施氮量對云煙121上部煙葉代謝及品質(zhì)的影響

關鍵詞：云煙121；上部葉；施氮量；烤后煙質(zhì)量；代謝組學；超微結(jié)構(gòu)；農(nóng)藝性狀

烤煙上部葉產(chǎn)量約占煙葉總產(chǎn)量的40%[1]，優(yōu)質(zhì)上部葉比中、下部葉香氣更濃郁，在葉組配方中起著主導作用[2]。目前，多家卷煙企業(yè)面臨著原料品種單一、品質(zhì)下降等問題，多數(shù)新品種煙草在卷煙配方中未得到大規(guī)模應用，因此拓展和豐富卷煙工業(yè)煙葉原料采購空間、滿足工業(yè)維持卷煙風格穩(wěn)定的任務亟待解決。這就需要對新品種煙株進行綜合評價，確定適宜的培育條件，并提高上部葉的質(zhì)量與可用性。通過分析不同品種云煙之間的外觀性狀、物理特性、化學成分及感官質(zhì)量差異發(fā)現(xiàn)，在云南煙區(qū)生態(tài)條件下，云煙121表現(xiàn)出較好的環(huán)境適應性，且烤后煙葉質(zhì)量相對較好，更能滿足特定卷煙品牌（例如“利群”品牌）對優(yōu)質(zhì)原料的需求[34]。而目前適宜云煙121生長的培育條件鮮有報道，為促進優(yōu)質(zhì)原料生產(chǎn)的持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展，有必要對云煙121生長的適宜條件進行探究和挖掘。氮素作為烤煙必需的營養(yǎng)元素之一，與相關物質(zhì)的合成和積累密不可分[56]。氮肥不足，煙株營養(yǎng)不良，產(chǎn)量降低；氮肥過量，導致上部葉煙堿含量高、糖堿比低，化學成分不協(xié)調(diào)，工業(yè)利用價值降低[7]。因此，研究煙草適宜的氮肥施用量，對生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)上部煙葉、提升品種經(jīng)濟效益具有重要意義。本研究針對云南曲靖煙區(qū)，從農(nóng)藝性狀、烤后煙質(zhì)量、超微結(jié)構(gòu)與代謝組學角度確定云煙121的適宜施氮量，探明施氮水平對上部葉超微結(jié)構(gòu)、關鍵代謝物積累的影響，明確氮肥與煙葉品質(zhì)的內(nèi)在聯(lián)系，為進一步提高云煙121上部葉可用性和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)上部煙葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為云煙121，由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供。

1.2 試驗設計

大田試驗于云南省曲靖市陸良縣龍海試驗基地（25°03′N、103°66′E）進行，試驗田土壤質(zhì)地為紅土。土壤pH 6.28，有機質(zhì)含量32.45 g·kg-1，堿解氮含量146.86 mg·kg-1，速效磷含量38.92 mg·kg-1，速效鉀含量158.51 mg·kg-1。根據(jù)當?shù)赝寥婪柿统Ｒ?guī)施氮水平設置3個氮肥梯度，分別為施用純氮82.5（LF）、105.0（MF）和127.5 kg·hm-2（HF）。小區(qū)面積667 m2，重復3次。按適合該品種的配套設施進行管理。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀、株型與發(fā)病率調(diào)查 于上部葉采烤前7 d，統(tǒng)一從各處理中選擇具有代表性的5株煙株，參照YC/T 142—2010[8]測定從上往下數(shù)第5片葉（上部葉）的葉長、葉寬、葉面積、葉夾角及煙株的株高、徑圍、節(jié)距；參照株型劃分[9]，調(diào)查株高、葉層高、葉層寬、頂寬、底寬和葉層寬在葉層高上的位置等，計算株型。參照GB/T 23222—2008[10]，從各處理中隨機挑選100株統(tǒng)計氣候斑病與番茄斑萎病的發(fā)病率。

1.3.2 超微結(jié)構(gòu)觀察 于上部葉采烤前7 d，各處理統(tǒng)一選取發(fā)育良好且長勢一致的3株煙株，對從上往下數(shù)第5 葉位的葉片進行采收，剪成1 mm×1 mm 的小組織塊。將切割好的小組織塊轉(zhuǎn)移至裝有2.5%戊二醛的EP管內(nèi)固定，并用真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h后4 ℃固定保存及運輸；然后用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min，后移至1%鋨酸避光室溫固定7 h；再依次加入30%-50%-70%-80%-95%-100%乙醇上行脫水，每次1 h；隨后使用無水乙醇丙酮混合物脫水（體積比，無水乙醇∶丙酮=3∶1、0.5 h；無水乙醇∶丙酮=1∶1、0.5 h；無水乙醇∶丙酮=1∶3、0.5 h；丙酮1 h），Epon812滲透包埋，60 ℃下聚合24 h后，在超薄切片機（Leica UC7，德國）上切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，于透射電鏡（hitachi-HT7800，日本）下觀察并照相。

1.3.3 代謝組學檢測 于上部葉采烤前7 d，統(tǒng)一選取發(fā)育良好且長勢一致的不同施氮量煙株的3片上部葉（從上往下數(shù)第5葉位）采收，然后迅速置于液氮中冷凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存。準確稱量100 mg樣品于2 mL離心管中，加入600 μL甲醇（含2-氯-L-苯丙氨酸），渦旋振蕩30 s；再加入100 mg 玻璃珠，60 Hz 研磨90 s 后，室溫超聲15 min，12 000 r·min 離心10 min，使用0.22 μm膜過濾后，轉(zhuǎn)移到進樣小瓶，待液相色譜- 質(zhì)譜（liquid chromatography mass spectrometry， LC/MS）檢測。

1.3.4 烤后煙葉質(zhì)量鑒定 取各處理B2F等級的煙葉各2 kg進行煙葉質(zhì)量鑒定。參照GB 2635—1992[11]進行煙葉外觀質(zhì)量評價，評價項目包括葉片結(jié)構(gòu)、身份、油分、色度、雜色和成熟度。采用近紅外光譜法[12]測定煙葉中的總糖、還原糖、總堿、總鉀和總氯含量。根據(jù)YC/T 530—2015[13]方法鑒定煙葉感官質(zhì)量。采用三段式烘烤工藝進行調(diào)制，按烤煙42級國標進行分級，計算各小區(qū)上部煙葉（從上往下數(shù)，第1～6葉位）的產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價及不同等級煙葉比例。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用R軟件包Ropls分別對樣本數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）；采用MetaboAnalyst 軟件包對差異代謝物進行功能通路富集和拓撲學分析。富集得到的通路采用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）Mapper可視化工具進行差異代謝物與通路圖的瀏覽。采用Excel 2010繪制表格與柱狀圖。采用Adobe Illustrator CC 2018繪制代謝網(wǎng)絡圖。采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量煙株農(nóng)藝性狀與發(fā)病率數(shù)值對比

由表1可知，LF處理煙株的葉夾角顯著小于MF與HF處理；MF與HF處理煙株的節(jié)距顯著大于LF處理；其余指標無顯著性差異。LF處理的煙株以腰鼓形為主；MF處理以腰鼓形與長筒形為主；HF處理以長筒形為主。3種施氮量水平下，結(jié)合2 種病害綜合來看，MF 處理煙株的發(fā)病率較低。

2.2 不同施氮量煙株超微結(jié)構(gòu)對比

電鏡觀察柵欄細胞超微結(jié)構(gòu)（圖1）顯示，LF處理下細胞內(nèi)部分葉綠體與嗜鋨顆粒向細胞中部游離，葉綠體被膜破裂，淀粉粒體積較小，基粒片層較薄，結(jié)構(gòu)松散，排列無序，較為模糊，嗜鋨顆粒數(shù)量較少，體積??；MF處理下細胞內(nèi)葉綠體大部分沿質(zhì)膜邊緣分布，被膜形狀不規(guī)則，淀粉粒體積增大，基粒片層增厚，排列有序，相對清晰，嗜鋨顆粒數(shù)量增多，體積增大；HF處理下細胞內(nèi)可見細胞核，葉綠體均沿質(zhì)膜邊緣分布，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，淀粉粒、基粒片層、嗜鋨顆粒被完整地包裹在葉綠體被膜中，淀粉粒體積進一步增大，基粒片層受到淀粉粒擠壓，相對較薄，但較為清晰，嗜鋨顆粒體積增大，數(shù)量有所減少。

2.3 不同施氮量煙葉代謝組學分析

2.3.1 主成分分析 由圖2可知，在正、負離子模式下，樣品均被分為3組，各組間樣本分離明顯，表明代謝物存在顯著差異，各組內(nèi)樣本集中，表明樣本重復性好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

2.3.2 差異代謝物篩選 以Plt;0.05、VIPgt;1 為條件篩選差異代謝物。以LF為對照，MF相比LF代謝物含量上調(diào)的差異代謝物數(shù)量為107個，含量下調(diào)的差異代謝物為66個；HF相比LF上調(diào)的差異代謝物為186個，下調(diào)的差異代謝物為219個。由此表明，隨著施氮量的增加，上調(diào)的差異代謝物數(shù)、下調(diào)的差異代謝物數(shù)和總差異代謝物數(shù)均呈不斷增加趨勢（圖3）。

2.3.3 不同施氮量下煙葉差異代謝物富集通路篩選 為了挖掘受施氮量影響較大的代謝通路，根據(jù)差異代謝物的篩選條件，篩選出差異代謝物共352 種，對差異代謝物進行代謝通路富集分析。最終篩選出3條具有代表性的KEGG富集通路，分別是亞油酸代謝、酪氨酸代謝和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路（表2）。

2.3.4 不同施氮量下煙葉中差異代謝物富集通路分析 由表3可知，在亞油酸代謝途徑中，HF處理下的差異代謝物含量與LF和MF處理存在顯著差異，其中9-氧代十八烷-10，12-二烯酸和9，10-二羥基-12，13-環(huán)氧十八烷酸酯含量在HF處理下達到最高，其余差異代謝物含量隨氮水平的升高呈先增加后減少的趨勢，在HF處理下含量最低。

由表4 可知，在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑中，隨著氮水平的增加，苯基丙酮酸、3-脫氫莽草酸、L-天冬氨酸半醛含量呈降低趨勢； L-酪氨酸和莽草酸含量呈先增加后降低趨勢；而3-羥基苯甲酸含量呈先降低后升高趨勢。

由表5可知，在酪氨酸代謝途徑中，隨著氮水平的升高，琥珀酸、3，4-二羥基苯乙酸、4-羥基苯基乙醛、香草乙二醇和酪醇含量呈下降趨勢；酪胺含量呈升高趨勢；而均龍膽酸、4-香豆酸和香葉扁桃酸含量呈先升高后降低趨勢。LF和MF處理間的代謝物含量差異較小，而HF處理與LF和MF處理間代謝物含量差異較大，除酪胺外，其余差異代謝物含量均在HF處理下最低。

2.3.5 不同施氮量處理下煙草代謝網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)分析 參照KEGG通路繪制煙草代謝網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，并以HF處理為對照，標記差異代謝物含量變化，紅色表示上調(diào)，藍色表示下調(diào)，結(jié)果（圖4）表明，在該通路中，通過莽草酸途徑合成的莽草酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉种?、預苯酸與苯基丙酮酸后，最終合成為苯丙氨酸，隨后進入苯丙烷代謝途徑，生成L-酪氨酸、4-香豆酸、4-羥基苯乙醛、芥子醇、香豆醇等物質(zhì)。3個處理中，LF和MF處理除酪胺含量顯示下調(diào)外，其余差異代謝物含量均上調(diào)，而HF 處理則相反。

2.4 不同施氮量煙株烤后煙質(zhì)量分析

2.4.1 外觀質(zhì)量分析 由表6可知，不同氮水平烤后煙葉的外觀質(zhì)量整體差異較小。在LF處理下，煙葉結(jié)構(gòu)疏松、身份中等、油分略少，色度中至強、無雜色、成熟度好；在MF處理下，煙葉結(jié)構(gòu)疏松、身份中等、油分足、色度強、無雜色、成熟度好；在HF處理下，煙葉油分足、成熟度好、無雜色，但葉片結(jié)構(gòu)尚疏松，身份稍厚，色度中至強。整體而言，MF 處理下煙葉的外觀質(zhì)量略高于LF 和HF處理。

2.4.2 感官質(zhì)量分析 由表7可知， MF處理烤后煙葉的感官質(zhì)量總分最高；LF處理煙葉的香氣質(zhì)較MF處理低1分，香氣量、透發(fā)性、細膩程度、刺激性、干燥感均低0.5分，其煙香透發(fā)略弱，尚圓潤，口腔舒適度尚好；HF處理煙葉的香氣質(zhì)較MF處理低1分，香氣量、雜氣、細膩程度、柔和程度、刺激性、干燥感、余味均低0.5分，其煙香尚厚實，略帶焦香，喉部刺激稍顯，甜感偏弱。綜上，MF處理煙葉的整體感官質(zhì)量較好。

2.4.3 化學成分分析 由表8可知，隨著施氮水平的提高，煙葉的總糖、還原糖含量逐漸降低，總堿含量逐漸增多，鉀、氯含量也逐漸提高，兩糖比有所升高，糖堿比和鉀氯比有所降低，這與余小芬等[14]的研究結(jié)果一致。

2.4.4 經(jīng)濟性狀分析 由表9可知，HF處理的產(chǎn)量較LF和MF處理分別顯著提高10.1%和4.6%；MF 處理的均價較LF 和HF 處理分別顯著提高3.1%與9.9%，產(chǎn)值分別顯著提高10.2%和5.2%，上等煙比例分別顯著提高3.4% 和5.9%，由此表明，MF處理煙葉的經(jīng)濟性狀最好。

3 討論

3.1 施氮量對云煙121 農(nóng)藝性狀及發(fā)病率的影響

氮肥施用量是影響煙草農(nóng)藝性狀與病害發(fā)生率的重要因素。氮供應不足，煙株營養(yǎng)不良，抗病性降低；氮肥過量供應，會使葉片細胞壁變薄，更易遭受病害侵染，導致煙草病情加重；適量氮素供給，煙株營養(yǎng)良好，生長健壯，抗病能力強[15]。通過比較不同施氮量下云煙121的農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn)，各處理煙株的主要農(nóng)藝性狀無明顯差異，面對2022年曲靖煙區(qū)連續(xù)的低溫寡照氣候和嚴重的病害情況，MF處理煙株表現(xiàn)出較低的發(fā)病率。

3.2 施氮量對云煙121 煙葉超微結(jié)構(gòu)的影響

葉綠體是烤煙細胞中合成糖類、色素和有機酸等化合物的主要場所，而葉綠體內(nèi)積累的嗜鋨顆粒是構(gòu)成煙葉香氣、油分的重要原料[16]，因此煙葉最終的產(chǎn)量和質(zhì)量與葉綠體的發(fā)育情況密不可分。本研究通過觀察不同施氮量下煙葉的葉綠體發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，LF處理煙葉的葉綠體結(jié)構(gòu)降解嚴重，淀粉粒和嗜鋨顆粒積累不足，含糖量較少；MF處理煙葉的葉綠體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)降解，淀粉粒與嗜鋨顆粒體積大，煙葉內(nèi)含物質(zhì)豐富；HF處理下煙葉葉綠體結(jié)構(gòu)完整，淀粉粒與嗜鋨顆粒體積最大，但嗜鋨顆粒數(shù)量較少。葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生降解是煙葉成熟的特征[17]，說明隨著施氮量的增加，煙葉成熟度逐漸降低，這與智磊等[18]的研究結(jié)果一致。

3.3 施氮量對云煙121 上部葉代謝的影響

3.3.1 施氮量對亞油酸代謝的影響 亞油酸代謝途徑中的差異代謝物主要為高級脂肪酸，可賦予煙葉特殊的香氣，對煙葉品質(zhì)和風味有重要影響，并且在煙草對各類逆境脅迫的適應過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1920]。在該通路下，高級脂肪酸含量多在MF處理下達到最高，在HF處理下含量最低，因此MF處理的煙葉具有更好的香氣質(zhì)量，且煙葉內(nèi)較高的高級脂肪酸含量也是其發(fā)病率較低的原因之一。

3.3.2 施氮量對苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成的影響 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑中的差異代謝物主要為有機酸、醛類和氨基酸。L-酪氨酸在煙葉內(nèi)能參與棕色化反應，對煙葉香氣量有著重要影響[21]；3-脫氫莽草酸、苯基丙酮酸、莽草酸、3-羥基苯甲酸作為有機酸在抽吸過程中能中和煙氣堿性，調(diào)節(jié)pH，使吸味醇和，間接影響煙葉香氣；L-天冬氨酸-乙醛具有羰基，是重要的致香物質(zhì)。這些差異代謝物均在LF和MF處理下含量較高，而在HF處理下含量明顯降低，即LF和MF處理煙葉的香氣物質(zhì)含量豐富。由此表明，適量氮肥有利于提高煙葉的抽吸品質(zhì)。

3.3.3 施氮量對酪氨酸代謝的影響 在酪氨酸代謝途徑中，琥珀酸、均龍膽酸、3，4-二羥基苯乙酸、4-羥基苯乙醛、香草乙二醇和酪醇等有機酸和醇醛類物質(zhì)的含量均在LF和MF處理下較高，且顯著高于HF處理。這些物質(zhì)具有一定的香氣，在煙草中能提高煙草的香氣量。酪胺在HF處理下含量最高，其對煙草品質(zhì)的影響與氨類似，抽吸時揮發(fā)進入煙氣，提高煙氣堿性，產(chǎn)生刺激性和辛辣味，且具有臭味，綜上表明，LF和MF處理煙葉的刺激性物質(zhì)含量低，致香物質(zhì)含量高，香韻豐滿；施氮量過高會導致煙葉品質(zhì)下降。

3.3.4 施氮量對煙草代謝網(wǎng)絡的影響 莽草酸途徑與苯丙烷代謝途徑都是煙草的主要次生代謝途徑，在影響煙草主要香氣物質(zhì)合成的同時又為其他次生代謝途徑提供底物[2223]。其中苯丙氨酸作為次生代謝途徑中的重要物質(zhì)，不僅是香氣成分、木質(zhì)素、植保素等物質(zhì)的前體物，還能參與棕色化反應，對煙草品質(zhì)有著重要影響[2425]。在HF處理下，莽草酸、預苯酸等前體物質(zhì)以及與苯丙氨酸密切相關的苯基丙酮酸、L-酪氨酸、苯乙胺等物質(zhì)含量均下調(diào)，這可能導致苯丙氨酸合成量降低。當苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸后，又向酪胺轉(zhuǎn)化過多，使煙葉內(nèi)刺激性物質(zhì)含量較高，從而影響煙葉品質(zhì)。在LF和MF處理下，苯丙氨酸上下游物質(zhì)含量較高，推測苯丙氨酸合成量較多。L-酪氨酸向酪胺轉(zhuǎn)化少，可能轉(zhuǎn)化為4-羥基苯乙醛與4-羥基苯乙酸或向4-香豆酸轉(zhuǎn)化。4-香豆酸和5-羥基阿魏酸分別是木質(zhì)素單體香豆醇和芥子醇的前體物[26]，較高的前體物含量有利于木質(zhì)素的合成，從而增強煙草抗逆性。同時4-香豆酸在合成香豆醇前經(jīng)肉桂酸4-羥化酶和4-香豆酰輔酶A連接酶作用生成4香豆酰輔酶A[27]，該物質(zhì)除進入木質(zhì)素途徑外還可進入類黃酮途徑，生成香氣物質(zhì)和植保素[28]，從而提高煙草品質(zhì)與抗病性。

3.4 施氮量對云煙121 烤后煙質(zhì)量的影響

優(yōu)質(zhì)煙葉的外觀特征通常表現(xiàn)為成熟度好、組織疏松、厚薄適中、無雜色、色度強、油分足[29]。色度與油分影響煙葉質(zhì)量，色度足、油分多的煙葉韌性強、彈性好，手摸柔潤、滑膩，抽吸時香氣量足、香氣質(zhì)好、雜氣少、刺激性小、勁頭適中。葉片結(jié)構(gòu)疏松則代表細胞發(fā)育好，間隙大，填充性、彈性、燃燒性均好[30]。在LF處理下，烤后煙葉的油分和色度較MF處理略有不足；在HF處理下，烤后煙葉的組織結(jié)構(gòu)較MF處理更緊密，且色度略差。因此，LF和HF處理烤后煙葉的上等煙比例降低，表現(xiàn)出較差的經(jīng)濟性狀以及較低感官質(zhì)量得分。

煙葉中的化學成分含量反映了煙葉的質(zhì)量，是決定評吸和煙氣特性等質(zhì)量特性的內(nèi)在因素[31]。研究認為，烤煙含總糖24%～33%，還原糖18%～24%，煙堿2.5%左右，鉀≥1.5%，氯lt;0.8%，糖堿比8～10，鉀氯比4～10，兩糖比0.9時相對適宜[3233]。與優(yōu)質(zhì)煙葉相比，LF處理煙葉的還原糖含量和鉀氯比過高，還原糖含量過高使得煙氣酸性增強，引起壓香現(xiàn)象，而過高的鉀氯比則會降低香氣物質(zhì)含量，從而導致香氣量與香氣質(zhì)得分降低；HF處理煙葉的煙堿含量過高，糖堿比過低，且香氣代謝物含量較低，導致烤后煙葉的香氣特性與口感特性得分較低；MF處理煙葉的各化學成分較為協(xié)調(diào)，代謝物含量豐富，感官質(zhì)量最佳。

因此，在曲靖煙區(qū)云煙121的適宜施氮水平為施用純氮105.0 kg·hm-2，在此施氮水平下烤煙上部葉的品質(zhì)與可用性最優(yōu)。