抗阻運動通過miR-21-5p/TSP-1途徑改善老年男性增齡性循環(huán)內(nèi)皮祖細胞功能損傷研究

摘""""" 要：觀察規(guī)律抗阻訓練對老年男性循環(huán)內(nèi)皮祖細胞功能的影響并探討miR-21-5p/血小板反應蛋白（TSP-1）在其間的可能作用機理。60名健康、無規(guī)律運動習慣的老年男性隨機分為對照組和運動組，對照組維持日常生活習慣，運動組進行3次/周、共12周的抗阻訓練干預。分別于試驗前后，利用超聲診斷系統(tǒng)測定肱動脈血流介導的血管舒張功能（FMD）；取外周血分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞，利用β-半乳糖苷酶染色法檢測衰老水平，MTT比色法、Matrigel管腔形成實驗分別檢測體外增殖和成管能力，通過裸鼠頸動脈內(nèi)膜拉脫模型檢測在體內(nèi)皮損傷修復能力，實時熒光定量PCR檢測miR-21-5p和TSP-1 mRNA表達量，免疫印跡法測定TSP-1蛋白表達量；通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染分別過表達miR-21-5p（miR-21-5p模擬物）和抑制TSP-1（TSP-1 siRNA）表達后，檢測內(nèi)皮祖細胞衰老和功能。結(jié)果：（1）訓練依從性和安全性：運動組1例（3.3%）脫落，訓練計劃完成率為96.8%，無嚴重不良反應事件或心血管相關事件發(fā)生。（2）血管內(nèi)皮功能和內(nèi)皮祖細胞功能：試驗后，與對照組比較，運動組FMD升高（Plt;0.05），內(nèi)皮祖細胞β-半乳糖苷酶陽性細胞下降（Plt;0.05），體外增殖和成管能力增加（Plt;0.05），體內(nèi)損傷血管再內(nèi)皮化功能提高（Plt;0.05），miR-21-5p表達上調(diào)（Plt;0.05），TSP-1 mRNA和蛋白表達下調(diào)（Plt;0.05）。（3）細胞轉(zhuǎn)染試驗：轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物誘導miR-21-5p過表達后，內(nèi)皮祖細胞TSP-1 mRNA和蛋白表達下降（Plt;0.05），體外增殖、成管能力以及體內(nèi)損傷血管再內(nèi)皮化功能改善（Plt;0.05），然而，β-半乳糖苷酶陽性細胞無顯著性變化（Pgt;0.05）；轉(zhuǎn)染TSP-1 siRNA誘導TSP-1沉默后，β-半乳糖苷酶陽性細胞下降（Plt;0.05），體外增殖、成管能力以及體內(nèi)損傷血管再內(nèi)皮化功能提升（Plt;0.05）。結(jié)論：抗阻訓練通過上調(diào)miR-21-5p抑制TSP-1表達來改善老年男性內(nèi)皮祖細胞功能，通過下調(diào)TSP-1延緩內(nèi)皮祖細胞衰老，因此miR-21-5p和TSP-1是抗阻訓練發(fā)揮心血管保護效應的重要靶點。

關" 鍵" 詞：運動生物化學；抗阻訓練；內(nèi)皮祖細胞；血管內(nèi)皮功能；老年男性

中圖分類號：G804.7"" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1006-7116（2025）01-0150-07

A study on resistance training improves age-related circulating endothelial progenitor cell functional impairment in old males by miR-21- 5p/TSP-1 pathway

HAN Shuna1，SUN Yi2，YE Qiong3

（1.Department of Physical Education，Sichuan International Studies University，Chongqing 400033，China；

2.School of Physical Education，Jilin University，Changchun 130012，China；

3.Department of Physical Education，Chongqing Preschool Education College，Chongqing 404000，China）

Abstract： To observe the effect of regular resistance training on the function of circulating endothelial progenitor cells in elderly men and to explore the possible mechanism of miR-21-5p/thrombospondin 1 （TSP-1）. 60 healthy old males with no regular exercise habits were randomly divided into control group and exercise group. The control group maintained their daily habits， and the exercise group underwent resistance training intervention three times per week for a total of 12 weeks. Before and after the experiment， an ultrasonic diagnostic system was used to measure brachial artery flow mediated dilation （FMD）. Peripheral blood was taken to isolate and culture endothelial progenitor cells， β-galactosidase staining to detect the aging level， MTT colorimetry and Matrigel tube formation assay to detect the proliferation and tube-forming ability in vitro respectively， the repair ability of endothelial damage in vivo through the nude mouse carotid artery intimal pull-off model， real-time fluorescence quantitative PCR to detect the expression of miR-21-5p and TSP-1 mRNA， and the expression of TSP-1 protein by Western blotting， were determined. After overexpressing miR-21-5p （miR-21-5p mimic） and inhibiting TSP-1 （TSP-1 siRNA） expression respectively by lipofectamine transfection， endothelial progenitor cell senescence and function were detected. The results show that： （1） Training compliance and safety： 1 case （3.3%） dropped out， the training plan completion rate was 96.8%， and no serious adverse events or cardiovascular-related events occurred in the exercise group. （2） Vascular endothelial function and endothelial progenitor cell function： After the experiment， compared with the control group， FMD increased （Plt;0.05）， β-galactosidase-positive cells of endothelial progenitor cells decreased （Plt;0.05）， the proliferation and tube formation abilities in vitro were increased （Plt;0.05）， the reendothelialization function of injured blood in vivo was improved （Plt;0.05）， the expression of miR-21-5p was up-regulated （Plt;0.05）， and the expression of TSP-1 mRNA and protein was down-regulated （Plt;0.05） in the exercise group. （3） Cell transfection test： After transfection with miR-21-5p mimic to induce the overexpression of miR-21-5p， the expression of TSP-1 mRNA and protein in endothelial progenitor cells decreased （Plt;0.05）， the proliferation and tube formation ability in vitro and reendothelialization function of injured blood in vivo were improved （Plt;0.05）， however， there were no significant changes in β-galactosidase-positive cells （Pgt;0.05）. After transfection of TSP-1 siRNA to induce TSP-1 silencing， β-galactosidase-positive cells decreased （Plt;0.05）， the proliferation and tube formation ability in vitro and reendothelialization function of injured blood in vivo increased （Plt;0.05）. The conclusion reveal that： resistance training inhibits TSP-1 expression by up-regulating miR-21-5p， improves endothelial progenitor cell function， and delays endothelial progenitor cell aging by down-regulating TSP-1 in elderly men. Therefore， miR-21-5p and TSP-1 are important targets for the cardiovascular protective effects of resistance training

Keywords： sports biochemistry；resistance training；endothelial progenitor cells；vascular endothelial function；old males

增齡可導致血管內(nèi)皮功能下降，從而誘導血管內(nèi)膜層增生，最終引發(fā)多種心血管疾病[1]。血管內(nèi)皮細胞通過釋放血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管的舒縮活動，然而各種原因?qū)е聝?nèi)皮細胞受損后，易發(fā)生動脈粥樣硬化、血管狹窄、堵塞等病理性改變[2]。由于損傷后內(nèi)皮細胞增殖和修復能力有限，骨髓中的內(nèi)皮祖細胞動員入血并誘導分化為內(nèi)皮細胞以修復受損血管[3]。Dight等[4]發(fā)現(xiàn)衰老導致循環(huán)內(nèi)皮祖細胞基線數(shù)量減少以及功能降低，內(nèi)皮祖細胞修復和更新受損血管的能力下降。

運動療法是防治心血管疾病的重要策略[5-6]。有氧運動對增齡所致心血管損傷的有益效應以及內(nèi)皮祖細胞的作用機制已得到廣泛證實[7-13]。抗阻訓練作為老年人運動處方的重要方式，具有增加肌肉含量、預防肌萎縮，提高骨密度和肌肉力量，預防跌倒與骨折[14]，同時通過釋放多種肌肉因子（如鳶尾素、白細胞介素-6等）調(diào)節(jié)遠隔器官（包括心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)）的功能[15-16]，因此同樣具有心血管保護作用，然而其是否通過內(nèi)皮祖細胞發(fā)揮健康效應仍未確定。據(jù)報道，衰老過程中肌肉含量下降（肌少癥）導致肌肉因子（如鳶尾素、白細胞介素-6等）釋放減少，從而間接影響內(nèi)皮祖細胞功能，而外源性補充鳶尾素可增加骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)量[17]。相較于有氧運動，抗阻訓練能夠促進肌肉因子大量分泌[15]，推測其理應對內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能產(chǎn)生有益作用。

微小核糖核酸（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約20～24 bp的非編碼單鏈RNA，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達參與細胞分化、發(fā)育、組織生長等諸多生理過程[18]。miR-21-5p廣泛存在于哺乳動物組織和器官中，對心血管功能起重要的調(diào)節(jié)作用。Mayourian等[19]發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體富含miR-21-5p，能有效增強心肌收縮力。Souza等[20]研究證實，運動上調(diào)心力衰竭小鼠內(nèi)皮祖細胞miR-21-5p表達量，提示運動可能通過調(diào)節(jié)miR-21-5p表達改善內(nèi)皮祖細胞功能。血小板反應蛋白（Thrombospondin 1，TSP-1）是內(nèi)源性血管生成抑制因子，對細胞衰老具有促進作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，增齡可誘導組織（尤其是心?。┲蠺SP-1表達上調(diào)，進而引起細胞功能減退并加速衰老進程[22]。進一步研究證實，TSP-1表達上調(diào)可能導致內(nèi)皮祖細胞功能和血管生成能力下降[23]。然而，衰老促進TPS-1表達與內(nèi)皮祖細胞功能降低之間的關系尚未厘清。Hu等[24]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細胞經(jīng)由外泌體途徑將miR-21-5p轉(zhuǎn)運至內(nèi)皮細胞，miR-21-5p通過下調(diào)TSP-1表達改善內(nèi)皮細胞功能。據(jù)此推測，miR-21-5p/TSP-1信號通路可能參與運動對內(nèi)皮祖細胞功能的調(diào)節(jié)。因此，本研究旨在觀察規(guī)律抗阻訓練對老年男性循環(huán)內(nèi)皮祖細胞功能的影響并探討miR-21-5p/TSP-1在其間的可能作用機理，為運動抗衰老效應提供理論基礎、有效方法和干預靶點。

1" 研究對象和方法

1.1" 研究對象

1）樣本量估算。

根據(jù)隨機設計兩個總體均數(shù)比較的樣本量估算公式：

其中n代表每組樣本量，Zα為α水平相應的標準正態(tài)變量，Zβ為1-β水平相應的標準正態(tài)變量，σ代表估計的標準差，δ代表差值，即兩組平均值的差值。本研究采用雙側(cè)檢驗，α水平為0.05，β水平為0.80，依據(jù)10%樣本流失率增加樣本，最終所需總樣本量為60例。

2）研究對象

招募重慶市某社區(qū)60～75歲老年男性60名。納入標準：（1）身心健康；（2）無規(guī)律運動習慣；（3）自愿參加本次研究，并且能堅持配合運動者。排除標準：（1）患有心腦血管、代謝和腎臟等疾??；（2）運動風險篩查為中、高危者；（3）骨骼肌肉系統(tǒng)急性慢性損傷及運動障礙者；（4）認知障礙；（5）長期服藥史以及吸煙酗酒等不良習慣者。所有人員均簽署知情同意書，本研究獲得吉林大學倫理委員會批準（NO.2023030701）。按照隨機數(shù)字表法將受試者分為對照組和運動組，兩組受試者入組前在年齡、身高、體重、體質(zhì)量指數(shù)、安靜心率、血壓、心血管疾病家族史等參數(shù)間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），組間具有可比性。

1.2" 實驗方法

對照組維持日常生活習慣，運動組進行12周漸進性抗阻訓練。分別于試驗前后，利用超聲診斷系統(tǒng)測定肱動脈血流介導的血管舒張功能（flow mediated dilation，F(xiàn)MD）；取外周血分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞，利用β-半乳糖苷酶染色法檢測衰老水平，MTT比色法、Matrigel管腔形成實驗分別檢測體外增殖和成管能力，通過裸鼠頸動脈內(nèi)膜拉脫模型檢測在體內(nèi)皮損傷修復能力，實時熒光定量PCR檢測miR-21-5p和TSP-1 mRNA表達量，免疫印跡法測定TSP-1蛋白表達量；通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染分別過表達miR-21-5p（miR-21-5p模擬物）和抑制TSP-1（TSP-1 siRNA）表達后，檢測內(nèi)皮祖細胞衰老和功能。

（1）血管內(nèi)皮功能測定。利用彩色超聲診斷系統(tǒng)（LOGIQ7型，美國GE公司）測定肱動脈FMD反映血管內(nèi)皮功能。受試者取仰臥位，以右側(cè)肘橫紋上5 cm肱動脈段為靶血管。先測量靜息時的肱動脈舒張末期內(nèi)徑D0，隨后通過血壓計袖帶加壓至200 mmHg完全阻斷血流5 min后迅速放氣，測定肱動脈舒張末期內(nèi)徑D1。用反應性充血前后肱動脈內(nèi)徑的變化率計算FMD（%）＝（D1－D0）÷D0×100%。

（2）外周血內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)和鑒定。內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)：分別于試驗前后清晨空腹狀態(tài)下肘正中靜脈取血20 mL，肝素抗凝。Ficoll密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞。用M199培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育，利用倒置顯微鏡（DM IL LED，德國徠卡公司）觀察細胞形態(tài)。內(nèi)皮祖細胞鑒定：利用吞噬實驗鑒定內(nèi)皮祖細胞。將單細胞懸液與Dil標記的乙?；兔芏戎鞍祝╝cetylated low density lipoprotein，ac-LDL）（Dil-ac-LDL）（20 μg/mL）溶液于37℃孵育120 min，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌后與FITC標記的荊豆凝集素1（ulex europaeus agglutinin-1，UEA-1）（FITC-UEA-1）（10 μg/mL）溶液中于37℃孵育60 min，甘油密封。激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8 X，德國徠卡公司）下隨機選取5個視野，計數(shù)雙染細胞數(shù)（即內(nèi)皮祖細胞）占總細胞數(shù)的百分比。

（3）細胞轉(zhuǎn)染試驗。按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國invitrogen公司）說明書，將miR-21-5p模擬物（用于過表達miR-21-5p）（引物設計：上游5′-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3′，下游5′-UCA ACA UCA GUC UGA UAA GCU A-3′）、模擬物陰性對照（引物設計：上游5′-UUU GUA CUA CAC AAA AGU ACU G-3′，下游5′-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA A-3′）以及TSP-1 siRNA（用于沉默TSP-1 mRNA）（引物設計：上游5′-GCC AGU AUG UUU ACA ACG UdTdT-3′，下游5′-ACG UUG UAA ACA UAC UGG CdTdT-3′）和siRNA對照（引物設計：上游5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，下游5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′）裝載脂質(zhì)體后轉(zhuǎn)染至運動組分離培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞中孵育72 h。設置非轉(zhuǎn)染空白對照。

（4）內(nèi)皮祖細胞衰老水平檢測。利用β-半乳糖苷酶染色法檢測內(nèi)皮祖細胞衰老水平。取單細胞懸液，加入0.5 mL β-半乳糖苷酶染色固定液于室溫下固定15 min。光學顯微鏡拍照，Image J軟件測定β-半乳糖苷酶陽性細胞占細胞總數(shù)的比例。

（5）內(nèi)皮祖細胞體外功能檢測。增殖能力：采用噻唑藍（MTT）比色法檢測內(nèi)皮祖細胞體外增殖能力。取單細胞懸液接種于包被有人纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入MTT（5 mg/mL）50 μL，向每孔加入二甲基亞砜200 μL，充分振蕩后利用全自動酶標儀（Multiskan FC，美國Thermo公司）于波長490 nm處測定吸光度（optical density，OD）值。成管能力：采用Matrigel管腔形成實驗檢測內(nèi)皮祖細胞體外成管能力。將Matrigel膠預鋪在預冷的96孔板中，取100 μL細胞懸液均勻接種到孔板中，37℃ 孵育24 h。倒置顯微鏡（DM IL LED，德國徠卡公司）下隨機選取5個視野，拍照后采用Image J圖像分析軟件計算血管總長度。

（6）內(nèi)皮祖細胞在體（體內(nèi)）內(nèi)皮損傷修復能力測定。取10只8～10周齡裸鼠，腹腔麻醉后肝素抗凝，頸部正中切口游離、暴露右側(cè)頸動脈后，血管夾夾住頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈起始端。在近端頸外動脈上剪開小口，插入直徑0.4 mm的金屬導絲至頸總動脈，旋轉(zhuǎn)進出3次后退出并逐層縫合頸部切口。取內(nèi)皮祖細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整至5×105/100 μL，頸動脈內(nèi)膜損傷模型建立后3 h，通過尾靜脈注射100 μL。移植3天后裸鼠腹腔麻醉，經(jīng)尾靜脈注射5%伊文思藍溶液100 μL進行血管染色，分離右頸總動脈，顯微鏡（DM IL LED，德國徠卡公司）下觀察伊文斯藍染色情況并拍照，利用Image J圖像分析軟件對染色區(qū)域行定量分析。

（7）內(nèi)皮祖細胞miR-21-5p和TSP-1 mRNA基因表達檢測。RT-qPCR法檢測內(nèi)皮祖細胞miR-21-5p和TSP-1 mRNA基因表達量。TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應獲取cDNA。以cDNA為模板，利用RT-qPCR（7 500型實時熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司）擴增目的基因，擴增條件：95℃ 預變性5 min，92℃ 變性30 s，52℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃ 完全延伸5 min。引物序列設計如下：miR-21-5p（上游：5′-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3′，下游：5′- UCA ACA UCA GUC UGA UAA GCU A-3′）；TSP-1（上游：5′-GCC AGA TGAC AAG TTC CAA G-3′，下游：5′-CTG ACA CCA CTT GCT GCT TC-3′）；U6（上游：5′-CAG CAC ATA TAC TAA AAT TGG AAC-3′，下游：5′-ACG AAT TTG CGT GTC ATC C-3′）；GAPDH（上游：5′-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3′，下游：5′-TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3′）。記錄各樣本循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），以U6和GAPDH分別作為miR-21-5p和TSP-1的內(nèi)參基因，采用2﹣ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

（8）內(nèi)皮祖細胞TSP-1蛋白表達量測定。

采用免疫印跡法測定內(nèi)皮祖細胞TSP-1蛋白表達量。收集細胞，提取總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白含量。十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進行蛋白分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶37℃ 封閉1 h。TSP-1一抗（稀釋比1︰500，英國Abcam公司，貨號：ab267388）4℃ 孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗（稀釋比1︰5 000，武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1058）室溫孵育1 h。洗膜后電化學發(fā)光試劑顯影，凝膠成像儀采集圖像，Image Pro Plus 6.0圖像軟件分析蛋白條帶光密度值，以β-actin（稀釋比1︰5000，英國Abcam公司，貨號：ab8226）為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。

1.3" 訓練方案

運動組受試者進行每周3次，共12周的抗阻訓練。采用自由重量（啞鈴）、固定器械和自重訓練3類練習，共10個動作。自由重量類動作包括仰臥飛鳥（胸大肌）、俯身雙臂劃船（背闊肌）、側(cè)平舉（三角肌）、前臂彎舉（肱二頭?。?、頸后臂屈伸（肱三頭?。┖吞狨啵ㄐ⊥热^?。?；固定器械類包括坐姿腿屈伸（股四頭肌）、俯臥小腿彎舉（腘繩肌）；自重訓練類包括平板支撐和卷腹（腹?。＿\動強度采用對老年人群安全有效的10～15 RM（最大重復次數(shù)），結(jié)合主觀疲勞感覺（RPE）評分（11～15）監(jiān)控和調(diào)整訓練負荷。每個動作重復10～15次為1組，組間間歇1～2 min，共完成2～3組。若受試者某一動作能完成15次以上，則增加此動作2.5%～5.0%的負重量。記錄受試者脫落以及運動計劃完成情況，用實際完成的運動次數(shù)占訓練計劃總次數(shù)的百分比表示患者的依從性。記錄運動期間以及運動后48 h內(nèi)發(fā)生的不良事件。

1.4" 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料（心血管疾病家族史）用“%”表示，組間比較使用卡方檢驗。計量資料用“均數(shù)±標準差”表示，組內(nèi)干預前后比較使用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，內(nèi)皮祖細胞增殖功能比較采用雙因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 訓練依從性和安全性評估

12周干預過程中，對照組3例（16.7%，原因：日程沖突、個人事務或無故失聯(lián)）、運動組1例（3.3%，原因：個人事務）脫落，最終56名受試者納入研究。運動組訓練計劃完成率（訓練依從性）為96.8%。運動組受試者僅在運動中和運動后出現(xiàn)氣喘、延遲性肌肉酸痛等癥狀，所有不良癥狀均較輕微，可繼續(xù)進行運動或在經(jīng)休息后緩解，無嚴重不良反應事件或心血管相關事件發(fā)生。

2.2" 兩組試驗前后血管內(nèi)皮功能比較

試驗前，兩組FMD比較差異無統(tǒng)計學意義（對照組（6.7±1.1）%，運動組（7.4±1.5）%，Pgt;0.05）。試驗后，與試驗前比較，運動組FMD升高，差異有顯著性意義（試驗前（7.4±1.5）%，試驗后（10.5±2.8）%，Plt;0.05），對照組無統(tǒng)計學意義（試驗前（6.7±1.1）%，試驗后（7.0±1.6）%，Pgt;0.05）；組間比較，運動組FMD高于對照組，差異有顯著性意義（對照組（7.0±1.6）%，運動組（10.5±2.8）%，Plt;0.05）。

2.3" 內(nèi)皮祖細胞鑒定

倒置顯微鏡觀察顯示，培養(yǎng)3天時貼壁的單核細胞并呈現(xiàn)紡錘形，7天時紡錘形細胞形成細胞集落。培養(yǎng)7天時利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Dil-ac-LDL陽性細胞呈紅色，F(xiàn)ITC-UEA-1陽性細胞呈現(xiàn)綠色，雙陽性細胞呈黃色（即內(nèi)皮祖細胞，約占91.7%）。

2.4" 抗阻訓練對內(nèi)皮祖細胞衰老水平、體外體內(nèi)功能及miR-21-5p/TSP-1基因表達的影響

1）兩組試驗前后內(nèi)皮祖細胞衰老水平比較。

試驗前，兩組內(nèi)皮祖細胞β-半乳糖苷酶陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（對照組（45.1±6.8）%，運動組（43.9±6.1）%，Pgt;0.05）。試驗后，與試驗前比較，運動組β-半乳糖苷酶陽性細胞下降，差異有顯著性意義（試驗前（43.9±6.1）%，試驗后（27.4±5.3）%，Plt;0.05），對照組差異無統(tǒng)計學（試驗前（45.1±6.8）%，試驗后（49.2±7.3）%，Pgt;0.05）；組間比較，運動組β-半乳糖苷酶陽性細胞低于對照組，差異有顯著性意義（對照組（49.2±7.3）%，運動組（27.4±5.3）%，Plt;0.05）。

2）兩組試驗前后內(nèi)皮祖細胞體外功能比較。

試驗前，兩組內(nèi)皮祖細胞體外增殖（對照組（0.87±0.04），運動組（0.83±0.09），Pgt;0.05）和成管（對照組（215.2±38.6） mm，運動組（201.7±40.9） mm，Pgt;0.05）能力比較，差異無統(tǒng)計學意義。試驗后，與試驗前比較，運動組增殖（試驗前（0.83±0.09），試驗后（1.25±0.06）Plt;0.05）和成管（試驗前（201.7±40.9） mm，試驗后（311.2±51.3） mm，Plt;0.05）能力升高，差異有顯著性意義，對照組差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；組間比較，運動組增殖（對照組（0.92±0.07），運動組（1.25±0.06），Plt;0.05）和成管（對照組（237.9±43.5） mm，運動組（311.2±51.3） mm，Plt;0.05）能力高于對照組，差異有顯著性意義。

3）兩組試驗前后內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)功能比較。

試驗前，兩組內(nèi)皮祖細胞在體內(nèi)皮損傷修復能力比較，差異無統(tǒng)計學意義（對照組（16.2±4.3）%，運動組（19.1±5.0）%，Pgt;0.05）。試驗后，與試驗前比較，運動組再內(nèi)皮化面積升高，差異有顯著性意義（試驗前（19.1±5.0）%，試驗后（68.5±8.8）%，Plt;0.05），對照組差異無統(tǒng)計學意義（試驗前（16.2±4.3）%，試驗后（18.5±4.7）%，Pgt;0.05）；組間比較，運動組再內(nèi)皮化面積高于對照組，差異有顯著性意義（對照組（18.5±4.7）%，運動組（68.5±8.8）%，Plt;0.05）。

4）兩組試驗前后內(nèi)皮祖細胞miR-21-5p/TSP-1基因表達比較。

試驗前，兩組內(nèi)皮祖細胞miR-21-5p/TSP-1基因表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。試驗后，與試驗前比較，運動組miR-21-5p表達升高70.7%，差異有顯著性意義（Plt;0.05），TSP-1 mRNA、蛋白表達分別下降42.5%和53.1%，差異有顯著性意義（Plt;0.05），對照組差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；組間比較，運動組miR-21-5p表達較對照組升高108.4%，差異有顯著性意義（Plt;0.05），TSP-1 mRNA、蛋白表達分別較對照組下降40.4%和52.1%，差異有顯著性意義（Plt;0.05）。

2.5" 轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物對內(nèi)皮祖細胞衰老水平、體外體內(nèi)功能的影響

1）內(nèi)皮祖細胞miR-21-5p和TSP-1表達的變化。

與空白對照比較，轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照后miR-21-5p和TSP-1表達，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物后miR-21-5p表達升高480.7%，差異有顯著性意義（Plt;0.05），TSP-1 mRNA、蛋白表達分別下降82.8%和64.2%，差異有顯著性意義（Plt;0.05）。

2）內(nèi)皮祖細胞衰老水平的變化。

與空白對照（12.3±3.5）%比較，轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照（15.2±4.1）%以及miR-21-5p模擬物（13.3±3.8）%后內(nèi)皮祖細胞β-半乳糖苷酶陽性率差異無顯著性意義 （Pgt;0.05）。

3）內(nèi)皮祖細胞體外功能的變化。

與空白對照比較，轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照后內(nèi)皮祖細胞體外增殖和成管能力差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物后增殖（（1.88±0.12） vs. （1.35±0.11），Plt;0.05）和成管（（287.3±45.9） mm vs. （178.2±29.8） mm，Plt;0.05）能力升高，差異有顯著性意義。

4）內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)功能的變化。

與空白對照比較，轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照后內(nèi)皮祖細胞在體內(nèi)皮損傷修復能力差異無統(tǒng)計學意義（（43.1±7.0）% vs. （39.2±5.8）%，Pgt;0.05），轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物后再內(nèi)皮化面積升高，差異有顯著性意義（（82.5±9.3）% vs. （39.2±5.8）%，Plt;0.05）。

2.6" 轉(zhuǎn)染TSP-1 siRNA對內(nèi)皮祖細胞衰老水平、體外體內(nèi)功能的影響

1）內(nèi)皮祖細胞miR-21-5p和TSP-1表達的變化。

與空白對照比較，轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照后miR-21-5p和TSP-1表達差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），轉(zhuǎn)染TSP-1 siRNA后miR-21-5p差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），TSP-1 mRNA、蛋白表達分別下降90.7%和73.5%，差異有顯著性意義（Plt;0.05）。

2）內(nèi)皮祖細胞衰老水平的變化。

與空白對照比較，轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照后內(nèi)皮祖細胞β-半乳糖苷酶陽性率差異無統(tǒng)計學意義（（15.2±3.5）% vs. （17.1±4.0）%，Pgt;0.05），轉(zhuǎn)染TSP-1 siRNA后β-半乳糖苷酶陽性細胞降低，差異有顯著性意義（（5.2±1.1）% vs. （17.1±4.0）%，Plt;0.05）。

3）內(nèi)皮祖細胞體外功能的變化。

與空白對照比較，轉(zhuǎn)染模siRNA陰性對照后內(nèi)皮祖細胞體外增殖和成管能力差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），轉(zhuǎn)染TSP-1 siRNA后增殖（（1.59±0.11） vs. （1.05±0.09），Plt;0.05）和成管（（262.8±45.3） mm vs. （152.5±22.6） mm，Plt;0.05）能力升高，差異有顯著性意義。

4）內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)功能的變化。

與空白對照比較，轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照后內(nèi)皮祖細胞在體內(nèi)皮損傷修復能力差異無統(tǒng)計學意義（（41.2±6.2）% vs. （35.6±5.3）%，Pgt;0.05），轉(zhuǎn)染TSP-1 siRNA后再內(nèi)皮化面積升高，差異有顯著性意義（（74.9±8.7）% vs. （35.6±5.3）%，Plt;0.05）。

3" 討論

研究旨在探討抗阻訓練對老年男性循環(huán)內(nèi)皮祖細胞功能的影響及其機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運動組受試者試驗后血管內(nèi)皮功能改善，內(nèi)皮祖細胞衰老水平下降，體內(nèi)體外功能升高，miR-21-5p表達上調(diào)而TSP-1表達下調(diào)；細胞轉(zhuǎn)染試驗證實，過表達miR-21-5p或沉默TSP-1均可提高內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)體外功能，然而僅沉默TSP-1能夠抑制其衰老進程。結(jié)果提示，規(guī)律抗阻訓練通過調(diào)控miR-21-5p/TSP-1通路改善老年男性內(nèi)皮祖細胞功能，通過下調(diào)TSP-1延緩內(nèi)皮祖細胞衰老。

衰老內(nèi)皮祖細胞增殖、遷移和定向分化為內(nèi)皮細胞以修復血管的能力均顯著降低[3-4]。據(jù)此推測，延緩內(nèi)皮祖細胞衰老，將有助于維持外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量以及血管修復功能。多項研究證實，長期有氧運動可有效延緩內(nèi)皮祖細胞衰老進程并改善其體外體內(nèi)功能，進而糾正血管內(nèi)皮紊亂[7-13]。本研究采用抗阻訓練方案同樣證實這一結(jié)論，說明不同運動方式對內(nèi)皮祖細胞和內(nèi)皮功能均具有有益效應。據(jù)報道，運動還提高內(nèi)皮祖細胞向受損血管部位的歸巢能力，進而分化為內(nèi)皮細胞并執(zhí)行修復功能[5]。結(jié)合本研究結(jié)果推測，延緩內(nèi)皮祖細胞衰老并改善其功能有助于細胞快速定位至血管受損部位，實現(xiàn)血管的快速增殖和修復，這對預防衰老所致的血管內(nèi)皮功能減退、降低心血管疾病發(fā)生率具有積極作用。

miR-21-5p/TSP-1與血管形成和修復有關[19]。有氧運動能夠上調(diào)miR-21-5p并下調(diào)TSP-1表達[20]，這在本研究中同樣得到印證，然而miR-21-5p/TSP-1與內(nèi)皮祖細胞之間的確切關聯(lián)仍未明確。本研究通過細胞轉(zhuǎn)染實驗證實，miR-21-5p通過調(diào)控TSP-1改善內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)體外功能，這對于內(nèi)皮祖細胞修復受損血管并糾正內(nèi)皮障礙、進而預防老年人心血管疾病發(fā)生具有重要意義。上述結(jié)果提示，抗阻訓練通過調(diào)控miR-21-5p/TSP-1信號途徑改善內(nèi)皮祖細胞功能。除調(diào)節(jié)細胞功能外，TSP-1還參與細胞衰老進程[23]。本研究在體實驗與細胞轉(zhuǎn)染實驗證實，抗阻訓練通過下調(diào)TSP-1表達延緩細胞衰老。然而令人意外的是，過表達miR-21-5p并未改變內(nèi)皮祖細胞衰老速率，這可能是因為miR-21-5p模擬物對TSP-1表達的抑制程度不足以顯著影響細胞衰老，提示抗阻訓練延緩內(nèi)皮祖細胞衰老可能是通過直接抑制TSP-1表達介導的。

本研究尚存在些許不足。第一，本研究樣本量較小，同時僅納入男性受試者，因此在應用研究結(jié)論時應持謹慎態(tài)度。第二，本研究重點關注抗阻訓練的效果，其他運動方式的療效不得而知，今后的研究應擴大樣本量并從臨床研究、動物實驗和細胞實驗等多個層面進一步探索不同運動方式（有氧運動、高強度間歇訓練、靜力性運動等）以及內(nèi)皮祖細胞移植對多種心血管疾病以及心血管危險因素的作用及機制，以形成針對特定人群或患者的最佳康復治療策略。

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