不同生長(zhǎng)年份牛大力根淀粉和蔗糖代謝途徑轉(zhuǎn)錄組分析

摘""要：牛大力是一種重要的多年生藥食同源植物，其主要成分為淀粉和糖類。為了探究不同生長(zhǎng)年份牛大力根淀粉和糖類物質(zhì)合成的規(guī)律及其內(nèi)在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究以3年生（NG3）、7年生（NG7）、10年生（NG10）和15年生（NG15）4個(gè)生長(zhǎng)年份的牛大力根為研究對(duì)象，測(cè)定總多糖、淀粉和蔗糖的含量，并完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選分析不同年份間牛大力根的差異表達(dá)基因（DEGs），重點(diǎn)解析淀粉和蔗糖代謝途徑DEGs的功能。糖類和淀粉物質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明，隨著年份的增長(zhǎng)，總多糖與淀粉含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，生長(zhǎng)至15年時(shí)的含量最高，而蔗糖含量在3年時(shí)最高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，隨著生長(zhǎng)年份跨度增加，NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15對(duì)比的DEGs總數(shù)呈上升趨勢(shì)，分別為526、1848和1937個(gè)。進(jìn)一步挖掘淀粉和蔗糖代謝途徑中的DEGs，共有62個(gè)DEGs在3個(gè)比較組中差異表達(dá)，其中，蔗糖合成基因的表達(dá)量隨年份增加而下降，淀粉合成基因隨年份的增加較淀粉降解基因占主導(dǎo)，纖維素降解酶隨年份增加表達(dá)量降低。最終篩選出5個(gè)淀粉和蔗糖代謝途徑的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，其表達(dá)變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。研究結(jié)果表明，牛大力在3～7年時(shí)處于生長(zhǎng)活躍期，以蔗糖、纖維素和淀粉的合成為主，促進(jìn)根部快速膨大發(fā)育。生長(zhǎng)至7年時(shí)，以淀粉的積累、蔗糖的分解和纖維素的降解為特征，進(jìn)入生長(zhǎng)平穩(wěn)期。本研究對(duì)于牛大力根膨大特性的研究、高成薯性牛大力種質(zhì)創(chuàng)新和科學(xué)采收都有積極的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：牛大力；根；生長(zhǎng)年份；淀粉；蔗糖代謝；轉(zhuǎn)錄組分析中圖分類號(hào)：S567.19""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Transcriptome"Analysis"Related"to"Starch"and"Sucrose"Metabolism"Pathways"of"C."specisoa"at"Different"Developmental"Stages

YANG"Qing1，"GU"Xuejin2，"WANG"Qinglong1，"ZHANG"Min3，"YAN"Xiaoxia1，"TANG"Huan1，"WANG"Zhunian1，"FENG"Shixiu3，"WANG"Maoyuan1*

1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Cultivation"of"Herb"Medicine"（Haikou），"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Tropical"Wild"Plant"Gene"Resource，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Provincial"Engineering"Research"Center"for"Tropical"medicinal"plants，"Haikou，"Hainan"571101，"China;""2."College"of"Tropical"Crops，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunnan"665001，"China;"3."Fairy"Lake"Botanical"Garden，"Shenzhen"amp;"Chinese"Academy"of"Sciences"/"Key"Laboratory"of"South"Subtropical"Plant"Diversity，"Shenzhen，"Guangdong"518004，"China

Abstract："Callerya"speciosa"is"an"important"perennial"medicinal"and"edible"plant，"with"starch"and"saccharides"as"the"main"contents."This"study"investigated"the"development"law"of"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"of"C."specisoa"at"different"developmentalnbsp;stages"and"its"internal"gene"regulatory"network."Four"growth"years"of"C."speciosa"roots，"including"3-year-old"（NG3），"7-year-old"（NG7），"10-year-old"（NG10），"and"15-year-old"（NG15），"were"used"as"the"research"objects."The"content"of"total"polysaccharide，"starch，"and"sucrose"was"determined，"and"transcriptome"sequencing"was"carried"out."Differentially"expressed"genes"（DEGs）"between"different"years"were"screened，"and"the"functions"of"DEGs"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"were"focused"on."The"results"showed"that"with"the"increase"of"years，"the"content"of"total"polysaccharides"and"starch"both"showed"an"increasing"trend，"with"the"highest"content"at"15"years，"while"the"sucrose"content"was"the"highest"at"3"years，"followed"by"a"downward"trend."Through"transcriptome"sequencing，"NG3"was"compared"with"NG7，"NG10，"and"NG15，"respectively，"for"intergroup"gene"expression"analysis."With"the"increase"of"the"growth"year"span，"the"total"number"of"DEGs"increased."To"further"explore"DEGs"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways，"a"total"of"62"DEGs"were"differentially"expressed"in"the"three"comparison"groups，"mainly"participating"in"the"regulation"of"starch，"sucrose，"and"cellulose"metabolism."Among"them，"the"expression"of"sucrose"synthesis"genes"decreased"with"the"increase"of"years;"the"expression"of"starch"synthesis"genes"dominated"over"starch"degradation"genes"with"the"increase"of"years;"and"the"expression"of"cellulose"degradation"enzymes"decreased"with"the"increase"of"years."Five"key"genes"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"were"screened"out"for"fluorescence"quantitative"PCR"verification，"and"the"expression"trend"was"basically"consistent"with"the"transcriptome"sequencing"results."The"results"indicate"that"C."speciosa"is"in"the"growth"active"period"from"3"to"7"years，"with"the"synthesis"of"sucrose，"cellulose，"and"starch"as"the"main"promoters"for"rapid"root"expansion"and"development."When"it"grows"to"7"years，"the"plant"enters"a"stable"growth"phase"characterized"by"starch"accumulation，"sucrose"decomposition，"and"cellulose"degradation."This"research"would"provide"valuable"insights"on"the"study"of"C."speciosa"root"expansion"mechanism，"the"innovation"of"high-yielding"varieties，"and"scientifically"guided"harvesting"practices.

Keywords："Callerya"speciosa;"root;"developmental"stages;"starch;"sucrose"metabolism;"transcriptome"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.003

牛大力為豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤[Callerya"speciosa"（Champion"ex"Bentham）"Schot]，是多年生藥食兩用植物，以根入藥，主產(chǎn)我國(guó)廣東、廣西和海南等地。牛大力是華南地區(qū)重要的煲湯食材，也是壯腰健腎丸、舒筋健腎丸的主要配伍藥材，具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺和強(qiáng)筋活絡(luò)的功能。牛大力現(xiàn)作為新資源食品，產(chǎn)品開(kāi)發(fā)類型多樣，市場(chǎng)需求旺盛，原料價(jià)格逐年上漲。人工種植是牛大力的主要來(lái)源，以廣東和和海南兩省種植面積較大。牛大力根兼有膨大根和非膨大根的雙重特征，一般栽培1年后側(cè)根開(kāi)始膨大，3年以上膨大根系發(fā)達(dá)，膨大達(dá)到一定程度方可采收。據(jù)報(bào)道，綜合產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和指標(biāo)成分含量，其最佳采收年限為5～7年左右，但在實(shí)際生產(chǎn)中亦有種植期在7～10年甚至以上的牛大力，民間習(xí)慣認(rèn)為，生長(zhǎng)年份越久，其根（膨大根）的品質(zhì)越高[1-4]。

利用基因組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，解析藥用植物的形態(tài)發(fā)育過(guò)程、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成和藥效物質(zhì)積累的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是當(dāng)前中藥產(chǎn)業(yè)科學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵步驟。近年來(lái)，基于全基因組解析的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析成為藥用植物研究熱點(diǎn)，包括人參、石斛、三七、丹參、銀杏、金銀花和當(dāng)歸等多種藥用植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已被分析獲取。牛大力含淀粉、粗纖維、蛋白質(zhì)和三萜、黃酮、酚苷等多種活性物質(zhì)，在生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，其外觀形態(tài)和內(nèi)在物質(zhì)積累都在發(fā)生階段性的變化。牛大力根系膨大調(diào)控的關(guān)鍵基因研究一直備受關(guān)注，無(wú)參轉(zhuǎn)錄組的分析取得了一系列的進(jìn)展，主要集中在淀粉合成基因、蔗糖代謝基因和黃酮類物質(zhì)生物合成關(guān)鍵基因方面[5-8]。研究結(jié)果表明，牛大力膨大根的形成和發(fā)育與淀粉、蔗糖、植物激素和細(xì)胞壁發(fā)育密切相關(guān)[9-10]。不同生長(zhǎng)年份牛大力根淀粉和多糖的動(dòng)態(tài)變化及其調(diào)控的分子機(jī)制，卻鮮有報(bào)道。

因此，本研究以3、7、10、15年株齡的牛大力塊根為研究對(duì)象，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，參考已發(fā)表的牛大力基因組數(shù)據(jù)[11]，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分類和功能注釋。以年份跨度為分組依據(jù)，篩選和富集差異表達(dá)基因和代謝通路。重點(diǎn)對(duì)牛大力發(fā)育過(guò)程中淀粉和蔗糖代謝途徑中的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析，并結(jié)合總多糖、淀粉和蔗糖含量的測(cè)定，解析牛大力發(fā)育過(guò)程中淀粉和蔗糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)情況和規(guī)律，以期能夠科學(xué)揭示牛大力品質(zhì)形成的規(guī)律，并為牛大力的精準(zhǔn)育種和品質(zhì)提升提供科學(xué)的依據(jù)，推動(dòng)其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1""材料與方法"

1.1""材料

研究材料采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所藥用植物資源圃，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院王祝年研究員鑒定為豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤[Callerya"speciosa"（Champion"ex"Bentham）"Schot]。于2021年10月，分別選擇3年生（NG3）、7年生（NG7）、10年生（NG10）和15年生（NG15）牛大力植株各9株，每3株牛大力的塊根合并為1份即1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生長(zhǎng)年份設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于RNA數(shù)據(jù)采集。具體取樣方法為：沿牛大力根際周邊開(kāi)挖，深度80～100"cm。采挖后選擇直徑4～8"cm的塊根，截取20"cm使用PBS水沖洗并擦拭干凈，再分別從前、中、后部迅速切取厚度0.5"cm的切片，包裹于錫箔紙中，做好標(biāo)記，置液氮罐冷凍，于24"h后轉(zhuǎn)入–80"℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2""方法

1.2.1""總多糖、淀粉和蔗糖含量測(cè)定""取不同年份牛大力的根樣本，使用Eyela"FDU-2110冷凍干燥機(jī)（日本EYELA東京理化器械株式會(huì)社）冷凍干燥后，研磨粉碎，使用Bio"Tek"EON多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司），按照總多糖、植物淀粉含量和蔗糖含量試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司）說(shuō)明書測(cè)定各組樣本中總多糖、淀粉和蔗糖含量。

1.2.2""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格執(zhí)行。首先使用TRI@Regent試劑盒提取牛大力根樣本的總RNA，經(jīng)純度、濃度和完整性檢測(cè)，質(zhì)檢合格后構(gòu)建cDNA文庫(kù)。使用Agilent"2100"bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的insert"size進(jìn)行檢測(cè)，庫(kù)檢合格后采用Illumina"NovaseqTM6000進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為雙端2×150"bp（PE150）。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，過(guò)濾去除帶接頭的reads、含N的reads和低質(zhì)量的reads后得到clean"reads。將clean"reads使用Hisat2進(jìn)行牛大力參考基因組比對(duì)，根據(jù)Hisat2的比對(duì)結(jié)果，使用StringTie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本并計(jì)算每個(gè)樣本中的所有基因的表達(dá)水平。

1.2.3"""差異表達(dá)基因分析""使用FPKM值對(duì)樣本基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化，根據(jù)比較組內(nèi)基因的表達(dá)情況進(jìn)行差異分析。以差異倍數(shù)（fold"change）≥2，即|log2"（Fold"Change）|≥1，且q值（p值的校正值）lt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因（differentially"expressed"genes，"DEGs）。通過(guò)完成對(duì)DEGs的整體分布情況、GO和KEGG分析，結(jié)合特定的KEGG通路和GO注釋等信息，對(duì)重要代謝通路及關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選。運(yùn)用SPSS"21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway"analysis，ANOVA），數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

1.2.4""實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析""從牛大力轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中篩選出5個(gè)在淀粉和蔗糖代謝途徑中表達(dá)量相對(duì)較高的關(guān)鍵基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。根據(jù)qPCR引物設(shè)計(jì)原則，使用Geneious軟件設(shè)計(jì)各候選基因的引物（表1），擴(kuò)增子長(zhǎng)度控制在120～200"bp之間，由蘇州金唯智生物科技有限公司完成引物合成。取不同年份牛大力的根為材料，以actin作為內(nèi)參，按照SYBR"Premix"Ex"Taq反應(yīng)體系[12]進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2–??Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)總體積20"μL，包括2×ChamQ"SYBR"Color"qPCR"Master"Mix"10"μL、Prime"1"0.4"μL、Primer"2"0.4"μL、50×"ROX"Reference"Dye"1"0.4"μL、Template"DNA/cDNA"5.8"μL、ddH2O"3"μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5"℃"30"s；95"℃"10"s，60"℃"30"s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后，以1"℃/"4"s"的速率從60"℃逐步遞增到95"℃，獲得溶解曲線。

2""結(jié)果與分析

2.1""不同生長(zhǎng)年份牛大力總多糖、淀粉和蔗糖含量的動(dòng)態(tài)變化

本研究前期發(fā)現(xiàn)，低年份（3～7年）的牛大力根處于快速膨大期，然后進(jìn)入高年份（10～15年）的穩(wěn)定生長(zhǎng)期，隨著年份的增長(zhǎng)，其外觀形態(tài)和物質(zhì)積累的差異不斷縮小，根的橫切面由低年份的黃色粗糙的纖維結(jié)構(gòu)向高年份白色細(xì)膩的淀粉結(jié)構(gòu)過(guò)度（圖1A），淀粉含量顯著增加[13]。通過(guò)測(cè)定不同生長(zhǎng)年份牛大力根中的總多糖、淀粉和蔗糖含量發(fā)現(xiàn)，隨著年份的增長(zhǎng)，總多糖與淀粉含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，而蔗糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖1B）?？偠嗵呛吭?～10年間平穩(wěn)增

長(zhǎng)，10～15年間顯著增長(zhǎng)（Plt;0.05）。與NG3比，總多糖含量在NG10和NG15中的增長(zhǎng)明顯，差異顯著（Plt;0.05）。淀粉在生長(zhǎng)過(guò)程中大量積累，其含量在3～10年間顯著增長(zhǎng)（Plt;0.05），10～15年間平穩(wěn)增長(zhǎng)，與NG3比，淀粉含量在NG7、NG10和NG15中的增長(zhǎng)明顯，差異顯著（Plt;0.05）。蔗糖含量在3～15年間隨著生長(zhǎng)年份增加逐漸下降，在相鄰階段變化不顯著，而與NG3比，蔗糖含量在NG10和NG15中的降低趨勢(shì)明顯，差異顯著（Plt;0.05）。結(jié)果表明，在淀粉和蔗糖代謝途徑中，蔗糖與總多糖和淀粉含量的積累整體呈負(fù)相關(guān)，可能是以淀粉-蔗糖相互轉(zhuǎn)化為主要模式[14-16]。

2.2""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

基于Illumina測(cè)序平臺(tái)，對(duì)4個(gè)生長(zhǎng)年份的牛大力根樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總共獲得了80.66"Gb的clean"bases。各樣品clean"data的Q20的比率均超過(guò)了97.97%，Q30的比率均超過(guò)了93.83%，說(shuō)明RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，測(cè)序數(shù)據(jù)可靠度高，掃描下方二維碼（圖2），可查看轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)12個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行參考基因組比對(duì)分析，共獲得41"461個(gè)基因和62"501個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)數(shù)據(jù)，基因比對(duì)的匹配率在79.10%～"85.84%之間。表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，基因的注釋率高，能夠開(kāi)展后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

2.3""差異表達(dá)基因篩選分析

2.3.1""差異基因表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)""本研究對(duì)4個(gè)年份牛大力根的轉(zhuǎn)錄組樣本進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEGs）篩選，將NG3分別與NG7、NG10和NG15對(duì)比，進(jìn)行組間基因的表達(dá)情況分析。由3個(gè)比較組中篩選的DEGs數(shù)量及其上、下調(diào)表達(dá)情況（圖3A）可知，在3～15年的生長(zhǎng)時(shí)期，隨著生長(zhǎng)年份跨度增加，DEGs總數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且各組上調(diào)與下調(diào)基因的比例有一定的變化。其中，在NG3"vs"NG7組中DEGs數(shù)量最少，有526個(gè)（205個(gè)上調(diào)和321個(gè)下調(diào)）；而另外2組的DEGs總數(shù)明顯增加，NG3"vs"NG10組中有1848個(gè)，以上調(diào)DEGs為主；NG3"vs"NG15組有1937個(gè)，下調(diào)DEGs數(shù)量增加，可能與單糖、多糖和淀粉的合成有關(guān)。

進(jìn)一步分析3個(gè)比較組中DEGs的重疊和特異性情況（圖3B）發(fā)現(xiàn)，3組共有DEGs僅有83個(gè)，NG3"vs"NG7組和其他2組的DEGs重疊部分相對(duì)較少，分別有86個(gè)和93個(gè)，而NG3"vs"NG10組和NG3"vs"NG15組之間重疊最多，有580個(gè)；各組特有DEGs以NG3"vs"NG7組的數(shù)量最少（264個(gè)），而另外2組的特有DEGs數(shù)量更多，NG3"vs"NG15組有1181個(gè)，NG3"vs"NG10組有1099個(gè)。結(jié)果說(shuō)明，隨著生長(zhǎng)年份跨度增加，DEGs的數(shù)量明顯增加，牛大力不同生長(zhǎng)階段內(nèi)在物質(zhì)發(fā)生著明顯的變化。

2.3.2""差異表達(dá)基因的功能富集分析""對(duì)3個(gè)比較組NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15富集的GO"term差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋，結(jié)果分為生物過(guò)程（biological"process）、細(xì)胞組分（cellular"component）和分子功能（molecular"function）。在3個(gè)比較組中，均以生物學(xué)過(guò)程類別注釋GO"term的最多，將3個(gè)類別前25、前15、前10的GO"term進(jìn)行展示（圖4），細(xì)胞組分中含有DEGs數(shù)目較多。進(jìn)一步根據(jù)富集程度對(duì)前20的GO"term進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)比較組中共有條目多與細(xì)胞壁發(fā)育以及木質(zhì)素、木聚糖等相關(guān)物質(zhì)的代謝活動(dòng)有關(guān)（圖5）。其中，在NG3"vs"NG7組中顯著富集的GO"term主要有調(diào)節(jié)防御反應(yīng)（regulation"of"defense"response）、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性（glucose-1-phosphate"adenylyltransferase"activity）和對(duì)強(qiáng)光照的反應(yīng)（response"to"high"light"intensity）等；在NG3"vs"NG10組中有糖基轉(zhuǎn)移酶活性（glycosyltransferase"activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase"activity）、作用于金屬離子（acting"on"metal"ions）等；NG3"vs"NG15組是年份跨度最大的比較組，顯著富集于苯丙素生物合成過(guò)程（phenylpropanoid"bios ynthetic"process）、晝夜節(jié)律（circadian"rhythm）和次生代謝物生物合成過(guò)程（secondary"metabolite"biosynthetic"process）。

KEGG富集分析結(jié)果中位居前20的pathway如圖6所示，3個(gè)比較組中均顯著富集的pathway為單萜生物合成（monoterpenoid"biosynthesis），2組共富集的pathway有苯丙素生物合成（phenylpropanoid"biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（starch"and"sucrose"metabolism）、氨基酸糖和核苷酸糖（amino"sugar"and"nucleotide"sugar"metabolism）、苯丙氨酸（phenylalanine"metabolism）以及果糖和甘露糖、亞油酸代謝和植物的晝夜節(jié)律等。

GO和KEGG富集分析結(jié)果表明，在牛大力根的不同生長(zhǎng)階段，DEGs與細(xì)胞壁發(fā)育及其關(guān)聯(lián)物質(zhì)的代謝活動(dòng)相關(guān)，主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝、糖合成和次生代謝物合成相關(guān)途徑。說(shuō)明不同年份的牛大力根的差異主要體現(xiàn)

在碳水化合物和活性物質(zhì)的積累方面。本研究前期發(fā)現(xiàn)，隨著生長(zhǎng)年份的增加，牛大力根的橫切面由黃色粗糙的纖維結(jié)構(gòu)（低年份）向白色細(xì)膩的淀粉結(jié)構(gòu)（高年份）過(guò)度，淀粉含量顯著增加[17]。因此，進(jìn)一步圍繞牛大力根淀粉和蔗糖代謝途徑（map"00500）中相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行研究。

2.4""淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達(dá)基因分析

2.4.1""淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達(dá)基因篩選""在牛大力根的4個(gè)生長(zhǎng)階段，注釋到511個(gè)KEGG通路上的unigenes參與淀粉和蔗糖代謝。將NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15三個(gè)比較組進(jìn)行分析，共篩選到62個(gè)DEGs，NG3"vs"NG15組中最多，有38個(gè)DEGs，21個(gè)上調(diào)，17個(gè)下調(diào)；其次是NG3"vs"NG10組，有35個(gè)DEGs，以上調(diào)為主（28個(gè)）；NG3"vs"NG7組最少，有18個(gè)DEGs，以下調(diào)為主（13個(gè)）。由圖7A可知，3個(gè)比較組共有的DEG只有1個(gè)，特有的DEGs，NG3"vs"NG7組有8個(gè)，NG3"vs"NG10組有14個(gè)，NG3"vs"NG15組有12個(gè)。共有45個(gè)DEGs與淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)，詳細(xì)的基因注釋信息見(jiàn)圖8（掃描二維碼，即可查看）。進(jìn)一步通過(guò)層析聚類熱圖（圖7B）進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，分析DEGs在3個(gè)比較組中的表達(dá)情況。富集到淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs中，NG3中顯著上調(diào)的DGEs相對(duì)較多，與NG7、NG10和NG15的表達(dá)情況差異較大，與NG7中的DGEs有一定的關(guān)聯(lián)；另外3個(gè)年份中以NG10的DEGs最少，鄰近年份之間有少量DEGs有一定的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，在牛大力根的不同生長(zhǎng)階段，富集到淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs多為編碼植物糖代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶基因。在生長(zhǎng)年份跨度增大的2個(gè)比較組NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15中，DEGs總數(shù)和特有數(shù)目均增加，與糖代謝關(guān)鍵酶基因存在階段性的特異表達(dá)，催化淀粉和蔗糖代謝途徑中重要代謝物的合成、分解及相互轉(zhuǎn)化。

2.4.2""淀粉和蔗糖代謝途徑差異基因表達(dá)趨勢(shì)""基于上述層次聚類熱圖分析，參與淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs在牛大力根的4個(gè)生長(zhǎng)階段有不同的表達(dá)譜，結(jié)合FPKM平均值（掃描圖9二維碼，即可查看）進(jìn)行表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)上述DEGs在調(diào)控淀粉、蔗糖和纖維素的代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。表明不同年份牛大力的形態(tài)發(fā)育和物質(zhì)積累與多糖和淀粉的合成和積累密切相關(guān)。

與蔗糖和海藻糖代謝相關(guān)的DEGs有4個(gè)，其中有3個(gè)為編碼蔗糖合酶（sucrose"synthase，"SUS）的相關(guān)基因，1個(gè)注釋為類蔗糖合酶（EC：2.4.1.13，Ms8g_050410），2個(gè)注釋為蔗糖合酶2（EC：2.4.1.13，Ms8g_045820、Ms8g_045830）；另有1個(gè)為調(diào)控海藻糖磷酸合酶（trehalose"phosphate"synthase，"TPS）的基因，注釋為α，α-海藻糖磷酸合酶（EC：2.4.1.15，EC：3.1.3.12，Ms2g_044990）。SUS和TPS的表達(dá)量隨年份增長(zhǎng)而下降，結(jié)果說(shuō)明蔗糖的合成隨年份增加而下降，與蔗糖含量的變化趨勢(shì)整體一致。

與淀粉代謝相關(guān)的DEGs有11個(gè)，主要涉及淀粉合成、淀粉降解相關(guān)基因。淀粉合成涉及直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成，相關(guān)DEGs包括：3個(gè)編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose"pyrophsphorylase，"AGPase）的基因，注釋為葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶大亞基"1（EC：2.7.7.27，Ms3g_020500、Ms6g_001720）和葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶小亞基1（EC：2.7.7.27，Ms2g_"025280）；2個(gè)編碼顆粒結(jié)合淀粉合酶（granule-"bound"starch"synthase，"GBSS）相關(guān)的基因（EC：2.4.1.242，Ms3g_079780、Ms3g_073120）；1個(gè)編碼可溶性的淀粉合成酶（Soluble"starch"ynthase，"SSS）的基因（EC：2.4.1.21，Ms6g_016280）；2個(gè)編碼淀粉分支酶（starch"branching"enzyme，"SBE）基因，注釋為α-1，4葡聚糖分支酶（EC：2.4.1.18，Ms6g_002530、Ms1g_035490）。該類基因中以AGPase、GBSS和SBE相對(duì)高表達(dá)，多數(shù)在NG7中的表達(dá)量最高，與NG3比，多為上調(diào)表達(dá)。

與淀粉降解相關(guān)DEGs包括：1個(gè)編碼α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan"phosphorylase，"α-GP）相關(guān)的基因（EC：2.4.1.1，Ms7g_026770）；1個(gè)編碼支鏈淀粉酶（starch"debranching"enzyme，"DBE）相關(guān)的基因，注釋為普魯蘭酶1（EC：3.2.1.68，Ms3g_073160）；1個(gè)編碼β-淀粉酶（β-amylase，"BAM）相關(guān)的基因，注釋為β-淀粉酶"3（EC：3.2.1.2，Ms5g_038700）。該類基因中α-GP和DBE在NG7的表達(dá)量達(dá)到最高，與NG3比，均為上調(diào)表達(dá)；而B(niǎo)AM在NG3中表達(dá)量最高，隨年份增長(zhǎng)整體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。淀粉代謝相關(guān)DEGs分析發(fā)現(xiàn)，淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于淀粉降解相關(guān)基因，結(jié)合高年份材料淀粉含量顯著高于低年份的情況，說(shuō)明牛大力根在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，淀粉的合成占主導(dǎo)地位。

與纖維素降解相關(guān)的DEGs有14個(gè)，在各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，表達(dá)量隨年份增加整體呈降低的趨勢(shì)，多數(shù)在NG3中高表達(dá)，在NG10和NG15中低表達(dá)。其中，有5個(gè)編碼β-葡糖苷酶（β-glucosidase，"BG）相關(guān)的基因，注釋為β-葡萄糖苷酶47（EC：3.2.1.21，Ms8g_039920）和一系列的類β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，Ms7g_004420、Ms5g_053900、Ms8g_024030、Ms8g_024960）；有9個(gè)為編碼內(nèi)切葡聚糖酶（endo-glucanase，"EG）相關(guān)的基因，注釋為類內(nèi)切葡聚糖酶10"EC：3.2.1.4，Ms6g_003490），以及一系列的類葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，Ms8g_024030、Ms6g_001900、Ms3g_027870）和葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，Ms2g_017160、Ms2g_027520、Ms7g_000800、Ms8g_042240、Ms3g_035050）。

2.5""熒光定量PCR驗(yàn)證

基于牛大力淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達(dá)基因分析結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[12，"18-20]，篩選5個(gè)與淀粉和蔗糖代謝途徑的關(guān)鍵酶基因（Ms6g_002530、Ms1g_035490、Ms3g_079780、Ms6g_001720、Ms8g_050410）進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，分析驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，上述驗(yàn)證基因在牛大力不同年份的表達(dá)變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致（圖10），淀粉合成酶基因表達(dá)整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在生長(zhǎng)至7年后表達(dá)顯著增加（Plt;0.05）；蔗糖合酶基因表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在生長(zhǎng)至高年份（15年）表達(dá)顯著降低（Plt;0.05）。

3""討論

本研究基于資源圃保育的3～15年的牛大力種質(zhì)資源，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3年生、7年生、10年生和15年生的牛大力根進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并參考牛大力基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因的注釋和差異基因的挖掘，重點(diǎn)對(duì)淀粉和蔗糖代謝通路相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，闡明牛大力發(fā)育過(guò)程中外在形態(tài)塊根與內(nèi)在物質(zhì)淀粉和多糖積累之間的密切關(guān)系及其潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨著牛大力生長(zhǎng)年份的增加，根中差異表達(dá)基因的數(shù)量呈增加趨勢(shì)，功能定位于細(xì)胞壁發(fā)育、糖代謝和其他次生代謝物的合成，有多個(gè)進(jìn)程與碳水化合物代謝相關(guān)。結(jié)合種植中對(duì)牛大力的觀察，其根在多年生長(zhǎng)中會(huì)經(jīng)歷快速膨大直至穩(wěn)定增粗的過(guò)程，并且年份越高的根越粉越細(xì)膩。推測(cè)存在2方面的原因，一是地上部分光合產(chǎn)物碳水化合物運(yùn)送到根部轉(zhuǎn)化為淀粉積累起來(lái)，二是存在部分纖維素降解后向淀粉轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。差異表達(dá)基因的通路分析結(jié)果證實(shí)，淀粉和糖代謝途徑中的多種酶的表達(dá)有顯著差異，涉及淀粉合成、蔗糖代謝、纖維素代謝和可溶性糖-多糖的相互轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵酶基因。

淀粉和蔗糖是牛大力塊根中最主要的多糖和可溶性糖[21]。隨著牛大力比較組中生長(zhǎng)年份跨度增加，鑒定的淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)差異表達(dá)基因數(shù)量更多。SUS在低年份，即3年生牛大力的中表達(dá)量最高，并表現(xiàn)為合成蔗糖，參與細(xì)胞壁構(gòu)建和呼吸消耗等生物過(guò)程。隨著生長(zhǎng)年份增加，SUS發(fā)揮催化蔗糖分解作用，參與淀粉和纖維素等合成，促進(jìn)根的膨大和淀粉的積累。結(jié)合蔗糖含量的變化，發(fā)現(xiàn)隨著年份增加牛大力根中可溶性糖合成顯著減少，前期積累的蔗糖也被分解，進(jìn)入為多糖?細(xì)胞壁與淀粉合成提供前體與底物途徑[22]。而淀粉代謝基因在高年份牛大力根中的表達(dá)相對(duì)更活躍，其中淀粉合成相關(guān)的酶基因AGPase、GBSS和SBE，在7年時(shí)的表達(dá)量顯著增加，而在10年和15年時(shí)表達(dá)下降且表達(dá)量的差異縮小，表明牛大力生長(zhǎng)期間均有淀粉的合成。其中AGPase作為淀粉生物合成途徑中主要調(diào)控位點(diǎn)對(duì)淀粉積累和組成具有決定性作用[12，"19]，其在NG7中的表達(dá)明顯增高，說(shuō)明7年時(shí)淀粉合成已經(jīng)進(jìn)入高速合成時(shí)期，此后隨年份增加逐漸平緩。淀粉降解相關(guān)的基因α-GP亦有同樣的趨勢(shì)，結(jié)合另一個(gè)主要的淀粉降解酶基因BAM3始終處于低表達(dá)狀態(tài)，說(shuō)明淀粉的合成和降解是同步進(jìn)行的，并以合成占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。類β-葡萄糖苷酶EC和內(nèi)切葡聚糖酶EG將纖維素降解為二糖，再經(jīng)β-葡糖苷酶BG水解為葡萄糖。上述纖維素酶相關(guān)達(dá)，此后逐漸降低最后趨于平穩(wěn)，說(shuō)明在牛大力淀粉和蔗糖代謝途徑中，在3～7年時(shí)可能是通過(guò)β-葡萄糖苷酶促進(jìn)纖維素降解，從而影響葡萄糖的合成，為根部的膨大提供能量和碳骨架[10，"23]基因BG和EG，均在牛大力生長(zhǎng)至3～7年時(shí)高表達(dá)。而在生長(zhǎng)至10～15年時(shí)，其表達(dá)量顯著降低，可能更有利于淀粉的儲(chǔ)藏。

淀粉和纖維素是碳水化合物重要的形式，可用于能量存儲(chǔ)和提供碳骨架支撐，也能被α-葡聚糖磷酸化酶、β-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切葡聚糖酶等一系列酶降解并釋放能量，在特定的時(shí)期用于植物生長(zhǎng)發(fā)育[23-25]。因此，牛大力中淀粉和纖維素降解DEGs，在低年份表達(dá)相對(duì)活躍，而隨著年份增加表達(dá)量顯著下降，可能是在相關(guān)基因的調(diào)控下減少對(duì)淀粉的水解。因此，牛大力塊根生長(zhǎng)至3年左右，其蔗糖含量處于較高水平，根膨大后其所含的可溶性糖（蔗糖）含量逐漸降低，而多糖（淀粉）和纖維素含量升高，糖類物質(zhì)在不同的發(fā)育時(shí)期相互轉(zhuǎn)化，以不同的形式存在，影響著其塊根的生長(zhǎng)發(fā)育，與前期研究結(jié)果基本一致[1-4，"15]。

綜上所述，為了在牛大力不同的生長(zhǎng)階段維持糖類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，參與蔗糖、淀粉和纖維素代謝的DEGs在各階段差異表達(dá)，通過(guò)調(diào)控蔗糖分解、葡萄糖合成、淀粉的合成與分解等復(fù)雜的糖代謝，牛大力在3～7年時(shí)處于生長(zhǎng)活躍期，以糖原生物合成為主為促進(jìn)根部快速膨大發(fā)育發(fā)揮作用，包括蔗糖的合成，纖維素的合成。生長(zhǎng)至7年時(shí)，以淀粉的合成、蔗糖的分解，纖維素的降解為特征極為活躍，隨后則進(jìn)入生長(zhǎng)的平穩(wěn)期。本研究結(jié)合相關(guān)研究[2，"5，"15，"18，"26-28]，綜合產(chǎn)量、種植投入、經(jīng)濟(jì)效益、物質(zhì)合成、品質(zhì)形成等因素，進(jìn)一步證明牛大力生長(zhǎng)至5～7年采收更為科學(xué)。

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