玉米苗期和萌發(fā)期抗旱指數(shù)篩選及評(píng)價(jià)

關(guān)鍵詞：玉米雜交種；脅迫處理；萌發(fā)期；苗期；抗旱系數(shù)；聚類分析

黃淮海地區(qū)水資源匱乏，可利用水資源嚴(yán)重短缺，極大限制了作物生產(chǎn)。玉米屬于水分中度敏感作物，尤其萌發(fā)期和苗期干旱或缺水已成為影響玉米生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量形成的重要非生物脅迫因子。單粒播種模式下，苗期和萌發(fā)期的抗旱性往往影響田間出苗率，進(jìn)而影響收獲籽粒的產(chǎn)量。所以，玉米品種苗期和萌發(fā)期的抗旱性評(píng)價(jià)研究顯得尤為重要。

在正常環(huán)境下，一些抗旱品種產(chǎn)量較低；在輕度干旱環(huán)境下，一些品種雖然不抗旱，但最終產(chǎn)量高于抗旱品種；而在重度干旱環(huán)境下，抗旱品種的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不抗旱品種[1]?？购敌澡b定可以篩選出適合不同地區(qū)種植的玉米品種，這對(duì)于降低種植成本，提高玉米產(chǎn)量具有重要的作用。干旱對(duì)作物的影響從種子萌發(fā)開始，貫穿整個(gè)生長(zhǎng)階段。根據(jù)玉米的形態(tài)特征以及發(fā)育時(shí)期，其抗旱性鑒定可以分為4個(gè)時(shí)期，即萌發(fā)期、苗期、開花期和灌漿期[2-4]。不同學(xué)者篩選的抗旱性評(píng)價(jià)指標(biāo)以及方法不同，目前常用的指標(biāo)包括形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)和產(chǎn)量指標(biāo)[5]。因此，評(píng)價(jià)品種抗旱性首先需要選擇其相關(guān)的指標(biāo)。玉米的抗旱性屬于數(shù)量遺傳性狀，且由多個(gè)微效基因控制，易受環(huán)境因素影響[6]，因此通過(guò)單一指標(biāo)對(duì)玉米抗旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)存在一定的局限性，需要多個(gè)指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)[710]。通常，抗旱性評(píng)價(jià)通過(guò)比較水分脅迫和正常灌溉條件下農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和光合特性的差異，以抗旱系數(shù)為基本評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用逐步回歸法建立最優(yōu)回歸方程，同時(shí)結(jié)合相關(guān)性分析、隸屬度及聚類分析對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行抗旱性鑒定及抗旱指標(biāo)篩選[78]。然而抗旱指標(biāo)增多，極大地增加了抗旱鑒定的工作量及重復(fù)度。不同指標(biāo)對(duì)干旱脅迫的敏感度不同，篩選對(duì)干旱脅迫敏感的指標(biāo)對(duì)抗旱性鑒定具有重要意義。因此，本研究以多年來(lái)審定的黃淮海地區(qū)種植面積較大的主推玉米品種為材料，在萌發(fā)期和苗期進(jìn)行抗旱性鑒定，旨在篩選快速準(zhǔn)確的抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，為黃淮海不同生態(tài)區(qū)篩選抗旱品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

18份供試玉米雜交種為多年來(lái)審定的大面積種植的品種。其中，先玉335苗期植株數(shù)量不足，未列入苗期抗旱性評(píng)價(jià)。

1.2 試驗(yàn)材料處理及指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 萌發(fā)期性狀測(cè)定 選取大小一致、飽滿、無(wú)病害的種子100粒，75%乙醇浸泡30 min進(jìn)行消毒，蒸餾水清洗3次。將種子平鋪于含多層濾紙的培養(yǎng)皿。皿內(nèi)加注霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液（CK）或質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20%的PEG-6000溶液（介質(zhì)為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液），即每個(gè)品種設(shè)置CK和PEG 2個(gè)環(huán)境條件；用于萌發(fā)培養(yǎng)皿置于25℃、12 h/12 h光的培養(yǎng)室培養(yǎng)6 d。其中，每2 d更換皿內(nèi)介質(zhì)培養(yǎng)液和濾紙。從第2天開始每天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)指標(biāo)，至第6 d結(jié)束，包括種子發(fā)芽率（germination rate，GR）、發(fā)芽勢(shì)（germination potential， GP）和發(fā)芽指數(shù)（germination index， GI）[11]，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 苗期性狀測(cè)定 對(duì)17份玉米雜交種（先玉335除外）進(jìn)行苗期實(shí)驗(yàn)，其中，脅迫和CK處理分別注入20% PEG-6000溶液（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)，介質(zhì)為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)液）和霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)液。放置光照培養(yǎng)箱內(nèi)（10 h光照， 24～30 ℃；14 h黑暗，18～23 ℃）培養(yǎng)，育苗盤中每次注入定量培養(yǎng)液保持蛭石濕潤(rùn)。待胚根長(zhǎng)至3 cm，選取20株長(zhǎng)勢(shì)一致的萌發(fā)籽粒移至花盆，每盆移栽1株。移栽后的幼苗置于溫室，10 h光照/14 h黑暗，溫度和濕度分別為（25±1）℃和46%±1%，待幼苗至三葉一心期，鑒定8個(gè)表型性狀。

苗期8個(gè)性狀包括丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量（MDA content，MC）、葉綠素含量（chlorophyll content，CC）、根干重（root dry weight，DR）、冠干重（shoot dry weight，DS）、株干重（plantdry weight，DP）、株鮮重（plant fresh weight， FP）、根冠干重比（DR/DS）和單株干鮮比（D/F）。

MC 采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[12]：稱取0.2 g干旱脅迫和對(duì)照的苗期葉片，加入10%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）2 mL和少量石英砂研磨，再次加入8 mL TCA充分研磨，將勻漿導(dǎo)入離心管中，4 000 r·min-1 離心10 min，上清液即為MDA提取液。取2 mL MDA提取液至空白試管中，加入2 mL 0.6% 的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）混勻，100 ℃恒溫水浴15 min后，迅速水浴冷卻，4 000 r·min-1 離心15 min，取上清液使用分光光度計(jì)（Konica Minolta CL-500A， 翁開爾（北京）科技有限公司），波長(zhǎng)600、532和450 nm下測(cè)定吸光值，重復(fù)3次。

葉綠素含量（CC）采用二甲基亞砜法[13]測(cè)定：稱取玉米苗期0.1 g的葉片，剪碎后放入研缽中研磨，加入10 mL乙醇研磨成勻漿，再加入5 mL乙醇并過(guò)濾，最后將乙醇定容到25 mL。取光徑為1 cm的比色杯，加入葉綠素乙醇溶液，另加乙醇于同樣規(guī)格的比色杯中作為對(duì)照，使用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)663 nm和645 nm下測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均生物學(xué)重復(fù)3次。

取整株玉米幼苗，迅速放入鋁盒，稱量其鮮重，以及分別取幼苗地上和地下鮮重。之后，將鋁盒放入105 ℃烘箱15 min，然后于80 ℃下烘至恒重，稱量相應(yīng)干重，每個(gè)處理均重復(fù)3次。計(jì)算植株干鮮比和根冠干重比。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

基于表型數(shù)據(jù)分別進(jìn)行抗旱系數(shù)（droughtresistance coefficient，DC）評(píng)價(jià)，以消除品種間差異。同時(shí)，使用各性狀抗旱系數(shù)進(jìn)行性狀間相關(guān)性分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析，進(jìn)而評(píng)價(jià)多性狀間相關(guān)程度，進(jìn)行品種的抗旱性分級(jí)。使用Microsoft Excel2010 和IBM SPSS Statistics 26.0 整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行PEG和CK處理間的t 檢驗(yàn)及差異顯著性分析?；诼?lián)川云平臺(tái)（https：//www.omicstudio.cn/home），進(jìn)行品種間WC的相關(guān)性分析、PCA分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG 脅迫下對(duì)玉米雜交種萌發(fā)期和苗期表型評(píng)價(jià)

2.1.1 萌發(fā)期表型評(píng)價(jià) PEG-6000脅迫下， 玉米品種GR、GP和GI表現(xiàn)出不同程度的下降（圖1），其范圍分別為7.33～97.78、14.81～97.69 和33.25～98.59。除了V9（農(nóng)大372）的發(fā)芽率外，脅迫下其余品種種子萌發(fā)表型均存在顯著差異（Plt;0.05）（圖1），預(yù)示它們可作為品種萌發(fā)期抗旱性評(píng)價(jià)的重要依據(jù)；基于抗旱系數(shù)（DC）的萌發(fā)期表型評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，供試材料WC 位于0.00～0.96。V7（先玉047）和V12（洰豐1518）的抗旱性分別表現(xiàn)為最強(qiáng)和最弱（圖2）。其中，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)的WC 值均位于0.00～1.00。按GR、GP 和GI 的WC 標(biāo)準(zhǔn)獲得的抗旱性最強(qiáng)的品種分別為V9 （農(nóng)大372）、V4 （京科968） 和V7 （先玉047），最弱的品種分別為 V12 （洰豐1518） V12 （洰豐1518）和 V12 （洰豐1518）。按GR、GP和GI的標(biāo)準(zhǔn)，各性狀抗旱較強(qiáng)品種（V9/V4/V7）的WC值分別為1.00/0.85/0.95、0.73/1.00/0.90、0.58/0.69/1.00。3 個(gè)抗旱性較強(qiáng)品種的發(fā)芽率間或發(fā)芽勢(shì)間差異不明顯，發(fā)芽指數(shù)間差異明顯，與Ti值的評(píng)價(jià)得分一致（圖2）。因而可將Ti值作為萌發(fā)期抗旱性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；PEG-6000脅迫對(duì)抗旱性敏感型品種GR、GP和GI的評(píng)價(jià)指標(biāo)呈現(xiàn)的趨勢(shì)不完全一致，建議品種抗旱性評(píng)價(jià)使用綜合指標(biāo)，即Ti值評(píng)價(jià)更可靠。發(fā)芽率反映出苗率，發(fā)芽勢(shì)反映種子發(fā)芽的快慢程度。發(fā)芽勢(shì)高的種子活力高，出苗整齊，而且苗壯，長(zhǎng)勢(shì)一致。發(fā)芽率高的種子不一定發(fā)芽勢(shì)高，發(fā)芽率高、發(fā)芽勢(shì)低的種子一般出苗速度慢，會(huì)出現(xiàn)出苗不整齊，苗弱的現(xiàn)象。因而建議品種萌發(fā)期抗旱性評(píng)價(jià)使用綜合指標(biāo)（Ti）。

2.1.2 苗期表型評(píng)價(jià) PEG脅迫和對(duì)照環(huán)境下，鑒定了17份玉米雜交種苗期8個(gè)性狀的抗旱性表型，結(jié)果如圖3和4所示。MDA是抗旱性評(píng)價(jià)細(xì)胞膜過(guò)氧化傷害強(qiáng)弱的指標(biāo)，而葉綠素含量也是衡量干旱脅迫下植物光合作用能力的重要指標(biāo)之一[1415]。干旱脅迫下玉米雜交種苗期葉片MDA和葉綠素含量比對(duì)照（CK）顯著提高（除V16 外）。PEG脅迫和對(duì)照環(huán)境下相同品種的其他6個(gè)性狀均表現(xiàn)不同程度變化。說(shuō)明17個(gè)玉米品種對(duì)干旱脅迫具有響應(yīng)，適合用于構(gòu)建抗旱性評(píng)價(jià)體系及篩選抗旱品種；對(duì)于MC和CC性狀的抗旱系數(shù)（DC）值均大于1（除V16），而其他6個(gè)性狀DC的變化趨勢(shì)具有較高的一致性（除V3、V10 和V13外），也預(yù)示了雜交種對(duì)抗旱脅迫具有響應(yīng)及適合用于構(gòu)建苗期抗旱性評(píng)價(jià)體系；除了V4～V9 和V15外，其他玉米品種的8個(gè)性狀的Ti變化趨勢(shì)均不具有一致性，因而需借助其他方法進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)。

2.2 玉米雜交種萌發(fā)期和苗期表型性狀間的相關(guān)性分析

萌發(fā)期性狀間相關(guān)性分析（表2）顯示，GR、GP和GI的DC和WC均相對(duì)獨(dú)立，顯著極顯著正相關(guān)，可作為種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的參考指標(biāo)。因而可將GR、GP和GI性狀DC的WC的Ti值作為供試品種萌發(fā)期抗旱性鑒定指標(biāo)。

苗期性狀間相關(guān)性分析（表2）顯示：MDA含量（MC）和株鮮重（FP）與其他性狀間均無(wú)顯著性相關(guān)，葉綠素含量（CC）僅與干重根冠比（DR/DS）間顯著相關(guān)。根干重（DR）、冠干重（DS）、株干重（DP）、根冠干重比（DR/DS）和干鮮比（D/F）均呈顯著正相關(guān)（表2）。性狀間相關(guān)性分析將為進(jìn)一步的玉米苗期抗旱性品種評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建提供重要依據(jù)。

2.3 玉米雜交種苗期表型的PCA 分析

由于MDA含量（MC）和株鮮重（FP）與其他性狀相關(guān)性不顯著，對(duì)其他6個(gè)性狀進(jìn)行了主成分分析（PCA）。結(jié)果顯示：大于1的特征值分別為3.10和1.89，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到83.28%，能充分概括大多數(shù)指標(biāo)，符合指標(biāo)選擇標(biāo)準(zhǔn)，因而提取這2個(gè)主成分進(jìn)行分析。PCA1累計(jì)貢獻(xiàn)率為51.71%，PCA2累計(jì)貢獻(xiàn)率為31.57%，它們涵蓋了17個(gè)玉米品種6個(gè)指標(biāo)83.28%信息，能夠作為該主成分的作用因子（表3）。因而可將6個(gè)苗期DC作為苗期耐旱性評(píng)價(jià)的指標(biāo)；由2個(gè)主成分特征值構(gòu)成因素特征向量的主成分的解析式。

式中，P2、P3、P4、P5、P6 和P8 分別為葉綠素含量（CC）、根干重（DR）、冠干重（DS）、株干重（DP）、干重根冠比（DR/DS）和干鮮比（D/F）的DC。

綜合PCA1和PCA2解析式，以各主成分貢獻(xiàn)率為權(quán)重對(duì)主成分得分進(jìn)行加權(quán)平均，獲得抗旱綜合得分，計(jì)算公式如下。

將各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值代入表達(dá)式，即可獲得玉米雜交種品種的抗旱綜合得分，綜合得分越高，抗旱性越強(qiáng)。從圖5可以看出，苗期最為強(qiáng)抗旱型品種為豫單9953（V18）、明科玉33（V11）和華農(nóng)887（V15），而最為敏感型品種為京農(nóng)科728（V14）、裕豐105（V13）和鄭單958（V1）。

2.4 玉米雜交種萌發(fā)期和苗期抗旱性的聚類分析

2.4.1 萌發(fā)期性狀間聚類分析 利用聯(lián)川云平臺(tái)（https：//www.omicstudio.cn/），基于萌發(fā)期GR、GP和GI的DC和Ti進(jìn)行了聚類分析（圖6A），可將18個(gè)玉米品種分為3個(gè)組群：第1組群包括11個(gè)玉米品種，即鄭單958（V1）、京單28（V3）、華農(nóng)138（V5）、先玉048 （V6）、先玉1140 （V8）、Ls838 （V10）、洰豐1518 （V12）、華農(nóng)887 （V15）、豐德存玉10 號(hào)（V17）和豫單9953 （V18），它們的綜合Ti 為0.00～0.35，屬于抗旱敏感型；第2組群包含3個(gè)品種，即明科玉33 （V11）、裕豐105 （V13）和MC817 （V16），它們的綜合Ti為0.53～0.66，屬于抗旱中間型；第3組群包含4 個(gè)品種，即先玉335 （V2）、京科968（V4）、先玉047 （V7）、農(nóng)大372 （V9），它們的綜合Ti為0.77～0.96，屬于抗旱型。

2.4.2 苗期性狀間聚類分析 基于苗期8個(gè)性狀的DC和Ti進(jìn)行聚類分析（圖6B），可將17個(gè)玉米品種分為3個(gè)組群：第1組群包括5個(gè)玉米品種，即先玉1140 （V8）、MC817 （V16）、鄭單958 （V1）、裕豐105 （V13）和京農(nóng)科728 （V14），8個(gè)性狀DC的綜合Ti為0.55，屬于抗旱敏感型；第2組群包含5個(gè)品種，即豐德存玉10 （V17）、京單28 （V3）、先玉048 （V6）、Ls838 （V10）和洰豐1518 （V12），8個(gè)性狀DC的綜合Ti為0.49，屬于抗旱中間型；第3組群包含7個(gè)品種，即豫單9953 （V18）、明科玉33 （V11）、華農(nóng)887 （V15）、京科968 （V4）、先玉047 （V7）、華農(nóng)138 （V5）、農(nóng)大372 （V9），8 個(gè)性狀DC 的綜合Ti 為0.30，屬于抗旱型。

2.4.3 萌發(fā)期和苗期抗旱性品種 在萌發(fā)期（圖6A），基于綜合抗旱性指標(biāo)Ti值，獲得了抗旱性品種為先玉335 （V2）、京科968 （V4）、先玉047 （V7）、農(nóng)大372 （V9），它們的綜合Ti為0.77～0.96；聚類分析獲得抗病品種先玉335 （V2）、京科968 （V4）、先玉047 （V7）、農(nóng)大372 （V9）。在苗期（圖6B），8個(gè)性狀的PCA分析，獲得了抗旱性品種為豫單9953 （V18）、明科玉33 （V11）、華農(nóng)887 （V15）、京科968 （V4）和先玉047 （V7），其得分值大于0.5；基于聚類分析，獲得了豫單9953 （V18）、明科玉33 （V11）、華農(nóng)887 （V15）、京科968 （V4）、先玉047 （V7）、華農(nóng)138 （V5）、農(nóng)大372 （V9）為苗期抗旱性品種。獲得萌發(fā)期和苗期均抗旱的品種為京科968 （V4）、先玉047 （V7）和農(nóng)大372 （V9）。

3 討論

干旱是玉米生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中非常重要的非生物脅迫因子，萌發(fā)期和苗期干旱缺水將影響出苗率和后期的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量降低[1617]。玉米萌發(fā)期和苗期的抗旱性評(píng)價(jià)過(guò)程顯示了對(duì)干旱的敏感性[10]。高粱、棉花、豌豆、小麥、水稻等作物的萌發(fā)期和苗期的抗旱性也顯示了品種對(duì)干旱的敏感性[18-20]，因而玉米萌發(fā)期和苗期的抗旱性評(píng)價(jià)具有重要的實(shí)踐意義。作物萌發(fā)期和苗期使用PEG脅迫鑒定抗旱性具有用時(shí)短、易于重復(fù)和試驗(yàn)條件穩(wěn)定易控制等優(yōu)點(diǎn)，因而脅迫鑒定法適合用于作物的抗旱性鑒定。

作物抗旱指標(biāo)通常使用形態(tài)學(xué)指標(biāo)、產(chǎn)量指標(biāo)以及生理生化指標(biāo)，能實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的抗旱性鑒定，因而被廣泛使用。研究表明，萌發(fā)期選用發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、萌發(fā)抗旱系數(shù)等指標(biāo)或相對(duì)值作為抗旱性關(guān)鍵指標(biāo)[18-20]，相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)芽長(zhǎng)和相對(duì)根長(zhǎng)是耐旱鑒定的３ 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)[21]。苗期選取株高、葉寬、葉厚、莖粗、分蘗數(shù)、枯葉率、根長(zhǎng)、地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重、總鮮重、總干重、組織含水量、根冠比鮮重、根冠比干重以及葉綠素等性狀指標(biāo)進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)，盡管干旱脅迫下，作物間種質(zhì)資源存在較大變異，但已報(bào)道的農(nóng)作物的苗期抗旱性指標(biāo)選擇研究結(jié)果具有一致性[22]。因此，選擇與抗旱性高度相關(guān)的性狀對(duì)品種進(jìn)行評(píng)價(jià)，將有利于抗旱型玉米雜交種的的快速鑒定和篩選。本研究使用PEG-6000模擬干旱脅迫環(huán)境，使用萌發(fā)期的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和苗期的相對(duì)丙二醛含量、相對(duì)葉綠素含量、相對(duì)干鮮重以及相對(duì)根冠比等表型數(shù)據(jù)，利用抗旱系數(shù)、主成分分析法、聚類分析、DC值的權(quán)重系數(shù)及其綜合權(quán)重系數(shù)方法構(gòu)建了玉米雜交種品種的抗旱性評(píng)價(jià)體系，性狀的選擇及評(píng)價(jià)方法合理，可用于玉米品種抗旱性評(píng)價(jià)。