℃、200 r/min、2%，活菌數(shù)達(dá)1.05×109 CFU/mL，比培養(yǎng)基優(yōu)化后提高了9.0%；按10%接種量基于5 t發(fā)酵罐體系進(jìn)行菌劑中試生產(chǎn)過(guò)程中，ZY1活菌數(shù)達(dá)到1.05×10¹¹ CFU/mL，比搖瓶?jī)?yōu)化后提高了100倍；發(fā)酵結(jié)束時(shí)芽孢率達(dá)到90%，經(jīng)噴霧干燥制備出菌劑1 012 kg，成品檢測(cè)活菌數(shù)為8.5×109 CFU/g。研究結(jié)果可為進(jìn)一步開展CpxP蛋白在動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉病生物防治功能方面的研究提供基礎(chǔ)材料。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)工程；CpxP蛋白；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵優(yōu)化；響應(yīng)面；中試生產(chǎn)

中圖分類號(hào)：Q939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"" DOI：10.7535/hbkd.2025yx01011

收稿日期：2024-05-22；修回日期：2024-08-12；責(zé)任編輯：張士瑩

基金項(xiàng)目：國(guó)家藥典委員會(huì)科研項(xiàng)目（2021Y04）；

河北省自然科學(xué)基金生物醫(yī)藥聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目（C2020208020）；河北省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（202460101030040）

第一作者簡(jiǎn)介：

董榮榮（1998—），女，河南濮陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事CpxP蛋白在畜禽養(yǎng)殖中細(xì)菌性腹瀉病防治功能方面的研究。

通信作者：劉浩。E-mail：390051387@qq.com

周曉輝，教授。E-mail：zhouxh2003@aliyun.com

Fermentation optimization and pilot production of

Bacillus subtilis ZY1 producing CpxP

DONG Rongrong" ZHANG Huan" YU Xinran" LIU Hao" ZHOU Xiaohui1

（1.School of Food and Biology， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China;

2.Department of Asset and Laboratory Management， Hebei University of Science and Technology，

Shijiazhuang， Hebei 050018， China）

Abstract：In order to obtain the optimal conditions for liquid fermentation of Bacillus subtilis ZY1 producing CpxP protein and prepare microecological bactericides， the fermentation process of Bacillus subtilis ZY1 was optimized by single factor test and response surface test. The results show that the optimal carbon source， nitrogen source and inorganic salt of fermentation medium are starch， soybean meal and NaCl， respectively. The optimal medium formulation is starch at 2.12 g/L， soybean meal at 5.90 g/L， and NaCl at 5.21 g/L， with a viable bacteria count of 9.63×108 CFU/mL， which is 11.04 times higher than that before the medium optimization. The optimum initial pH value， temperature， rotation speed and inoculation amount for shake flask fermentation are 7.0， 37 ℃， 200 r/min and 2%， respectively. The viable bacteria number is 1.05×109 CFU/mL， which is 9.0% higher than that of optimized medium. During the pilot production process of the microecological bactericides based on 5 t fermentation tank system with 10% inoculated quantity， the count of viable ZY1bacteria reaches 1.05×10¹¹ CFU/mL， which is 100 times higher than that after shaker optimization. When the spore rate reaches 90% at the end of fermentation， 1 012 kg bactericides are prepared by spray drying， and the count of viable bactericide is 8.5×109 CFU/g. The research results can provide basic materials for further research on the biocontrol function of CpxP protein in animal bacterial diarrhea disease.

Keywords：protein engineering; CpxP protein; Bacillus subtilis; optimization of fermentation; response surface; pilot production

細(xì)菌性腹瀉病是動(dòng)物養(yǎng)殖中的常見疾病，對(duì)畜牧業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失^[1]。大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌和非傷寒桿菌等革蘭氏陰性菌是引起細(xì)菌性腹瀉的主要致病菌，通過(guò)引起腸道微生物菌群失衡，造成消化道代謝紊亂，導(dǎo)致腹瀉甚至死亡?？股?、中草藥以及生物制劑等是細(xì)菌性腹瀉病的常用防治手段^［2-5］。雖然抗生素治療效果顯著，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生多重耐藥性，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已于2020年頒布退出所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（除中藥外）在動(dòng)物源性食品中的使用^[6]。中草藥雖然可以調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群，緩解細(xì)菌性腹瀉，但存在提取困難、成分復(fù)雜等問題^［7-11］。因此，生物防治成為當(dāng)前防治細(xì)菌性腹瀉病的研究熱點(diǎn)。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）屬于芽孢桿菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，具有可分泌抗菌肽、黏蛋白、有機(jī)酸等多種活性代謝產(chǎn)物的益生特性，常被用于畜禽及田間病害的生物防治。但BS功效及作用隨菌株的不同而異^[12-15]。基于BS菌株不產(chǎn)生內(nèi)毒素、可穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白、抗逆性強(qiáng)和廣譜抗性等優(yōu)點(diǎn)^[15]，并針對(duì)以上BS單一菌株功能特異性弱、代謝產(chǎn)物作用機(jī)制不明確等問題，本文研究開發(fā)了具有協(xié)同抗菌作用的ZY1菌株，其既有BS特性，又擁有分泌抑制革蘭氏陰性菌抗菌蛋白CpxP的特性。課題組前期對(duì)大腸桿菌MG1655標(biāo)準(zhǔn)株系進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)CpxP蛋白會(huì)顯著削弱其游動(dòng)能力，暗示CpxP在大腸桿菌纖毛形成過(guò)程中起到抑制作用，降低了侵染能力與致病性^［16-18］。經(jīng)過(guò)多序列比對(duì)和分子生物學(xué)分析，結(jié)果顯示，CpxP在蛋白水平上與志賀氏菌和沙門氏菌具有較高的同源性，可能對(duì)治療革蘭氏陰性菌引起的細(xì)菌性腹瀉病具有普遍適用性。但由于CpxP蛋白穩(wěn)定性較差、不易保存，因而ZY1的菌體產(chǎn)量偏低，僅為8.0×10⁷ CFU/mL。而微生物蛋白表達(dá)水平與合適的發(fā)酵條件息息相關(guān)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，可以充分發(fā)揮菌株的生產(chǎn)潛能，提高菌體產(chǎn)量，增加蛋白表達(dá)量，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本^[19]。本研究利用枯草芽孢桿菌ZY1作為表達(dá)系統(tǒng)分泌CpxP蛋白，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件^[20]，利用大罐發(fā)酵技術(shù)制得高純度高活性固體菌劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌ZY 河北科技大學(xué)蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖，北京索萊寶科技有限公司提供；蛋白胨、酵母浸粉、糊精、尿素、豆粕、豆餅粉，河北民得富生物技術(shù)有限公司提供；蔗糖、淀粉、甘油、尿素、硫酸銨、NaCl、MnSO4、CaCO3、KCl、MgSO4、ZnSO 天津科百奧生物試劑有限公司提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司提供；D-1型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋，北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司提供；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司提供；JJ200精密電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠提供；EL204型分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司提供；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司提供；SPX-250B-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供；100 L、5 t發(fā)酵罐，滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所有限公司提供；LPG離心噴霧干燥機(jī)，滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所有限公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，pH值為7.0。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值為7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將實(shí)驗(yàn)室低溫保藏的枯草芽孢桿菌ZY1在LB固體培養(yǎng)基上劃線活化菌株，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種至裝液量100 mL/250 mL的液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。按2%接種量將種子液接種至裝液量100 mL/250 mL的液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在培養(yǎng)基中分別選取淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖作為唯一碳源，確定枯草芽孢桿菌ZY1的最佳碳源；分別選取蛋白胨、豆餅粉、豆粕、尿素、酵母浸粉、硫酸銨作為唯一氮源，確定最佳氮源；分別選取MnSO4、NaCl、CaCO3、KCl、ZnSO4、MgSO4作為不同無(wú)機(jī)鹽種類，確定最佳無(wú)機(jī)鹽；在最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)基中的其他因素進(jìn)一步優(yōu)化。選擇淀粉、豆粕、NaCl的添加量均為0～12.5 g/L，考察3個(gè)因素對(duì)枯草芽孢桿菌ZY1活菌數(shù)的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。發(fā)酵條件均為37 ℃、180 r/min、36 h。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 11軟件，依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取淀粉（A）、豆粕（B）、NaCl（C）作為自變量，以活菌數(shù)（Y）作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

在確定發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉為碳源、豆粕為氮源、NaCl為無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，分別對(duì)ZY1初始pH值（5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0）、培養(yǎng)溫度（28、31、34、37、40、43 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、轉(zhuǎn)速（160、180、200、220、240、260、280 r/min）4個(gè)發(fā)酵條件進(jìn)行單因素發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間為36 h，以活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 中試生產(chǎn)

以100 L發(fā)酵罐為種子罐，50%裝液量，采用火圈接種法接種后進(jìn)行ZY1種子液培養(yǎng)。發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定溫度為37 ℃，電機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)初始6 h為120 r/min，隨后為150 r/min，罐體壓力為0.05 MPa。將培養(yǎng)后的種子液通過(guò)調(diào)節(jié)管路按10%接種量接種至5 t發(fā)酵罐中?；趽u瓶?jī)?yōu)化后的培養(yǎng)基，在5 t發(fā)酵罐中添加酵母膏、玉米漿干粉、硫酸錳等物質(zhì)進(jìn)行菌劑中試生產(chǎn)，發(fā)酵結(jié)束后采用LPG離心噴霧干燥機(jī)制備菌劑。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin 2018、Design Expert 11.0軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS 26軟件ANOVA檢驗(yàn)程序進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，Plt;0.05為差異顯著，Plt;0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源及添加量對(duì)發(fā)酵的影響

碳源是微生物代謝活動(dòng)所需能量的主要來(lái)源。菌株對(duì)碳源的利用情況可以反饋其生長(zhǎng)代謝情況，詳見圖1。由圖1 a）可知，當(dāng)碳源為淀粉時(shí)，活菌數(shù)最高為

5.80×10⁸ CFU/mL，較培養(yǎng)基優(yōu)化前提升了6.25倍，與其他碳源相比，均有顯著差異（Plt;0.05），因此得出最佳碳源為淀粉。由圖1 d）可知，活菌數(shù)隨淀粉添加量的增加先上升后下降，當(dāng)添加量為2.5 g/L時(shí)，活菌數(shù)最高為8.00×10⁸ CFU/mL，與5 g/L添加量時(shí)無(wú)顯著差異，但均顯著高于其他添加量時(shí)的ZY1活菌數(shù)。因此，淀粉最佳添加量為2.5 g/L。

2.1.2 氮源及添加量對(duì)發(fā)酵的影響

氮源能提供微生物生長(zhǎng)所需要的核苷酸、維生素與礦物質(zhì)元素。圖1 b）表明，當(dāng)?shù)礊槎蛊蓵r(shí)，活菌數(shù)為6.73×10⁸ CFU/mL，均顯著高于其他氮源培養(yǎng)時(shí)的活菌數(shù)（Plt;0.05）。因此，最佳氮源為豆粕。由圖1 e）可知，未添加豆粕時(shí)，活菌數(shù)為0，說(shuō)明微生物無(wú)氮源不生長(zhǎng)。隨著豆粕含量的增加，活菌數(shù)先增加后下降，添加量為5.0 g/L時(shí)，活菌數(shù)均顯著高于其他添加量（Plt;0.05），達(dá)到9.50×10⁸ CFU/mL。因此，豆粕最佳添加量為5.0 g/L。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽種類及添加量對(duì)發(fā)酵的影響

無(wú)機(jī)鹽作為微生物生長(zhǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與微生物的各種代謝途徑及細(xì)胞構(gòu)成。由圖1 c）可知，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽為NaCl時(shí)，ZY1菌體產(chǎn)量均顯著高于其余組（MgSO4除外）（Plt;0.05）。因此，最佳無(wú)機(jī)鹽為NaCl。由圖1 f）可知，添加量為5.0 g/L時(shí)，活菌數(shù)最大為9.80×10⁸ CFU/mL，與7.5 g/L相比無(wú)顯著差異，與其他添加量相比均具有顯著性（Plt;0.05）。因此，NaCl最佳添加量為5.0 g/L。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用Design Expert 11軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)。選取淀粉（A）、豆粕（B）、NaCl（C）添加量為自變量，活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)出17種實(shí)驗(yàn)方案，測(cè)定每組實(shí)驗(yàn)條件下ZY1活菌數(shù)，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表 回歸模型方差分析見表3。

應(yīng)用Design Expert 11軟件得到以活菌數(shù)為響應(yīng)值的二元多項(xiàng)回歸方程：Y=86.72-1.64A+2.75B+0.96C-0.25AB+0.68AC+0.1BC-5.45A²-3.87B²-5.45C²?；貧w模型方差分析如表3所示，二次回歸模型P=0.000" 差異極顯著；失擬項(xiàng)P=0.079" 差異不顯著，說(shuō)明無(wú)異常數(shù)據(jù)，模型建立成功。響應(yīng)面相關(guān)系數(shù)（R²）為0.987" 回歸方程校正決定系數(shù)為0.971" 均大于0.9 說(shuō)明擬合程度較好，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值高度相關(guān)，可應(yīng)用于ZY1發(fā)酵活菌數(shù)理論預(yù)測(cè)。此外，方差分析結(jié)果顯示，A與B對(duì)活菌數(shù)影響極顯著（Plt;0.01），C對(duì)活菌數(shù)影響顯著（Plt;0.05），各因素對(duì)活菌數(shù)影響程度為B＞A＞C。

為更直觀了解2種變量之間的交互作用及各因素交互作用對(duì)ZY1活菌數(shù)的影響，運(yùn)用Design Expert 11軟件基于二次回歸方程模擬繪制影響活菌數(shù)的等高線和三維圖，結(jié)果如圖2所示，其中淀粉、豆粕、NaCl 3個(gè)因素均存在極值點(diǎn)。對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程求導(dǎo)，獲得最佳培養(yǎng)基配方為淀粉質(zhì)量濃度為2.12 g/L、豆粕質(zhì)量濃度為5.90 g/L、NaCl質(zhì)量濃度為5.21 g/L，在此配方下發(fā)酵活菌數(shù)的預(yù)測(cè)值最高達(dá)9.74×10⁸ CFU/mL。為了驗(yàn)證響應(yīng)面模型的準(zhǔn)確性，在上述最佳培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，得到ZY1活菌數(shù)平均值為9.63×10⁸ CFU/mL，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明預(yù)測(cè)結(jié)果可信。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響

微生物菌株生長(zhǎng)受pH值的影響較大。通常情況下，微生物處于自己的耐受pH值時(shí)，可以正常生長(zhǎng)繁殖，但生長(zhǎng)速度及活性會(huì)下降。由圖3 a）可知，活菌數(shù)隨pH值的升高先上升后下降，當(dāng)pH值為7.0時(shí)活菌數(shù)最多，達(dá)到9.80×10⁸ CFU/mL，與pH值為7.5時(shí)相比無(wú)顯著差異，與其他pH值相比均有顯著差異（Plt;0.05）。因此，最佳初始pH值為7.0。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵的影響

微生物在生長(zhǎng)繁殖時(shí)隨環(huán)境溫度的變化而變化。溫度過(guò)高或者過(guò)低，均會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生影響。由圖3 b）可知，溫度為37 ℃時(shí)，活菌數(shù)最高為9.83×10⁸ CFU/mL，與其他溫度相比均有顯著差異（Plt;0.05），且活菌數(shù)隨溫度的升高先增加后減少。因此，最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。

2.3.3 接種量對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過(guò)程中，菌種接種量是影響微生物生長(zhǎng)速度的重要因素。適宜的接種量可以促進(jìn)菌種的生長(zhǎng)繁殖，提高發(fā)酵效率。由圖3 c）可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，活菌數(shù)為1.02×10⁹ CFU/mL，與3%接種量相比無(wú)顯著差異。因此，種子液最佳接種量為2%。

2.3.4 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響

在搖床發(fā)酵中，轉(zhuǎn)速通過(guò)影響溶液的溶氧對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)生影響。由圖3 d）可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，活菌數(shù)最高，達(dá)到1.05×10⁹ CFU/mL，與其他轉(zhuǎn)速相比，均有顯著差異（Plt;0.05），且活菌數(shù)隨轉(zhuǎn)速的增加先上升后下降。因此，最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.4 中試生產(chǎn)

對(duì)枯草芽孢桿菌ZY1進(jìn)行5 t中試擴(kuò)大生產(chǎn)，發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖4。由圖可知，5 t發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，6～28 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，32 h時(shí)活菌數(shù)最大為1.05×10¹¹ CFU/mL，比搖瓶?jī)?yōu)化后提高了100倍。在12～20 h時(shí)受菌株快速生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸影響，pH值呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，20 h后pH值穩(wěn)定上升，可能與菌株代謝活動(dòng)減弱及芽孢產(chǎn)生有關(guān)^[15]。發(fā)酵至36 h時(shí)，芽孢率約為75%，此時(shí)活菌數(shù)為1.01×10¹¹ CFU/mL。由于菌株放大生產(chǎn)的可行性及穩(wěn)定性較好，因而活菌數(shù)均達(dá)到預(yù)期值，發(fā)酵罐回涼結(jié)束后芽孢率達(dá)到90%時(shí)，可用于噴霧干燥。改變管路將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入預(yù)混罐，5 t發(fā)酵罐中發(fā)酵液流入的預(yù)混罐中加入30%氫鈣，調(diào)整預(yù)混罐轉(zhuǎn)速為80 r/min，混勻罐內(nèi)物料，經(jīng)噴霧干燥可得到1 012 kg制劑。微生物檢測(cè)參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26428—2010，經(jīng)平板活菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證，得到活菌數(shù)為8.50×10⁹ CFU/g。文獻(xiàn)[21]對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)、鼓風(fēng)干燥后，所得芽孢產(chǎn)量為4.80×10⁹ CFU/g。與之相比，雖然本文枯草芽孢桿菌的活性較高，但仍可借鑒其干燥方式獲得更高的ZY1活性及芽孢數(shù)。文獻(xiàn)[22]在對(duì)枯草芽孢桿菌Y31培養(yǎng)基和固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化后，Y31活菌數(shù)達(dá)到了2.40×10¹⁰ CFU/g，遠(yuǎn)高于本文ZY1活性。其原因一是菌株不同，二是發(fā)酵方式不同^[23]。

3 結(jié) 語(yǔ)

以課題組前期篩選得到的一株產(chǎn)CpxP蛋白的菌株Bacillus subtilis ZY1為出發(fā)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵優(yōu)化及中試生產(chǎn)，得出以下結(jié)論：1）培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為淀粉2.12 g/L、豆粕5.90 g/L、NaCl 5.21 g/L；2）發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果為初始pH值為7.0、溫度為37 ℃、接種量為2%、轉(zhuǎn)速為200 r/min；3）5 t發(fā)酵罐中試生產(chǎn)過(guò)程中菌株ZY1活菌數(shù)達(dá)到1.05×10¹¹ CFU/mL；4）發(fā)酵液經(jīng)噴霧干燥制備出1 012 kg菌粉，成品檢測(cè)后得到活菌數(shù)為8.50×10⁹ CFU/g。

本文發(fā)酵方式與干燥方式的不同可能損失了菌體產(chǎn)量和蛋白產(chǎn)量，因此，未來(lái)擬結(jié)合固態(tài)發(fā)酵與鼓風(fēng)干燥方式提高ZY1的活菌數(shù)及芽孢數(shù)，為進(jìn)一步開展CpxP蛋白在動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉病生物防治功能方面的研究提供優(yōu)良制劑。

參考文獻(xiàn)/References：

[1] DU Wenjuan，WANG Xianghuang，XU Le，et al.Research advances in intestinal diseases and related diarrhea in animal production[J].Frontiers in Veterinary Science，2023.DOI：10.3389/fvets.2023.1201231.

KOTLOFF K L.Bacterial diarrhoea[J].Current Opinion in Pediatrics，202 34（2）：147-155.

[3] LI Yunxia，XIA Siting，JIANG Xiaohan，et al.Gut microbiota and diarrhea：An updated review[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2021. DOI： 10.3389/fcimb.2021.625210.

[4] YUE Shousong，LI Zhentian，HU Fuli，et al.Curing piglets from diarrhea and preparation of a healthy microbiome with Bacillus treatment for industrial animal breeding[J].Scientific Reports，2020. DOI： 10.1038/s41598-020-75207-1.

[5] SU Weifa，GONG Tao，JIANG Zipeng，et al.The role of probiotics in alleviating postweaning diarrhea in piglets from the perspective of intestinal barriers[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2022. DOI： 10.3389/fcimb.2022.883107.

[6] WANG Jie，XIA Siqi，F(xiàn)AN Huimei，et al.Microbiomics revealed the disturbance of intestinal balance in rabbits with diarrhea caused by stopping the use of an antibiotic Diet[J].Microorganisms，2022. DOI： 10.3390/microorganisms10050841.

[7] LUO Zhenye，LIU Changshun，HU Yannan，et al.Gegen qinlian decoction restores the intestinal barrier in bacterial diarrhea piglets by promoting Lactobacillus growth and inhibiting the TLR2/MyD88/NF-κB pathway[J].Biomedicine amp; Pharmacotherapy，2022. DOI： 10.1016/j.biopha.2022.113719.

[8] MIN Suji，KIM H，YAMBE N，et al.Ameliorative effects of Korean-red-ginseng-derived polysaccharide on Antibiotic-Associated diarrhea[J].Polymers，2024. DOI： 10.3390/polym16020231.

[9] ZHANG Qing，ZHANG Xu，WANG Qing，et al.Dioscoreae rhizoma starch improves chronic diarrhea by regulating the gut microbiotas and fecal metabolome in rats[J].Food Science amp; Nutrition，202 11（10）：6271-6287.

[10]程鑫怡，鄒君彪，冷董碧，等.畜禽腹瀉病因及中草藥防治腹瀉機(jī)制研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2021（3）：52-57.

CHENG Xinyi，ZOU Junbiao，LENG Dongbi，et al.Advances in the research on the etiology of diarrhea in livestock and poultry and the mechanism of Chinese herbal medicine to control diarrhea[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2021（3）：52-57.

[11]XUE Hong，MEI Chunfeng，WANG Fengyun，et al.Relationship among Chinese herb polysaccharide （CHP），gut microbiota，and chronic diarrhea and impact of CHP on chronic diarrhea[J].Food Science amp; Nutrition，202 11（10）：5837-5855.

[12]何振虎，項(xiàng)黎麗.枯草芽孢桿菌對(duì)育肥羊生長(zhǎng)性能、抗氧化及免疫機(jī)能的影響[J].中國(guó)飼料，2023（16）：21-24.

HE Zhenhu，XIANG Lili.Effect of Bacillus subtilis on growth performance，antioxidant and immune function of fattening sheep[J].China Feed，2023（16）：21-24.

[13]趙佳霓，岳淑英，羅正，等.枯草芽孢桿菌PB6制劑對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、抗氧化能力和腸道菌群的影響[J].中國(guó)畜牧雜志，202 60（6）：298-302.

[14]谷清義，王妍佳，李夢(mèng)楠，等.枯草芽孢桿菌BSCY-1對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)特性的影響[J].北方園藝，2024（10）：17-23.

GU Qingyi，WANG Yanjia，LI Mengnan，et al.Effect of a Bacillus subtilis BSCY-1 on the seed germination and seeding growth and physiological characteristics of cucumber[J].Northern Horticulture，2024（10）：17-23.

[15]GAO Yang，HUO Xingchen，WANG Zhensheng，et al.Oral administration of Bacillus subtilis subunit vaccine significantly enhances the immune protection of grass carp against GCRV-Ⅱ infection[J].Viruses，2021. DOI： 10.3390/v14010030.

[16]TSCHAUNER K，HRNSCHEMEYER P，MLLER V S，et al.Dynamic interaction between the CpxA sensor kinase and the periplasmic accessory protein CpxP mediates signal recognition in E. coli[J].PloS One，2014. DOI： 10.1371/journal.pone.0107383.

[17]HE Xiaoliang，REN Yuwen，MENG Wanli，et al.Knocking out analysis of the CpxP gene using crispr/Cas9 in Escherichia coli MG1655[J].AMB Express，2020. DOI： 10.1186/s13568-020-01099-z.

[18]苗蘭天，盧天華，何曉亮，等.胡蘿卜軟腐果膠桿菌CpxP蛋白純化及抑菌功能鑒定[J].生物工程學(xué)報(bào)，2019，35（5）：847-856.

MIAO Lantian，LU Tianhua，HE Xiaoliang，et al.Purification and bacteriostatic identification of CpxP protein from Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum[J].Chinese Journal of Biotechnology，2019，35（5）：847-856.

[19]ZHANG Yu，NIE Yao，ZHOU Xia，et al.Enhancement of pullulanase production from recombinant Bacillus subtilis by optimization of feeding strategy and fermentation conditions[J].AMB Express，2020. DOI： 10.1186/s13568-020-0948-5.

[20]任玉文，任媛媛，劉雅禎，等.抗植物軟腐病枯草芽孢桿菌的高密度發(fā)酵優(yōu)化[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，41（5）：433-441.

REN Yuwen，REN Yuanyuan，LIU Yazhen，et al.Optimization of high-density fermentation for Bacillus subtilis resistant to plant soft rot[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2020，41（5）：433-441.

[21]張關(guān)鋒，楊泰，宋先凡，等.枯草芽孢桿菌的生理功能及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，202 51（4）：1511-1519.

ZHANG Guanfeng，YANG Tai，SONG Xianfan，et al.Physiological functions of Bacillus subtilis and its application in livestock and poultry production[J].China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine，202 51（4）：1511-1519.

[22]趙甜宇，潘朝陽(yáng)，張朝輝，等.固態(tài)枯草芽孢桿菌菌劑的制備工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2020，41（19）：104-111.

ZHAO Tianyu，PAN Chaoyang，ZHANG Chaohui，et al.Study on the preparation technology of solid Bacillus subtilis[J].Science and Technology of Food Industry，2020，41（19）：104-111.

[23]盧龍娣.雞源性益生芽孢桿菌的篩選鑒定、固體發(fā)酵的優(yōu)化及其應(yīng)用效果的研究[D].福州：福建師范大學(xué)，2010.

LU Longdi.Studies on Screening，Identification，Solid-state Fermentation Optimization and Application Effect of Bacillus from Chicken Intestines[D].Fuzhou：Fujian Normal University，2010.