響應(yīng)面法優(yōu)化信號(hào)分子AI-2合成蛋白LuxS表達(dá)條件

摘 要：群體感應(yīng)是一種由自誘導(dǎo)物（autoinducers，AIs）介導(dǎo)的、細(xì)菌密度依賴的基因表達(dá)調(diào)控方式，已經(jīng)被證實(shí)參與細(xì)菌多種生理功能的調(diào)控.信號(hào)分子AI-2介導(dǎo)的LuxS/AI-2型群體感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌，并備受關(guān)注.AI-2的合成依賴于S-核糖同型半胱氨酸酶（LuxS）的催化作用，而LuxS蛋白則是由luxS基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯得到的.為了探索LuxS蛋白在表達(dá)菌株Escherichia coli BL21（DE3）中的最佳表達(dá)條件，從而獲得較高產(chǎn)量且具有一定的生物活性的LuxS蛋白.首先對(duì)LuxS蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，確定E. coli BL21（DE3）作為表達(dá)菌株.其次，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化LuxS蛋白的表達(dá)條件.在菌液濃度OD600為0.5、誘導(dǎo)溫度為37 ℃、IPTG濃度為0.5 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為31 h條件下，獲得LuxS蛋白的最高表達(dá)量.研究成功優(yōu)化了LuxS蛋白在E. coli BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)條件，獲得了具有生物活性的LuxS蛋白，并在后續(xù)的研究中成功合成了具有生物活性的信號(hào)分子AI-2，為體外合成AI-2奠定了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：群體感應(yīng);AI-2;LuxS蛋白;原核表達(dá);條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Q93""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：1000-2367（2025）01-0136-08

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是微生物普遍存在的一種細(xì)胞與細(xì)胞之間進(jìn)行溝通的重要機(jī)制.其本質(zhì)是細(xì)菌通過監(jiān)控環(huán)境中存在的自身或其他細(xì)菌產(chǎn)生的信號(hào)分子的濃度來感知其他細(xì)菌數(shù)量的變化，當(dāng)達(dá)到一定閾值后，啟動(dòng)細(xì)菌相關(guān)的基因表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境的變化.細(xì)菌之間通過群體感應(yīng)效應(yīng)（QS）系統(tǒng)進(jìn)行通訊，用于調(diào)節(jié)生態(tài)和醫(yī)學(xué)上的重要性狀［1］.并且細(xì)菌通過群體感應(yīng)調(diào)節(jié)自身行為并協(xié)調(diào)群體活動(dòng)，如生物被膜形成和毒力因子表達(dá).群體感應(yīng)也在細(xì)菌競爭和種間交流中發(fā)揮作用.群體感應(yīng)領(lǐng)域的研究為控制細(xì)菌感染和開發(fā)新型病原菌防治策略提供了新的思路.例如，群體感應(yīng)抑制劑已被開發(fā)為控制細(xì)菌感染的抗生素類潛在替代品［2］.總的來說，群體感應(yīng)研究是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，對(duì)生物、食品、農(nóng)業(yè)、納米醫(yī)學(xué)和人類健康等領(lǐng)域都有影響.

群體感應(yīng)發(fā)生時(shí)大多數(shù)細(xì)菌會(huì)分泌一種化學(xué)信號(hào)分子，其被稱為自誘導(dǎo)物（autoinducers，AIs）.由于不同細(xì)菌的QS系統(tǒng)也有區(qū)別，信號(hào)分子類型也會(huì)隨細(xì)菌的差異而有所不同.第一類是存在于革蘭氏陰性菌當(dāng)中的群體感應(yīng)系統(tǒng)，依賴于N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類（N-acyl homoserine lactones，AHLs）及其衍生物作為信號(hào)分子［3］；第二類是存在于革蘭氏陽性菌當(dāng)中的群體感應(yīng)系統(tǒng)，以寡肽類（autoinducing peptides，AIPs）作為信號(hào)分子［4］；信號(hào)分子AI-2在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中都被檢測到，所以將AI-2視為種間通用信號(hào)分子，它起著至關(guān)重要的信號(hào)傳遞與交流的作用［5-6］.

LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌用來調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程的機(jī)制，包括毒力因子、細(xì)菌發(fā)光和生物膜形成的調(diào)節(jié)［7-9］.LuxS 酶在群體感應(yīng)和細(xì)菌生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，催化AI-2信號(hào)分子的產(chǎn)生［10］.LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)影響不同細(xì)菌菌株的生長特性、生物膜形成、抗生素產(chǎn)生、毒力和代謝［11］.研究表明，鼠李糖乳桿菌GG的LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)可以促進(jìn)無菌斑馬魚生物膜形成并增強(qiáng)對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的抵抗力［10］.肺炎鏈球菌的 LuxS/AI-2 群體感應(yīng)系統(tǒng)是引起疾病并調(diào)節(jié)中耳感染大鼠模型中毒力和代謝相關(guān)基因所必需的［1］.LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)還會(huì)影響副豬嗜血桿菌的生長特性、生物膜形成和毒力因子的表達(dá)［11］.

作為群體感應(yīng)中重要的信號(hào)傳遞物質(zhì)，AI-2在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的合成途徑主要由3個(gè)階段的酶促反應(yīng)完成，由合成途徑得知，luxS基因表達(dá)出的LuxS蛋白在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用.廣泛分布于細(xì)菌間的AI-2合成酶LuxS本質(zhì)上屬于一種小分子金屬酶［12］，能夠催化底物S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomcysteine，SRH）中穩(wěn)定的硫醚鍵的裂解，因此也稱為SRH裂解酶［13］.有研究表明，通過對(duì)許多細(xì)菌的LuxS同源氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在比對(duì)的LuxS蛋白序列中存在一個(gè)保守的基序?yàn)镠is-Xaa-Xaa-Glu-His（HXXGH）.同時(shí)，通過電子克?。╥n silico）分析哈維氏弧菌的LuxS氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)LuxS蛋白中存在Lys-Ile-Pro-Glu-Leu-Asn-Glu-Tyr的氨基酸序列，其與酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)［Lys/Arg］-Xaa2-3-［Asp/Glu］-Xaa2-3-Tyr完全匹配.對(duì)已知的幾種革蘭氏陰性菌的LuxS蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的基序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)十分保守，這些特征都使得克隆luxS基因并進(jìn)一步異源表達(dá)LuxS蛋白成為可能.

本研究旨在提高合成AI-2的關(guān)鍵酶LuxS的原核表達(dá)效率，在前期成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET28a-luxS基礎(chǔ)上［14］，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測了LuxS蛋白的基本結(jié)構(gòu)，并且獲得了具有生物活性的LuxS蛋白，采取響應(yīng)面法對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明，LuxS蛋白在Escherichia coli BL21（DE3）中成功表達(dá)，并且通過優(yōu)化后大幅度提高了LuxS蛋白的表達(dá)量，該研究為體外合成群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2提供必要條件，并為在各種細(xì)菌中對(duì)LuxS/AI-2群體感應(yīng)的功能研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

E. coli BL21（DE3）和E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞由功能微生物綠色轉(zhuǎn)化技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室保藏，并接種于Luria broth培養(yǎng)基（LB，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2～7.6）在37 ℃下培養(yǎng).重組質(zhì)粒pET28a-luxS由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建.

1.2 主要試劑和儀器

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）購自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小量提取DNA凝膠回收試劑盒購自北京聚合酶生物科技有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀（XC-CDH），高速冷凍離心機(jī)（fresco17），PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 LuxS蛋白結(jié)構(gòu)分析預(yù)測

借助NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），通過Blastp對(duì)比分析，剔除相同序列，篩選得到LuxS蛋白的氨基酸序列.利用TMHMM Server v2.0對(duì)LuxS蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用SingalIP 3.0 Server軟件對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測.

1.3.2 種子液制備

將含有重組質(zhì)粒pET28a-luxS的E. coli BL21（DE3）的菌液按體積分?jǐn)?shù)1 %的接種量接種到10 mL含Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，并置于37 ℃搖床，180 r/min培養(yǎng)12 h.

1.3.3 誘導(dǎo)表達(dá)

將種子液按照上述方法分別接種到20 mL的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.5后按照不同試驗(yàn)條件進(jìn)行誘導(dǎo).

1.3.4 單因素試驗(yàn)

為篩選出最佳誘導(dǎo)效果，分別對(duì)誘導(dǎo)時(shí)重要的幾個(gè)條件進(jìn)行不同設(shè)置，包括培養(yǎng)溫度、IPTG濃度、培養(yǎng)時(shí)間.除這些條件外，其他條件做相同處理，包括使用同一批次的LB培養(yǎng)基，統(tǒng)一搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min.對(duì)含有重組質(zhì)粒的菌液進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞取裂解液，隨后12 000 r/min離心5 min后取上清液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%Loading Buffer后進(jìn)行SDS-PAGE檢測，電泳條件為：濃縮膠90 V電壓，分離膠120 V電壓.

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)，將單因素試驗(yàn)中所選取的3個(gè)條件分別作為自變量，用軟件ImageJ測定蛋白條帶灰度值并作為響應(yīng)值.通過Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì).其他條件為：LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min.

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

此實(shí)驗(yàn)中的作圖是通過Graphpad Prism 8.0軟件完成；蛋白電泳條帶通過Image J處理與分析；響應(yīng)面法通過Design Experts 8.0軟件完成.采用最終得到的相對(duì)灰度值來反映蛋白的表達(dá)量，其計(jì)算方法為：所得處理組的蛋白條帶除以內(nèi)參條帶的灰度值.

2 結(jié)果與分析

2.1 LuxS蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析與驗(yàn)證

2.1.1 LuxS蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過在線網(wǎng)站SingalIP與TMHMM Server v2.0對(duì)LuxS蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LuxS蛋白由164個(gè)氨基酸組成，其中丙氨酸和亮氨酸為含量最高的兩種氨基酸，均為疏水性氨基酸，其次是酸性氨基酸天冬氨酸.二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，占比最高的結(jié)構(gòu)形式為α-折疊（39.35%），其次是無規(guī)則卷曲（34.19%），β折疊占比最少（3.87%）.通過信號(hào)肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白預(yù)測分值均在標(biāo)準(zhǔn)線（0.5）之下，不包括信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖1）.跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果表示，該蛋白膜外分泌概率接近100%.根據(jù)預(yù)測結(jié)果，選擇E. coli BL21（DE3）作為表達(dá)菌株進(jìn)行蛋白LuxS的表達(dá).

2.1.2 結(jié)構(gòu)預(yù)測驗(yàn)證

本試驗(yàn)的研究結(jié)果如圖1（f）所示，經(jīng)過不同條件誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET28a-luxS表達(dá)出的LuxS蛋白大小約為23 kDa.另外，通過SDS-PAGE分析相同體積下的細(xì)菌全細(xì)胞裂解液中的蛋白表達(dá)量以及上清液中的蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，兩組都有蛋白表達(dá)，表明LuxS蛋白主要以可溶性形式存在.該結(jié)果基本符合蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，以胞外分泌表達(dá)形式為主.

2.2 LuxS蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 誘導(dǎo)劑濃度

由圖2（a）和（d）可知，在不同濃度IPTG條件下LuxS蛋白均可誘導(dǎo)表達(dá)，隨著誘導(dǎo)濃度的增加，蛋白表達(dá)量也呈上升趨勢.其中，在加入0.5 mmol/L的IPTG時(shí)，蛋白表達(dá)量比較高，其相對(duì)灰度值約為600%.然而，隨著IPTG濃度的繼續(xù)增加，蛋白表達(dá)量與之前相比并沒有顯著差異，所以將0.3～0.7 mmol/L確定為IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度.

2.2.2 誘導(dǎo)時(shí)間

由圖2（b）和（e）可知，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為12 h、24 h、48 h時(shí)均可以使LuxS蛋白表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長蛋白表達(dá)量也顯著性的上升.在誘導(dǎo)12 h后，上清液和全細(xì)胞裂解液的蛋白含量基本一致.當(dāng)時(shí)間延長至24 h后，全細(xì)胞裂解液和上清液的蛋白灰度值分別上升至639%和652%依舊保持基本一致.當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到48 h后，全細(xì)胞裂解液和上清液中的蛋白含量繼續(xù)上升，但上清液中蛋白含量提高幅度大于全細(xì)胞裂解液，此時(shí)上清液中的蛋白含量略高于全細(xì)胞裂解液，達(dá)到11.18倍.

2.2.3 誘導(dǎo)溫度

由圖2（c）和（f）可知，在誘導(dǎo)溫度由16 ℃提高到28 ℃時(shí)，LuxS蛋白的表達(dá)量在全細(xì)胞裂解液與上清液中均出現(xiàn)了顯著的提高，相對(duì)灰度值分別由16 ℃的305%、378%提高到572%、869%.但是當(dāng)誘導(dǎo)溫度由28 ℃提高至37 ℃時(shí)，全細(xì)胞裂解液中的蛋白表達(dá)量繼續(xù)出現(xiàn)了顯著性上升，但是上清液中的蛋白含量反而出現(xiàn)下降，灰度值從869%下降到639%.

2.3 回歸模型建立與分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken進(jìn)行3因素（A=誘導(dǎo)溫度/℃，B=誘導(dǎo)時(shí)間/h，C=誘導(dǎo)劑濃度/（mmol·L-1））3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，LuxS蛋白條帶相對(duì)灰度值的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1和圖3.

2.3.2 方差分析

利用Design Experts 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果多元回歸擬合分析，得到回歸方程：

Y=2 043.80+92.45A+326.27B+111.38C-262.78AB+32.26AC-45.34BC-167.71A2-336.09B2-607.49C2.

回歸模型分析得到的響應(yīng)面參數(shù)見附錄表S1，回歸模型顯著模型的相關(guān)系數(shù)R2 =0.997 7（＞0.75），說明該模型準(zhǔn)確性較高.3個(gè)因素的改變引起的響應(yīng)值變化達(dá)99.08%，從而說明模型有著較高的擬合度，可以用來分析和預(yù)測LuxS蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化.同時(shí)，結(jié)果表明A、B、AB、A2、B2、C2對(duì)蛋白相對(duì)灰度值的影響達(dá)到顯著，由模型分析可得在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)蛋白相對(duì)灰度值的影響因素為B＞C＞A.

2.3.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

為了更直觀地展現(xiàn)兩兩因素之間的交互作用，通過Design expert軟件生成了三維坐標(biāo)圖，通過響應(yīng)面輪廓嶺脊、等高線密集程度、形狀及擬合公式分析預(yù)測，當(dāng)在37 ℃條件下用0.52 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)31.56 h時(shí)，蛋白表達(dá)的效果最佳.在此條件下，模型預(yù)測蛋白相對(duì)灰度值為1 980%（圖3）.

2.4 誘導(dǎo)條件驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到操作方便的因素，本實(shí)驗(yàn)將實(shí)際誘導(dǎo)條件修正為：在37 ℃條件下用0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h，從而使蛋白獲得較高表達(dá)量.依據(jù)上述參數(shù)進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3（f），得到蛋白相對(duì)灰度值為2 237.

3 討 論

群體感應(yīng)系統(tǒng)是指細(xì)菌通過產(chǎn)生和交換可擴(kuò)散的自誘導(dǎo)信號(hào)分子進(jìn)行細(xì)菌間交流的過程［14］.LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于各類革蘭氏陽性菌和陰性菌中，被認(rèn)為是種間群體感應(yīng)系統(tǒng).LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控細(xì)菌很多重要的生理過程，包括生物發(fā)光［15］、生物膜形成［16］、運(yùn)動(dòng)性［17］及抗藥性［18］等.LuxS蛋白在同種細(xì)菌中高度保守且同源性高，并且可以催化底物S-核糖同型半胱氨酸合成信號(hào)分子AI-2.因此，LuxS蛋白對(duì)于LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)具有重要意義［19］.

目前，國內(nèi)并未普及商品化且高純度的信號(hào)分子AI-2，嚴(yán)重制約了關(guān)于LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究工作.獲取AI-2的方法主要是從能夠產(chǎn)生AI-2的無菌上清中獲取或通過關(guān)鍵酶S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（Pfs）和S-核糖高半胱氨酸裂解酶（LuxS）在體外合成AI-2.第一種方法成本高、得率低、上清中成分復(fù)雜，因此一般采用體外合成的方法來獲取AI-2［20］.在細(xì)菌體內(nèi)，AI-2的產(chǎn)生以S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）為底物，經(jīng)Pfs酶迅速降解產(chǎn)生S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）.隨后，SRH經(jīng)LuxS蛋白催化分解成為4，5-羥基-2，3-戊二酮（4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione，DPD）和同型半胱氨酸兩種產(chǎn)物.其中同型半胱氨酸獲得甲基生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）再次進(jìn)入循環(huán)，而DPD通過分子重排的方式形成AI-2［21］.在這一過程中LuxS蛋白成為關(guān)鍵，并且此前已有研究表明，經(jīng)過動(dòng)態(tài)光散射測量表明LuxS蛋白在溶液中以二聚體形式存在，其亞基通過晶體對(duì)稱相關(guān).二聚體界面的中心部分是由單體薄片組成的結(jié)構(gòu)，并且二聚體的結(jié)構(gòu)與一般的同源二聚物結(jié)構(gòu)類似，平均表面積達(dá)到1 685［22］.這種穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)能夠充分保證在異源表達(dá)的過程中LuxS蛋白不會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變性，能夠直接作為AI-2合成的催化酶.因此目前獲得LuxS蛋白主要通過異源表達(dá)系統(tǒng)獲得.體外合成的過程中如何提高重組蛋白的表達(dá)量，獲得大批量、高純度、有活性的LuxS酶成為急需解決的問題.

信號(hào)肽假說是美國學(xué)者Gunter Blobel于20世紀(jì)70年代提出的假說，在蛋白的異源表達(dá)中信號(hào)肽能夠引導(dǎo)外源蛋白定位并分泌到特定區(qū)間，提高可溶性，避免形成包涵體而無法發(fā)揮蛋白活性［23-24］.因此，在進(jìn)行重組蛋白的異源表達(dá)前必須進(jìn)行合理的分析預(yù)測，對(duì)于無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的蛋白應(yīng)選擇能夠表達(dá)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的載體或者宿主以幫助蛋白的活性表達(dá).本研究中，通過在線預(yù)測工具對(duì)LuxS蛋白的基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，除基本結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)外，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號(hào)肽結(jié)構(gòu).在后續(xù)的表達(dá)中選擇了大腸桿菌E. coli BL21（DE3）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).因?yàn)樵摼昃哂懈咝У霓D(zhuǎn)錄和翻譯能力，能夠在胞內(nèi)表達(dá)出大量的目的蛋白，并且研究表明該菌株表達(dá)蛋白比使用其他宿主菌的效果好且可溶性更高［25］.

重組蛋白的表達(dá)效率受到誘導(dǎo)條件的影響.因此， LuxS蛋白表達(dá)量的提高需要對(duì)蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，尋找最佳的組合.響應(yīng)面優(yōu)化法在優(yōu)化研究中應(yīng)用廣泛，能降低優(yōu)化成本、提高優(yōu)化效率且能夠綜合多因素之間的交互作用.因此，響應(yīng)面法被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、生物、化學(xué)等不同領(lǐng)域的優(yōu)化工作［26-27］.本研究首先采取單因素優(yōu)化確定了合適的誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度范圍，結(jié)果表明該蛋白在誘導(dǎo)條件為37 ℃時(shí)蛋白表達(dá)量較高，因?yàn)榇藴囟仁谴竽c桿菌的最適生長溫度，使得蛋白能夠有較高水平的表達(dá)量.但是誘導(dǎo)表達(dá)溫度也會(huì)影響可溶性重組蛋白的影響，從結(jié)果可以看出37 ℃條件下表達(dá)的蛋白多為不可溶性蛋白，可能是因?yàn)樵诖藴囟认戮w生長旺盛，蛋白表達(dá)量較高，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊形成包涵體結(jié)構(gòu).彭方毅等［28］構(gòu)建了pEGX-KG-HPV16L重組質(zhì)粒，并利用E. coli BL21（DE3）作為表達(dá)菌株，在37 ℃以包涵體形式成功表達(dá)出HPV16L蛋白.

用0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，LuxS蛋白有較高水平的表達(dá)量.但是，隨著誘導(dǎo)劑濃度增加，蛋白表達(dá)量逐漸出現(xiàn)平緩趨勢，并且這一趨勢隨著誘導(dǎo)劑濃度的提高而逐漸明顯.誘導(dǎo)時(shí)間為48 h蛋白表達(dá)量較高，且為可溶性表達(dá).通過響應(yīng)面模型分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素對(duì)蛋白表達(dá)產(chǎn)量的影響程度由大到小依次為：誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度.

4 結(jié) 論

本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了LuxS蛋白的基本結(jié)構(gòu)，并通過單因素與響應(yīng)面法優(yōu)化了LuxS蛋白的表達(dá)條件.結(jié)果表明，LuxS蛋白在37 ℃，31 h，IPTG 0.5 mmol/L的條件下蛋白表達(dá)量達(dá)到最大.本研究實(shí)現(xiàn)了LuxS蛋白表達(dá)水平的最高水平的優(yōu)化，顯著提高了LuxS的表達(dá)量，并在后續(xù)的研究中成功合成了具有生物活性的信號(hào)分子AI-2［14］，為體外合成信號(hào)分子AI-2奠定了基礎(chǔ)，并為LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究提供了科學(xué)支持.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.03.29.0001）.

參 考 文 獻(xiàn)

［1］YADAV M K，VIDAL J E，GO Y Y，et al.The LuxS/AI-2 quorum-sensing system of Streptococcus pneumoniae is required to cause disease，and to regulate virulence-and metabolism-related genes in a rat model of middle ear infection［J］.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2018，8：138.

［2］WHITELEY M，DIGGLE S P，GREENBERG E P.Progress in and promise of bacterial quorum sensing research［J］.Nature，2017，551（7680）：313-320.

［3］GE S M，ZHAO Y Z，LIU D，et al.Characterization of an N-acylhomoserine lactonase from Serratia sp. and its biofouling mitigation in a membrane bioreactor［J］.Microbiological Research，2022，264：127175.

［4］GORDON C P，OLSON S D，LISTER J L，et al.Truncated autoinducing peptides as antagonists of Staphylococcus lugdunensis quorum sensing［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2016，59（19）：8879-8888.

［5］BASSLER B L，WRIGHT M，SILVERMAN M R.Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi：sequence and function of genes encoding a second sensory pathway［J］.Molecular Microbiology，1994，13（2）：273-286.

［6］SUN J B，DANIEL R，WAGNER-DBLER I，et al.Is autoinducer-2 a universal signal for interspecies communication：a comparative genomic and phylogenetic analysis of the synthesis and signal transduction pathways［J］.BMC Evolutionary Biology，2004，4：36.

［7］YU D，ZHAO L P，XUE T，et al.Staphylococcus aureus autoinducer-2 quorum sensing decreases biofilm formation in an icaR-dependent manner［J］.BMC Microbiology，2012，12：288.

［8］VENDEVILLE A，WINZER K，HEURLIER K，et al.Making 'sense' of metabolism：autoinducer-2，LuxS and pathogenic bacteria［J］.Nature Reviews Microbiology，2005，3（5）：383-396.

［9］WANG Y，LIU B B，GRENIER D，et al.Regulatory mechanisms of the LuxS/AI-2 system and bacterial resistance［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2019，63（10）：e01186.

［10］DENG Z X，HOU K W，VALENCAK T G，et al.AI-2/LuxS quorum sensing system promotes biofilm formation of Lactobacillus rhamnosus GG and enhances the resistance to enterotoxigenic Escherichia coli in germ-free zebrafish［J］.Microbiology Spectrum，2022，10（4）：e0061022.

［11］ZHANG B Z，KU X G，ZHANG X Q，et al.The AI-2/luxS quorum sensing system affects the growth characteristics，biofilm formation，and virulence of Haemophilus parasuis［J］.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2019，9：62.

［12］RAJAN R，ZHU J G，HU X B，et al.Crystal structure of S-ribosylhomocysteinase（LuxS） in complex with a catalytic 2-ketone intermediate［J］.Biochemistry，2005，44（10）：3745-3753.

［13］ZHU J G，DIZIN E，HU X B，et al.S-Ribosylhomocysteinase（LuxS） is a mononuclear iron protein［J］.Biochemistry，2003，42（16）：4717-4726.

［14］HAN S，LU C J，QIN M Y，et al.Alleviation effect of Deinococcus sp.Y35 together with autoinducer 2 on the physiological stress caused by Microcystis aeruginosa to zebrafish intestines［J］.Aquaculture，2023，576：739880.

［15］WATERS C M，BASSLER B L.Quorum sensing：cell-to-cell communication in bacteria［J］.Annual Review of Cell and Developmental Biology，2005，21：319-346.

［16］ANETZBERGER C，PIRCH T，JUNG K.Heterogeneity in quorum sensing-regulated bioluminescence of Vibrio harveyi［J］.Molecular Microbiology，2009，73（2）：267-277.

［17］XIONG Q，LIU D，ZHANG H H，et al.Quorum sensing signal autoinducer-2 promotes root colonization of Bacillus velezensis SQR9 by affecting biofilm formation and motility［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2020，104（16）：7177-7185.

［18］YU T，MA M Y，SUN Y X，et al.The effect of sublethal concentrations of benzalkonium chloride on the LuxS/AI-2 quorum sensing system，biofilm formation and motility of Escherichia coli［J］.International Journal of Food Microbiology，2021，353：109313.

［19］WANG Y，WANG Y X，SUN L Y，et al.The LuxS/AI-2 system of Streptococcus suis［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2018，102（17）：7231-7238.

［20］PEREIRA C S，THOMPSON J A，XAVIER K B.AI-2-mediated signalling in bacteria［J］.FEMS Microbiology Reviews，2013，37（2）：156-181.

［21］林才云，江艷華，姚琳，等.信號(hào)分子AI-2的體外合成及其對(duì)副溶血性弧菌四環(huán)素耐藥性的調(diào)控作用［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2020，47（5）：1321-1331.

LIN C Y，JIANG Y H，YAO L，et al.In vitro synthesis of AI-2 and its effect on tetracycline resistance of Vibrio parahaemolyticus［J］.Microbiology China，2020，47（5）：1321-1331.

［22］SCHAUDER S，SHOKAT K，SURETTE M G，et al.The LuxS family of bacterial autoinducers：biosynthesis of a novel quorum-sensing signal molecule［J］.Molecular Microbiology，2001，41（2）：463-476.

［23］HILGERS M T，LUDWIG M L.Crystal structure of the quorum-sensing protein LuxS reveals a catalytic metal site［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（20）：11169-11174.

［24］韋雪芳，王冬梅，劉思，等.信號(hào)肽及其在蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2006，22（6）：38-42.

WEI X F，WANG D M，LIU S，et al.Signal sequence and its application to protein expression［J］.Biotechnology Bulletin，2006，22（6）：38-42.

［25］張真，汪燕，馬振剛.提高大腸桿菌重組蛋白可溶性表達(dá)方法研究進(jìn)展［J］.廣東蠶業(yè)，2019，53（7）：37-40.

ZHANG Z，WANG Y，MA Z G.Advances in improving the soluble expression of Escherichia coli recombinant protein［J］.Guangdong Sericulture，2019，53（7）：37-40.

［26］張宇萌，童梅，陸小冬，等.提高大腸桿菌可溶性重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2016，36（5）：118-124.

ZHANG Y M，TONG M，LU X D，et al.Advances in promoting soluble expression of recombinant protein in Escherichia coli［J］.China Biotechnology，2016，36（5）：118-124.

［27］OCKULY R A，WEESE M L，SMUCKER B J，et al.Response surface experiments：a meta-analysis［J］.Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems，2017，164：64-75.

［28］彭方毅，姜海蓉，陳遠(yuǎn)翔，等.HPV 16L1基因的原核表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，39（4）：395-398.

PENG F Y，JIANG H R，CHEN Y X，et al.Prokaryotic expression of HPV 16L1 and optimization of expression conditions［J］.Journal of Zhejiang University（Medical Sciences），2010，39（4）：395-398.

Optimization of expression conditions for signal molecule AI-2 synthetic protein LuxS by response surface methodology

Abstract： Quorum sensing is a density-dependent gene expression regulation method mediated by autoinducers（AIs） in bacteria， which has been proven to participate in the regulation of multiple physiological functions of bacteria. The LuxS/AI-2 type quorum sensing system mediated by signal molecule AI-2 is widely present in Gram positive bacteria and negative bacteria， which has received considerable attentions. The synthesis of AI-2 depends on the catalytic action of S-ribosylhomocysteinase（LuxS）， and the LuxS protein is obtained through transcription and translation of the luxS gene. The purpose of this study is to explore the optimal expression conditions of LuxS protein in the expression strain Escherichia coli BL21（DE3）， thereby obtaining a high yield of LuxS protein with certain biological activity. This study first predicted the structure of LuxS protein and determined that E. coli BL21（DE3） was used as the expression strain. Secondly， response surface methodology was further used to optimize the expression conditions of LuxS protein based on single factor optimization. The highest expression condition of LuxS protein was obtained under the conditions of bacterial concentration with OD600 of 0.5， induction temperature of 37 ℃， IPTG concentration of 0.5 mmol/L， and induction time of 31 h. This study successfully optimized the expression conditions of LuxS protein in E. coli BL21（DE3）， and obtained high yield of LuxS protein with biological activity， laying a foundation for the synthesis of AI-2 in vitro.

Keywords： quorum sensing; AI-2; LuxS protein; prokaryotic expression; optimization of conditions

附 錄