油茶KAS基因家族的鑒定及表達(dá)分析

摘""要：β-酮脂酰ACP合成酶（beta-ketoacyl-acyl"carrier"protein"synthase，"KAS）是植物脂肪酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶系。為探究KAS在油茶種子成熟和油脂積累中的作用，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)CoKAS基因家族成員進(jìn)行鑒定，分析其理化性質(zhì)、染色體定位、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、保守基序、啟動(dòng)子順式作用元件，并采用RT-qPCR技術(shù)分析油茶果實(shí)油脂快速積累期的表達(dá)模式。結(jié)果表明：鑒定出的14個(gè)CoKAS家族成員分布在7條染色體上，相對(duì)分子質(zhì)量在1.13～5.15"kDa之間，且大部分為酸性穩(wěn)定蛋白。除CoKAS"II-2定位于線粒體和葉綠體外，其余均定位于葉綠體。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示CoKAS基因被分為3個(gè)亞類，同一亞族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序具有相似性。CoKAS基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域富含與生長(zhǎng)發(fā)育、光響應(yīng)、激素誘導(dǎo)和脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。通過(guò)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，大部分CoKAS基因在油茶種子油脂快速積累期的表達(dá)量較高。此外，在油茶果實(shí)成熟過(guò)程中，CoKAS與CoMYB基因家族間存在有較強(qiáng)相關(guān)性的成員。本研究結(jié)果為深入解析CoKAS基因在油茶油脂生物合成中的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油茶；CoKAS基因家族；生物信息學(xué)；表達(dá)分析中圖分類號(hào)：S794.4""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identification"and"Expression"Profile"Analysis"of"KAS"Gene"Family"in"Camellia"oleifera

LIU"Xiaoxia，"YU"Zihao，"JING"Huiyang，"XIONG"Kaifeng，"QIN"Zuodong*

College"of"Chemistry"and"Bioengineering，"Hunan"University"of"Science"and"Engineering"/"Hunan"Engineering"Technology"Research"Centernbsp;for"Comprehensive"Development"and"Utilization"of"Biomass"Resources，"Yongzhou，"Hunan"425199，"China

Abstract："Beta-ketoacyl-acyl"carrier"protein"synthase"（KAS）"is"the"key"enzyme"system"in"plant"fatty"acid"biosynthesis."In"order"to"investigate"the"function"of"the"KAS"gene"family"in"the"maturation"and"oil"accumulation"of"Camellia"oleifera，"this"study"used"bioinformatics"methods"and"analyzed"ther"physicochemical"properties，"chromosomal"localization，"subcellular"localization，"secondary"structure，"phylogenetic"trees，"conserved"motifs，"promoter"cis-acting"elements，"and"RT-qPCR"to"analyze"the"expression"patterns"in"the"oil"rapid"accumulation"stage"of"C."oleifera."The"findings"indicated"that"14"Camellia"oleifera"KAS"family"members"were"distributed"on"seven"chromosomes"with"relative"molecular"masses"between"1.13"kDa"and"5.15"kDa，"and"most"of"them"were"acid-stabilized"proteins."Except"for"CoKAS"II-2，"which"was"localized"in"mitochondria"and"chloroplasts，"all"of"them"were"localized"in"chloroplasts."Phylogenetic"analysis"revealed"that"CoKAS"was"divided"into"three"subclasses，"with"similarities"in"structure"and"conserved"motifs"among"KAS"family"numbers"in"the"same"subfamily."The"promoter"regions"of"the"CoKAS"gene"family"members"were"enriched"with"the"cis-acting"elements"growth"and"development-related，"light"response，"hormone"induction，"and"adversity"response."Expression"analysis"revealed"that"most"of"the"CoKAS"genes"were"highly"expressed"during"the"oil"rapid"accumulation"stage."In"addition，"it"was"found"a"strong"correlation"between"the"members"of"the"CoKAS"and"CoMYB"gene"families"during"fruit"ripening"in"C."oleifera."The"findings"would"provide"a"theoretical"basis"for"comprehensively"analyzing"the"function"of"CoKAS"genes.

Keywords："Camellia"oleifera;"CoKAS"gene"family;"bioinformatics;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.002

β-酮脂酰ACP合成酶（beta-ketoacyl-acyl"carrier"protein"synthase，"KAS）是植物脂肪酸從頭合成過(guò)程中碳鏈延伸的關(guān)鍵酶系，催化脂?；?CoA或脂酰基-ACP分子之間C-C鍵形成[1]。該酶由N端和C端蛋白結(jié)構(gòu)域組成，活性位點(diǎn)位于這2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。N端結(jié)構(gòu)域包含參與二聚體形成的結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基，與C端結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)底物的識(shí)別、催化反應(yīng)及產(chǎn)物的釋放[2]。在植物中，已鑒定出KAS"I、KAS"II和KAS"III三種KAS亞型，它們各司其職，共同協(xié)作完成脂肪酸鏈的延伸。KAS"III是脂肪酸合成起始階段的限速酶，以乙酰CoA和丙二酰CoA為底物，合成乙酰乙酰-ACP[3-4]。KAS"II則主要負(fù)責(zé)將棕櫚酸（C16：0-ACP）延伸為硬脂酸（C18：0-ACP），調(diào)控C16與C18脂肪酸的比例[5]。KAS"I能特異性地識(shí)別C4至C16長(zhǎng)度的?；?ACP，并促進(jìn)其碳鏈的延伸[6]。利用RNA干擾（RNA"interference，"RNAi）技術(shù)下調(diào)棉花種子中g(shù)hKAS2基因的表達(dá)，可以顯著提高棉籽中棕櫚酸（C16：0）的含量，并使其性狀穩(wěn)定遺傳給后代，同時(shí)不影響種子的發(fā)芽率[5]。水稻OsKASI-2基因的敲除導(dǎo)致細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度降低，進(jìn)而增強(qiáng)了水稻對(duì)低溫的敏感性，影響其抗寒能力[6]。在擬南芥中，過(guò)表芝麻SiKASI可導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞中油脂的異常積累，并與一種腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC"transporter）相互作用，從而調(diào)控花粉的發(fā)育[7]。此外，將麻風(fēng)樹(shù)JcKASIII基因過(guò)表達(dá)于野生型以及KASI或KASII基因敲低的擬南芥突變體中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明其種子油組成發(fā)生顯著性變化[8]。綜上表明，KAS基因家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答中起著重要的作用。

油茶（Camellia"oleifera）是中國(guó)特有的優(yōu)質(zhì)木本油料樹(shù)種，廣泛分布于長(zhǎng)江流域至華南地區(qū)的山地丘陵，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[9]。油茶籽油含高達(dá)80%以上的不飽和脂肪酸（主要為油酸和亞油酸）[10]，營(yíng)養(yǎng)豐富，已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為重點(diǎn)推廣的健康型高級(jí)食用油。然而，現(xiàn)有油茶林產(chǎn)率較低，導(dǎo)致茶油價(jià)格居高不下，嚴(yán)重限制了油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。油脂積累是油茶籽品質(zhì)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，揭示其分子機(jī)制對(duì)于培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油茶品種具有重要意義。本研究基于油茶果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定CoKAS基因家族成員，并對(duì)其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、共線性、啟動(dòng)子序列、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式等進(jìn)行系統(tǒng)分析，為進(jìn)一步研究油茶KAS基因家族的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""油茶CoKAS家族成員鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載油茶種子發(fā)育不同時(shí)期段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRA登錄號(hào)：PRJNA668531），油茶全基因組序列信息從GitHub（https：//github."com/Hengfu-Yin/CON_genome_data）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取，利用Hisat2和StringTie軟件獲得轉(zhuǎn)錄本信息。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/"protein）中下載擬南芥KAS蛋白序列，采用blast-2.15.0+搜索其在油茶中的同源序列，閾值為1e-10。從Pfam（http：//pfam-"legacy.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載KAS結(jié)構(gòu)域PF00109（N端）和PF02801（C端）的hmmr文件；使用hmmer"3.4軟件對(duì)油茶KAS家族成員進(jìn)行初步篩選，參數(shù)設(shè)置默認(rèn)。選取上述2組結(jié)果共有的序列，采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的ORF"finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/"orffinder/）在線工具預(yù)測(cè)候選序列的開(kāi)放閱讀框（open"reading"frame，"ORF）。通過(guò)NCBI"CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）、SMART（https：//smart.embl.de/）和InterPro（https：//"www.ebi.ac.uk/interpro/）在線軟件確定CoKAS家族成員，根據(jù)染色體定位信息進(jìn)行命名。

利用ExPASy"ProtParam（https：//web.expasy."org/protparam/）在線軟件對(duì)油茶CoKAS的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用SOPMA（https：//npsa-"pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件預(yù)測(cè)CoKAS的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用CELLO"v.2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）在線軟件分析CoKAS的亞細(xì)胞定位。

1.2""CoKAS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

利用MEGA-X軟件中Muscle算法對(duì)CoKAS和AtKAS蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，使用鄰近法（neighbor-joining"method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值設(shè)置為1000。

1.3""CoKAS基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/"tools/meme）在線軟件分析蛋白的保守基序（motif），設(shè)定基數(shù)為10，其他為默認(rèn)參數(shù)。根據(jù)CoKAS基因家族的注釋文件，利用GSDS"2.0（https：//gsds.gao-"lab.org/）在線軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的可視化分析。

1.4""CoKAS啟動(dòng)子序列分析

利用TBtools軟件提取CoKAS基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（ATG）上游2000"bp的啟動(dòng)子序列，利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/we btools/plantcare/html/）在線軟件預(yù)測(cè)其順式作用元件，利用R軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析。

1.5""CoKAS基因在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式分析

CoKAS基因家族成員的表達(dá)量以每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的fragments（fragments"per"kilobase"of"exon"model"per"million"mapped"fragments，"FPKM）計(jì)算。根據(jù)LI等[11]鑒定的CoMYB（Camellia"oleifera"myeloblastosis）家族成員篩選出亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核的MYB蛋白，采用R軟件包進(jìn)行CoKAS和CoMYB相關(guān)性分析及數(shù)據(jù)可視化分析。

1.6""RT-qPCR分析

選取湘林210#油茶油脂快速積累期的種子，分別在授粉后256"d（S1）、275"d（S2）、303"d（S3）、330"d（S4）采集樣品，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)候選CoKAS基因的CDS序列，通過(guò)NCBI的Primer3（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/prim er-blast/index.cgi？LINK_LOC=BlastHome）在線軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。采用TRNzol法提取總RNA，使用FastKing"cDNA第一鏈合成試劑盒（KR116）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以EF1a2為內(nèi)參，利用SuperReal"PreMix"Plus（SYBR"Green）進(jìn)行RT-qPCR，CoKAS基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，分別采用SPSS"25.0和origin"2020軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""CoKAS家族成員的特征分析

通過(guò)結(jié)合hmmer和blast方法，在油茶果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到14個(gè)CoKAS基因家族成員，包括4個(gè)KAS"I、6個(gè)CoKAS"II和4個(gè)CoKAS"III（表2），它們不均勻地分布在油茶的7條染色體上，其中KAS"I的4個(gè)家族成員均分布在4號(hào)染色體上。理化性質(zhì)分析揭示，這些蛋白家族成員中氨基酸數(shù)量超過(guò)400個(gè)的成員占78.57%，其中相對(duì)分子質(zhì)量最小的為1.13"kDa，最大的為5.15"kDa。理論等電點(diǎn)在4.54～8.89之間，大部分為酸性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)在32.01～"43.96之間，大部分為穩(wěn)定蛋白。所有CoKAS蛋白的脂溶性指數(shù)均未超過(guò)100，其中有9個(gè)蛋白親水指數(shù)小于0，說(shuō)明64.29%是脂溶性親水蛋白。在CoKAS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，占比最高的是無(wú)規(guī)則卷曲，為44.07%（CoKAS"I-2）～38.75%（CoKAS"III-3）；占比最低的是β轉(zhuǎn)角，以CoKAS"I-4的9.35%為最高。亞細(xì)胞定位分析顯示，除CoKAS"II-2定位于線粒體和葉綠體外，其余均定位于葉綠體。

2.2""CoKAS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

采用NJ法構(gòu)建油茶和擬南芥KAS基因家族成員氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，相對(duì)于KAS蛋白亞家族Ⅲ，家族Ⅰ和Ⅱ之間的親緣關(guān)系更為接近（圖1）。在第Ⅱ進(jìn)化支中，除了AtKAS"II與CoKAS"II-1/2處于同一進(jìn)化亞支外，CoKAS"II-3/4/5/6在該分支中被獨(dú)立分離出來(lái)。而在第Ⅰ和Ⅲ進(jìn)化支中，CoKAS與AtKAS家族成員分別屬于不同的進(jìn)化亞支。綜上所述，油茶中存在與擬南芥KAS進(jìn)化關(guān)系較近的同源KAS蛋白，同時(shí)2個(gè)物種間也存在明顯分化的KAS蛋白。

2.3""CoKAS家族基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

為探究CoKAS家族成員基因的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)其外顯子與內(nèi)含子的組成進(jìn)行分析。結(jié)果揭示CoKAS家族成員間基因結(jié)構(gòu)的多樣性，內(nèi)含子數(shù)量在1～13之間，尤其CoKAS"II-1/2的內(nèi)含子數(shù)量高達(dá)13。在同一亞族內(nèi)，成員之間的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出較高的相似性，如CoKAS"III亞族所有成員所含7個(gè)內(nèi)含子的位置大體一致（圖2A）。這些發(fā)現(xiàn)表明，亞家族間基因結(jié)構(gòu)的差異化可能與新功能的演化緊密相關(guān)。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，所有成員均展現(xiàn)出KAS蛋白的典型特征，包含有cond_enzymes結(jié)構(gòu)域，而PLN02326是CoKAS"III亞家族特有的保守結(jié)構(gòu)域（圖2B）。CoKAS家族成員的motif從2到10個(gè)不等，其中motif"1/2/6基序組成了KAS基因家族典型的保守區(qū)域（圖2C，圖2D）。motif"1具備還原酶活性FabB區(qū)域，存在于所有的CoKAS蛋白中；除CoKAS"I-4外，CoKAS家族所有成員均含有motif"2基序；而motif"6基序僅在CoKAS"I/II亞家族中被發(fā)現(xiàn)。CoKAS"I和II兩個(gè)亞家族成員間motif的空間分布、類型和數(shù)量具有較高的一致性，但與CoKAS"III家族成員存在一定的差異。然而，在CoKAS"I和II兩個(gè)亞家族中，也有個(gè)別成員如CoKAS"I-4和CoKAS"II-2的motif數(shù)量相對(duì)缺失，這可能與基因串聯(lián)重復(fù)過(guò)程中堿基的丟失有關(guān)。

2.4""CoKAS啟動(dòng)子順式作用元件分析

通過(guò)對(duì)CoKAS家族基因啟動(dòng)子上游2000"bp序列的順式作用元件進(jìn)行分析，鑒定到大量與生長(zhǎng)發(fā)育、激素、光及逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（圖3）。在所有的生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件中，數(shù)量最多的是所有成員都具有的MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。CoKAS啟動(dòng)子序列含有3～22個(gè)光調(diào)控和響應(yīng)元件，其中85.71%的成員具有Box"4元件。CoKAS啟動(dòng)子序列含有7～18個(gè)脅迫響應(yīng)元件，除CoKAS"I-3外，其他成員都含有響應(yīng)厭氧誘導(dǎo)的ARE元件。CoKAS家族成員主要對(duì)赤霉素、乙烯、茉莉酸甲酯、水楊酸和生長(zhǎng)素產(chǎn)生響應(yīng)，其中71.43%成員對(duì)赤霉素有響應(yīng)，78.57%成員對(duì)乙烯有響應(yīng)。綜上所述，CoKAS在油茶生長(zhǎng)發(fā)育、激素誘導(dǎo)、光誘導(dǎo)和逆境脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。

2.5""油茶果實(shí)發(fā)育過(guò)程中CoKAS基因的表達(dá)模式

基因的表達(dá)對(duì)其功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。為研究CoKAS基因在油茶油脂合成中的功能，構(gòu)建了CoKAS基因家族成員在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜（圖4）。除CoKAS"III亞族外，第I和II亞族均有成員在油茶果實(shí)整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量較低，其中第II亞族的比例最大，占全部基因的66.67%。隨著油茶果實(shí)的成熟，有6個(gè)CoKAS基因家族成員的表達(dá)趨勢(shì)與種子油含量逐漸增加趨勢(shì)相同[12]，但CoKAS"II-3的表達(dá)模式卻呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。另外，有2個(gè)基因在T3階段高表達(dá)，CoKAS"I-3的表達(dá)量先上升后下降，而CoKAS"III-4的表達(dá)量先上升后保持不變。這些結(jié)果表明，CoKAS基因家族在油茶果實(shí)油脂積累過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。為深入探討CoKAS基因在油茶種子油脂累積過(guò)程中的功能，本研究通過(guò)RT-qPCR技術(shù)，對(duì)8個(gè)CoKAS基因在湘林210#油茶種子油脂快速累積期的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，其中5個(gè)CoKAS基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)基本一致（圖5）。此外，除CoKAS不同小寫字母表示處理間差異顯著（Plt;0.05）。

III-1基因表現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢(shì)外，CoKAS"II-5和CoKAS"II-6基因在早期階段呈現(xiàn)出與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果不一致的表達(dá)模式，但在后期逐漸趨于一致。這種差異可能是由于湘林210#與華碩2個(gè)油茶品種間基因組變異或發(fā)育調(diào)控機(jī)制的不同所致。

由圖3可知，CoKAS啟動(dòng)子中含有4～20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子MYB的結(jié)合位點(diǎn)，這表明該家族成員可能更容易受到MYB的調(diào)控。為探索CoMYB轉(zhuǎn)錄因子和CoKAS家族成員的結(jié)合情況，本研究對(duì)定位于細(xì)胞核的124個(gè)CoMYB與14個(gè)CoKAS進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，并計(jì)算了Pearson相關(guān)系數(shù)（圖6）。結(jié)果顯示，有7個(gè)CoKAS家族成員可能受到21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子CoMYB的調(diào)控，其中CoKAS"II-6的轉(zhuǎn)錄因子CoMYB最多，高達(dá)13個(gè)。CoMYB46能調(diào)控除CoKAS"I-4外的其他6個(gè)成員基因的表達(dá)，而CoMYB85僅調(diào)控CoKAS"II-3的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)不同CoKAS基因家族成員可能同時(shí)受多種CoMYB的調(diào)控，例如CoMYB18、CoMYB46、CoMYB68、CoMYB83與CoKAS"I-1、CoKAS"II-3、CoKAS"II-5、CoKAS"III-1、CoKAS"III-2都具有較強(qiáng)的相關(guān)性（|r|≥0.85），除CoKAS"II-3外，其他成員為負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明，CoMYB可能通過(guò)多樣的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)CoKAS基因的表達(dá)。

顏色越深和圓圈越大表明二者之間的相關(guān)性越強(qiáng)。

3""討論

KAS作為脂肪酸合酶的關(guān)鍵組成部分，是一種高度保守的酶，廣泛存在于地球上的幾乎所有生命體中。其家族成員已在多種植物中被鑒定出來(lái)，并在植物的發(fā)育轉(zhuǎn)變和環(huán)境響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[5，"7-8]。然而，關(guān)于油茶KAS基因家族成員的鑒定及其功能的研究卻鮮有報(bào)道。本研究采用同源性比對(duì)的方法，成功鑒定到14個(gè)CoKAS家族成員，它們定位在油茶的7條染色體上。CoKAS蛋白同一亞族內(nèi)的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)相近，這可能與其功能的保守性有關(guān)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，14個(gè)CoKAS中有13個(gè)定位于葉綠體，這與葉綠體是脂肪酸合成的主要場(chǎng)所相符[13]。而只有CoKAS"II-2定位于線粒體和葉綠體，這可能與其作為雙重定位酶的特性有關(guān)，它參與線粒體中的脂質(zhì)合成，盡管這些脂質(zhì)只占總脂質(zhì)的一小部分，但它們?cè)谡{(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育方面發(fā)揮了重要作用[14-15]。在進(jìn)化關(guān)系上，油茶與擬南芥的KAS同被分為3個(gè)亞類，不同分支行使的功能各異。通過(guò)對(duì)CoKAS家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，同一亞族成員的外顯子-內(nèi)含子數(shù)量及分布、結(jié)構(gòu)域和保守基序特征相似，這可能與同一亞族CoKAS成員的生物學(xué)功能相似有關(guān)?；虻倪M(jìn)化過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)內(nèi)含子增加或缺失現(xiàn)象[16]，這可能是導(dǎo)致個(gè)別基因（CoKAS"I-1、CoKAS"II-1、CoKAS"II-2和CoKAS"I-4）外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)發(fā)生變異的原因。

啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件對(duì)基因表達(dá)具有至關(guān)重要的調(diào)控作用[17]。油茶CoKAS家族基因的啟動(dòng)子區(qū)富集大量生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)、光響應(yīng)、激素誘導(dǎo)和脅迫應(yīng)答元件，表明CoKAS基因功能多樣，能參與不同的生物學(xué)過(guò)程。乙烯是調(diào)控植物生長(zhǎng)與發(fā)育的關(guān)鍵激素，一方面乙烯可作為內(nèi)源調(diào)節(jié)劑刺激植物分生組織生長(zhǎng)和胚乳分裂[18]；另一方面，過(guò)量的乙烯則抑制分生組織擴(kuò)張和胚乳細(xì)胞分裂速率[19]。研究發(fā)現(xiàn)，超長(zhǎng)鏈脂肪酸（very-long-chain"fatty"acids，"VLCFAs）能通過(guò)增強(qiáng)乙烯生物合成促進(jìn)植物分生組織的伸長(zhǎng)[20]。過(guò)表達(dá)OskasI也能使擬南芥根伸長(zhǎng)，而缺乏KAS"I時(shí)會(huì)顯著降低種子中脂肪酸的水平[21]。此外，KAS"I在植物的種子、根、花和幼苗中均有表達(dá)[22]。在根中，KAS"I主要在分生組織、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)的維管束中表達(dá)。在子葉胚發(fā)育的早期階段，胚乳細(xì)胞迅速增殖，且乙烯生物合成的關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（ACC合成酶）和KAS"I基因表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。然而，在子葉胚發(fā)育的后期，高濃度的乙烯會(huì)促進(jìn)胚乳細(xì)胞程序性死亡，與此同時(shí)，KAS"I的表達(dá)水平有所下降[22-23]。本研究觀察到，CoKAS"I-2和CoKAS"I-3在油茶種子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中CoKAS"I-2的表達(dá)量相對(duì)較低。A-box和GCN4_motif這2個(gè)參與分生組織（CoKAS"I-2）和胚乳（CoKAS"I-3）特異性表達(dá)的元件，僅在CoKAS"I亞家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，且這些基因包含乙烯響應(yīng)元素。據(jù)此推測(cè)，CoKAS"I-2和CoKAS"I-3可能通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯信號(hào)途徑，分別參與油茶根系的生長(zhǎng)和種子胚乳的發(fā)育，而乙烯對(duì)CoKAS"I基因家族的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。

在植物種子的灌漿中期至末期，光照強(qiáng)度的增加導(dǎo)致種子中亞油酸、棕櫚酸和亞麻酸含量上升，而油酸含量則相應(yīng)降低。然而，在灌漿末期至成熟期，隨著光照強(qiáng)度的逐步減弱，油酸含量開(kāi)始逐漸增加，與此同時(shí)，亞油酸、棕櫚酸和亞麻酸含量則呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)[24]。研究揭示，在植物種子的灌漿階段，高強(qiáng)度光照可能對(duì)種子質(zhì)量和產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響。相比之下，適宜的遮光處理能有效提高種子重量，并增加不飽和脂肪酸含量，特別是油酸[25-26]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，油茶CoKAS基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域含有眾多光響應(yīng)元件，并在灌漿末期表達(dá)水平顯著變化的成員較多，推測(cè)CoKAS基因家族在光信號(hào)調(diào)控油茶種子油脂積累和脂肪酸組成中起到關(guān)鍵作用。MYB在植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)中扮演著至關(guān)重要的角色。大量的證據(jù)證實(shí)，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)油脂積累的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。例如，麻風(fēng)樹(shù)中的JcMYB1能夠直接促進(jìn)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶二?；视王；D(zhuǎn)移酶1（diacylglycerol"acyltransferase1，"DGAT1）的表達(dá)，從而增加油脂含量[27]。油桐中，VfMYB36的過(guò)量表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)擬南芥中與油脂合成相關(guān)的基因AtWRI、AtENO1、AtBCCP1、AtKAS1、AtKCS11和AtPAL2的活性，導(dǎo)致種子中亞麻酸和總油量的提升[28]。然而，在脂質(zhì)代謝中，MYB轉(zhuǎn)錄因子更常見(jiàn)的角色是作為抑制因子。在擬南芥種子的脂質(zhì)生物合成過(guò)程中，MYB89通過(guò)直接結(jié)合啟動(dòng)子位點(diǎn)抑制WRI1和KASI的表達(dá)，并間接抑制L1L等關(guān)鍵基因的活性，從而負(fù)向調(diào)控油脂的合成[29]；MYB76則通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸降解酶相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪酸的負(fù)向調(diào)控[30]；而MYB118則通過(guò)調(diào)控成熟相關(guān)基因的活性來(lái)抑制胚乳中油脂的合成[31]。在本項(xiàng)研究中，CoKAS家族成員基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)CoKAS與CoMYB家族成員間存在高度相關(guān)性，其中大部分呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。上述結(jié)果表明，CoMYB可能通過(guò)與CoKAS基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控油茶種子中油脂積累和脂肪酸組成。

4""結(jié)論

本研究基于油茶果實(shí)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)鑒定了14個(gè)CoKAS基因家族成員，這些基因分布于7條染色體上。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，CoKAS基因被分為3個(gè)亞類，同一亞類成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序高度保守。在CoKAS基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域，鑒定到大量與生長(zhǎng)發(fā)育、光響應(yīng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。此外，表達(dá)模式分析顯示，大部分CoKAS基因家族成員在油茶果實(shí)快速積累油脂期表達(dá)量顯著上調(diào)。進(jìn)一步的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析表明，CoKAS"I-1、CoKAS"II-3、CoKAS"II-5、CoKAS"III-1和CoKAS"III-2與CoMYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員存在顯著的相關(guān)性。這些結(jié)果為深入解析CoKAS基因在油茶籽油生物合成中的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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