消栓再造丸中非法染色劑蘇丹IV、808猩紅的檢測方法研究

DOI：10.16255/j.cnki.ldxbz.2025.01.010

［摘" 要］

［目的］建立消栓再造丸中染色劑蘇丹IV、808猩紅的檢測方法。

［方法］采用高效液相色譜法對消栓再造丸中的

兩種染色劑進(jìn)行定量測定，色譜柱為Phenomenex luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.02 mol/L醋酸銨水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為520 nm。

［結(jié)果］該方法檢測蘇丹紅IV、808猩紅的線性范圍分別為0.001 48～0.029 60 μg、0.002 50～0.050 00 μg，回收率（n=6）分別為101.68%和101.64%，

穩(wěn)定性實驗的

RSD分別為0.53%和0.75%。

［結(jié)論］該方法簡單、準(zhǔn)確，適用于消栓再造丸中非法染色劑蘇丹IV、808猩紅的測定。

［關(guān)鍵詞］" 消栓再造丸；高效液相色譜；蘇丹IV；808猩紅；染色劑

［中圖分類號］" R 286;O 657.72" ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］" A" ［文章編號］" 1005-0310（2025）01-0062-07

［收稿日期］" 2024-05-29

［作者簡介］" 吳國浩（1990—），男，北京市人，中國北京同仁堂（集團）有限責(zé)任公司高級工程師、執(zhí)業(yè)藥師

、主管藥師，主要研究方向為中藥藥物分析、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及工藝研究、企業(yè)運營管理；賈秀凌（1986—），男，山東菏澤人，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠、北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所中藥研發(fā)副高級工程師，主要研究方向為中藥新藥開發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

［通訊作者］" 段瑞剛（1988—），男，河北

三河人，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠、北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所研發(fā)工程師，主要研究方向為中藥新藥開發(fā)及制劑工藝研究。E-mail：duanruigang33@163.com

Study on the Detection Method of Illegal Dyes Sudan IV and Scarlet

808 in Xiaoshuan Zaizao Pills

WU" Guohao1， JIA" Xiuling2，3， DUAN" Ruigang2，3

（1.China Beijing Tongrentang （Group） Co.， Ltd.， Beijing 100079，China；2.Pharmaceutical Factory of

Beijing Tongrentang Technology Development Co.， Ltd.， Beijing 100079， China； 3.Scientific Research Institute of Beijing

Tongrentang Co.， Ltd.， Beijing 100079，China）

Abstract： The aim is to establish a detection method for illegal dyes Sudan IV and Scarlet 808 in Xiaoshuan Zaizao Pills. High-performance liquid chromatography （HPLC） was used for the quantitative determination of the two dyes

in Xianshuan Zaizao Pills. The Phenomenex Luna C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） was employed with an acetonitrile-0.02 mol/L ammonium acetate solution as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was set at 1.0 mL/min， the column temperature at 40 ℃， and the detection wavelength at 520 nm. Results show that the linear ranges of Sudan IV and Scarlet 808 were 0.001 48～

0.029 60 μg and

0.002 50～

0.050 00 μg， respectively， the average recovery（

n=6）was 101.68% and 101.64%，and RSD was 0.53% and 0.75%. It can be concluded that the detection method is convenient and accurate， suitable for the determination of the illegal dyes Sudan IV and Scarlet 808 in Xiaoshuan Zaizao Pills.

Keywords： Xiaoshuan Zaizao Pills；HPLC；Sudan IV；Scarlet 808；Dyes

消栓再造丸是由血竭、當(dāng)歸、川芎等38味飲片經(jīng)粉碎后加煉蜜制成的大處方蜜丸制劑，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中，具有活血化瘀、息風(fēng)通絡(luò)、補氣養(yǎng)血，消除血栓的功效，主要用于由情志郁怒、飲食不律、過度勞累、氣血逆亂，腦脈痹阻所致的中風(fēng)，其癥狀表現(xiàn)為肢體偏癱、半身不遂、口眼歪斜、言語障礙、胸中郁悶等。其處方中的血竭由于價格昂貴，市場供應(yīng)不足，因此存在造假及偽違的情況，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量，甚至危及患者健康，其中蘇丹紅IV（C24H20N4O）及808猩紅（C23H17N3O2）染色劑為血竭摻偽和造假過程中常用的兩種染色劑［1-2］。這兩種染色劑均為人工合成的親脂性偶氮化合物，親脂性偶氮化合物工業(yè)染料被廣泛用于溶劑、油、蠟、汽油的增色等，具有一定代謝毒性，在人類或動物體內(nèi)還原酶的作用下會產(chǎn)生致癌物質(zhì)，并在累積過程中出現(xiàn)中毒性肝病甚至肝癌［3-4］。蘇丹IV及808猩紅經(jīng)常用于制作血竭偽品［5-6］，進(jìn)而傳遞到消栓再造丸的成品中，產(chǎn)生一定的質(zhì)量風(fēng)險。因

此，在消栓再造丸中進(jìn)行兩種成分的檢測可以降低質(zhì)量風(fēng)險，增加產(chǎn)品的可靠性。目前，對于兩種成分的檢測方式的報道較多，包括高效液相色譜法 （HPLC）、高效液相色譜質(zhì)譜法 （LC-MS）、氣相色譜質(zhì)譜法 （GC-MS）、薄層層析法、分光光度法、毛細(xì)管電泳等［9-15］ ?！吨袊幍洹?020年版四部指導(dǎo)原則項目中色素測定法指導(dǎo)原則（9303）對色素測定進(jìn)行了介紹，可用高效液相色譜法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等進(jìn)行定性和定量鑒別，但目前尚未有對消栓再造丸中染色成分檢測方面的研究報道。本研究采用高效液相色譜法對消栓再造丸中可能存在的兩種染色劑進(jìn)行定量和定性分析，方法簡單實用、針對性強、檢測成本較低，通過制定消栓再造丸成品中兩種染色劑的質(zhì)量控制方法，為監(jiān)督管理添加非法原料的消栓再造丸

提供了更多參考依據(jù)。

北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報2025年1月第39卷第1期吳國浩等：消栓再造丸中非法染色劑蘇丹IV、808猩紅的檢測方法研究

1" 儀器與試藥

1.1" 儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津）；電子分析天平

（十萬分之一，XP205型，瑞士Mettler Toledo公司）；電子分析天平（萬分之一，ML204 型，瑞士Mettler Toledo公司）；電子分析天平（百分之一，PL1002E型，瑞士Mettler Toledo公司）；超聲波清洗器（KQ-250 B型波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2" 試藥

對照試劑：蘇丹IV對照品（廣州碩譜生物科技有限公司，批號：RMT17610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以97.8%計）、808猩紅對照品（廣州碩譜生物科技有限公司，批號：RMT20050，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.4%計）。

乙腈為色譜純（德國Merck公司），甲醇、乙醇、二氯甲烷均為分析純（北京化工廠）；乙酸銨（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2" 實驗方法與結(jié)果

2.1" 色譜條件

色譜柱Phenomenex luna C18（250 mm×4.6 mm）；柱溫40℃；流動相為乙腈（A）-0.02 mol/L醋酸銨（B），洗脫梯度見表1。流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長520 nm；理論塔板數(shù)按蘇丹IV計算不低于2 000。

2.2" 對照品溶液的制備

分別精密稱取蘇丹IV、808猩紅對照品，加乙醇

分別配制成每毫升含18.4 μg和15.68 μg的對照品母液；取以上對照品適量，配制成3.76 μg/mL和2.88 μg/mL的對照品溶液。

2.3" 供試品溶液的制備

2.3.1

陰性供試品溶液的制備

取消栓再造丸1丸，剪碎、精密稱定，按質(zhì)量比1∶1加入硅藻土，充分研磨，置具塞錐形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，超聲處理（頻率40 kHz，功率250 W）30 min，過濾后蒸干，加乙醇

到5 mL容量瓶中溶解，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.2" 陽性供試品溶液的制備

因消栓再造丸樣品中未檢測出蘇丹IV和808猩紅染色劑，因此采用標(biāo)準(zhǔn)品加入法制備陽性供試品，即采用在消栓再造丸原粉中加入配置染色劑后混勻制丸方式制備供試品［5-8］。

蘇丹IV陽性供試品溶液：分別精密量取2.3.1項下的供試品溶液1 mL和蘇丹IV對照品儲備液2 mL，混勻，即得。

808猩紅陽性供試品溶液：分別精密量取2.3.1項下的供試品溶液1 mL和808猩紅對照品儲備液2 mL，混勻，即得。

2.4" 專屬性實驗

分別取上述對照品溶液、陰性供試品溶液、陽性供試品溶液按照

2.1項下的方法測定，陰性樣品在與對照品溶液相對應(yīng)的保留時間

處沒有出現(xiàn)對照峰，陽性樣品在與對照品溶液相同的保留時間

處出現(xiàn)對應(yīng)的色譜峰（見圖1）。

2.5" 線性關(guān)系考察

取蘇丹IV對照品溶液適量，加入乙醇分別制成每1 mL含蘇丹IV 0.148 μg、0.296 μg、0.740 μg、

1.480 μg、2.220 μg、2.906 μg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密量取10 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入液相色譜儀中，按照2.1項下

的色譜條件測定峰面積；以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=33 232x－

2 937.1，R2=0.998 6。結(jié)果顯示，蘇丹IV對照品在0.001 48～0.029 60 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（見表2和圖2）。

取808猩紅對照品溶液適量，加入乙醇

分別制成每1 mL含808猩紅0.250 μg、0.500 μg、1.250 μg、2.500 μg、3.750 μg、5.000 μg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密量取10 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入液相色譜儀中，按

2.1項下的色譜條件測定峰面積；以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=20 273x+591.06，

R2=0.999 5。結(jié)果顯示，808猩紅對照品在0.002 50～0.050 00 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（見表3和圖3）。

2.6" 檢測限考察

取2.2項下的蘇丹IV對照品溶液和808猩紅對照品溶液

，用乙醇進(jìn)行逐步稀釋（稀釋濃度分別見表4和表5），進(jìn)樣10 μL，按照2.1項下的色譜條件，按信噪比3倍值計算，測得蘇丹IV檢出限（LOD）為0.074 μg/mL（見表4），808猩紅的檢出限（LOD）為0.125 μg/mL（見表5）。

2.7" 精密度實驗

按2.3.2項下的方法制備陽性供試品溶液，按2.1項下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。蘇丹IV峰面積的RSD為1.98%（見表6），808猩紅峰面積的RSD為0.65%（見表7），表明實驗的精密度良好。

2.8" 穩(wěn)定性實驗

取同一陽性供試品溶液，按2.1項下的色譜條件，于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測定，記錄蘇丹IV和808猩紅的峰面積，結(jié)果為：蘇丹IV峰面積的RSD為0.53%（見表8），808猩紅峰面積的RSD為0.75%（見表9），表明實驗的穩(wěn)定性良好。

2.9" 重復(fù)性實驗

取同一批次樣品，按照2.3.2項下的方法制備6份陽性供試品溶液，按2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算樣品中蘇丹IV和808猩紅的質(zhì)量濃度。結(jié)果為：蘇丹IV的RSD為1.23%（見表10），808猩紅的RSD為0.44%（見表11），表明實驗的重復(fù)性良好。

2.10" 回收率實驗

取同一批消栓再造丸樣品，按2.3.2項

下的方法制備6份陽性供試品溶液，分別精密量取1 mL已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的陽性樣品，加入2 mL蘇丹IV和808猩紅對照品溶液，混勻，即得蘇丹IV和808猩紅回收率樣品。按

2.1項下的色譜條件檢測，計算蘇丹IV和808猩紅

的回收率。結(jié)果為：蘇丹IV的平均回收率為101.68%，RSD為1.48%；808猩紅的平均回收率為101.64%，RSD為1.29%，表明回收率良好（見表12）。

2.11nbsp; 樣品測定

按照2.1項下的色譜條件，抽檢北京同仁堂股份有限公司生產(chǎn)的8批消栓再造丸。結(jié)果為

：抽檢的8批樣品均未檢出蘇丹IV及808猩紅染色劑。

3" 結(jié)束語

3.1" 提取方法的考察

消栓再造丸中含有38味中藥，以原粉和煉蜜制劑成方，由于原料血竭在整個處方中占比很低，如果不考慮樣品的濃縮方法，很可能由于檢測限（LOD）的原因影響蘇丹IV和808猩紅的檢測結(jié)果。因此，本實驗的前處理采用提取試液過濾后濃縮再定容的方式。實驗中考察了以甲醇、乙醇、無水乙醇和二氯甲烷為提取溶劑，結(jié)果表明：甲醇、乙醇及無水乙醇溶劑在提取過濾蒸干

時會出現(xiàn)大量煉蜜粘在蒸發(fā)皿中，無法進(jìn)行定容。二氯甲烷提取過程無這種現(xiàn)象，因此選用二氯甲烷為提取溶劑。本實驗對提取方法和提取時間進(jìn)行了考察，分別超聲提取30、40、50 min，加熱回流提取30、60、90 min，結(jié)果表明：超聲提取時間為30 min、加熱回流時間為90 min時，兩種染色劑的峰面積最大，考慮到操作的便捷性與效率，選擇時間更短的超聲提取方式。

為考察煉蜜對二氯甲烷在提取過程中的提取效率是否有影響，本研究設(shè)計了制劑實驗，考察蜂蜜對蘇丹IV及808猩紅染色劑的干擾，即：按照消栓再造丸的生產(chǎn)工藝，取血竭等38味藥粉270 g，加入392 μg/mL的808猩紅對照品溶液7 mL和460 μg/mL的蘇丹IV對照品溶液6 mL，混勻后取出70 g粉作為未加蜂蜜的供試品組，取已混勻后剩余的200 g粉加入適量煉蜜制成丸劑作為加蜜供試品組。按照2.1項下的檢測方法，陰性供試品和陽性供試品的染色劑質(zhì)量濃度經(jīng)折算后結(jié)果一致，說明蜂蜜對以二氯甲烷為制劑提取樣品中的蘇丹IV及808猩紅染色劑無干擾。

3.2" 薄層色譜法的考察

本實驗對薄層色譜法進(jìn)行了研究，實驗中陰性樣品處理方法同2.3.1，陽性樣品處理方法同2.3.2；對照品溶液配置方法為：取蘇丹IV、808猩紅對照品適量，分別加入甲醇制成每1 mL含蘇丹IV、808猩紅0.1 mg的溶液，作為對照品溶液；薄層色譜條件為：照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）吸取上述供試溶液2 μL和對照品溶液各5μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑展開，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰乙酸（9∶1∶0.1）為展開劑展開，取出，晾干，日光下視檢。在供試品色譜中，在對照藥材相對應(yīng)的位置上

不得顯出相同顏色的斑點，結(jié)果表明，薄層色譜法在考察染色情況時可以作為定性指標(biāo)參考。

3.3" 結(jié)論

本研究首次建立了消栓再造丸成品中染色劑的定性及定量檢測方法，該方法迅速準(zhǔn)確，專屬性強。在定性鑒別中，蘇丹IV的檢出限（LOD）為0.074 μg/mL，808猩紅的檢出限（LOD）為0.125 μg/mL；在定量測定中，蘇丹IV對照品在0.001 48～0.029 60 μg范圍內(nèi)、808猩紅對照品在0.002 50～0.050 00 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢測精度較高。檢測方法的蘇丹IV峰面積和808猩紅峰面積RSD分別為1.98%和0.65%，24 h穩(wěn)定性實驗的RSD分別為0.53%和0.75%，重復(fù)性實驗的RSD分別為1.23%和

0.44%，平均回收率為101.68%和101.64%，均符合要求，說明該方法可用于消栓再造丸成品中蘇丹IV和808猩紅的定性和定量檢測。但是，研究過程中未收集到添加有上述兩種染色劑的血竭樣品，故未能完全重現(xiàn)染色血竭原粉入藥，而是采用了在原粉中加入配置染色劑后混勻制丸方式制備樣品進(jìn)行考察，在后期研究中還需繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)染色樣品的收集和檢測。

本研究建立的消栓再造丸大蜜丸蘇丹IV及808猩紅染色劑的定性及定量檢測方法，可以有效監(jiān)測該藥品中添加非法染色血竭的行為，為消栓再造丸成品的質(zhì)量控制提供了更多依據(jù)，同時為

開發(fā)其他蜜丸品種中染色劑成分的檢測方法提供了一定借鑒和思路。

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（責(zé)任編輯" 柴" 智；責(zé)任校對" 白麗媛）