大狼毒次生代謝物分析及主要物質(zhì)化感效應(yīng)研究

摘要：為探究有毒植物大狼毒（Euphorbia jolkinii） 含有的主要化感活性物質(zhì)及化感效應(yīng)，本試驗(yàn)運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS） 對(duì)大狼毒次生代謝物進(jìn)行分析，并采用生物測試法，開展3種代表性次生代謝物對(duì)多年生黑麥草（Lolium perenne） 和紅三葉（Trifolium pratense） 種子萌發(fā)及幼苗生長的影響研究。結(jié)果表明：大狼毒根、莖葉分別含有898種和1025種次生代謝物，分屬酚酸類、氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)、黃酮和生物堿等。4-硝基苯酚、奎寧酸和2-苯乙胺等代謝物在根、莖葉中均有檢測到且相對(duì)豐度較高，對(duì)多年生黑麥草和紅三葉種子萌發(fā)及生長均起到顯著的抑制作用（Plt;0.05），抑制效果存在代謝物差異和“濃度效應(yīng)”，以4-硝基苯酚抑制最強(qiáng)，2-苯乙胺次之，奎寧酸最弱。綜上，大狼毒植株體內(nèi)次生代謝物種類多，其中4-硝基苯酚和2-苯乙胺等代謝物化感效應(yīng)較明顯，為大狼毒潛在化感活性物質(zhì)資源化開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大狼毒；次生代謝物；種子萌發(fā)；幼苗生長；化感效應(yīng)

中圖分類號(hào)：S481""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）08-2599-08

Analysis and Study of Secondary Metabolites and Allelopathic Effects of

Main Substances of Euphorbia jolkinii

DUAN Rui1#， LUO Qin1#， XIAO Xue1， NIU Qiong-mei1， LIU Yang2，

GUI Bao-lin3， ZHONG Li-qiong4， CHU Xiao-hui1*， SHAN Gui-lian1*

（1. Department of Grassland Science， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan Province 650201， China;

2. Forestry and Grassland Bureau of Yunnan Province， Kunming， Yunnan Province 650224， China; 3. Soil and Fertilizer

Workstation， Xundian County Agriculture and Rural Bureau，Xundian， Yunnan Province 655200， China; 4. Agricultural

Comprehensive Service Center of Yangjie Town in Xundian County， Xundian， Yunnan Province 655209， China）

Abstract：In order to investigate the main allelopathic active substances and allelopathic effects of toxic plant Euphorbia jolkinii，we used UPLC-MS/MS to analyse the secondary metabolites of E. jolkinii and bioassay to carry out a study on the effects of three representative secondary metabolites on seed germination and seedling growth of Lolium perenne and Trifolium pratense. The results showed that the roots，stems and leaves of E. jolkinii respectively contained 898 and 1 025 secondary metabolites，which belonged to phenolic acids，amino acids and their derivatives，lipids，flavonoids，alkaloids，organic acids，etc. 4-nitrophenol，quinic acid and 2-phenylethylamine were all detected in roots，stems and leaves with relatively high abundance，and had significant inhibitory effects on seed germination and growth of Lolium perenne and Trifolium pratense （Plt;0.05）. The inhibitory effects existed in the differences of metabolites and the \"concentration effect\"，with 4-nitrophenol inhibiting the strongest，following by 2-phenylethylamine and quinic acid. In conclusion，there were many types of secondary metabolites in E. jolkinii plants，among which 4-nitrophenol and 2-phenylethylamine had obvious allelopathic effects，which provided reference for resource utilization of potential allelopathic active substances in E. jolkinii.

Key words：Euphorbia jolkinii;Secondary metabolite;Seed germination;Seedling growth;Allelopathic effect

大狼毒（Euphorbia jolkinii） 為大戟科大戟屬多年生草本植物，廣泛分布于滇西北亞高山草甸、山坡、灌叢等地［1-3］。該物種根系發(fā)達(dá)，全株具有毒性，抗寒抗旱性強(qiáng)，其在退化草地上的滋生蔓延會(huì)導(dǎo)致伴生植物密度下降，生物量降低［4-5］，進(jìn)而引起草地群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)夭莸匦竽翗I(yè)發(fā)展和生物多樣性保護(hù)。

化感作用（Allelopathy） 是植物或微生物的代謝分泌物（化感物質(zhì)）對(duì)周圍環(huán)境中其他植物或微生物有利或有害的作用。化感物質(zhì)大致可歸為水溶性有機(jī)酸、脂類、長鏈脂肪酸和多炔、醌類、氨基酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素、黃酮、單寧、萜烯和甾族化合物、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷和嘌呤和核酸等14類［6］，其作為植物化感作用的媒介，通過揮發(fā)、雨霧淋溶、殘?bào)w或凋落物分解和根系分泌等自然途徑釋放并進(jìn)入環(huán)境，被受體植物吸收而起作用［7］。

化感作用是毒害草占據(jù)入侵地群落優(yōu)勢地位的有效工具［8-10］。就滇西北亞高山草甸“霸主”植物大狼毒而言，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大狼毒根、莖葉浸提液含有的化感物質(zhì)會(huì)打破受體植物的生理平衡［11］，抑制其幼苗激素合成［3］，影響受體植物的種子萌發(fā)和幼苗生長。除化感作用外，課題組前期通過測定大狼毒入侵及非入侵地土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大狼毒會(huì)通過向土壤環(huán)境釋放化感物質(zhì)的方式改變?nèi)肭值赝寥牢⑸飪?yōu)勢菌組成、占比及群落結(jié)構(gòu)［12］。前期的這些研究結(jié)果充分說明化感作用是造成大狼毒入侵?jǐn)U散區(qū)草地植物多樣性下降的原因之一。然而，大狼毒植株體內(nèi)究竟含有哪些主要化感活性物質(zhì)？這些次生代謝物化感強(qiáng)度如何？據(jù)此，本研究采集旺盛生長期大狼毒植株，運(yùn)用UPLC-MS/MS對(duì)其體內(nèi)含有的次生代謝物進(jìn)行測定。根據(jù)測定結(jié)果，選取4-硝基苯酚、2-苯乙胺和奎寧酸3種代表性次生代謝物，采用生物測試法開展其對(duì)多年生黑麥草（Lolium perenne） 和紅三葉（Trifolium pratense） 的化感強(qiáng)度。通過研究探討大狼毒主要化感活性物質(zhì)及其化感強(qiáng)度，為大狼毒潛在化感活性物質(zhì)資源化開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 大狼毒植株的獲取 2022年8月中上旬大狼毒生長旺盛期，于云南省迪慶州香格里拉市托木南國家級(jí)草原固定監(jiān)測樣點(diǎn)（27°29′00″N，99°52′16″E） 挖取3年生以上大狼毒完整植株，將根和莖葉分開，洗凈，置于干冰中封存送至北京百邁克生物科技有限公司，運(yùn)用UPLC-MS/MS對(duì)其次生代謝物進(jìn)行鑒定。

1.1.2 受體材料來源及特性 受體材料為‘麥迪’多年生黑麥草（L. perenne ‘Mathilde’，千粒重約3.17 g，純凈度98%） 和‘炫麗’紅三葉（T. pratense ‘Brilliant’，千粒重約1.68 g，純凈度98%），由北京正道種業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)運(yùn)用UPLC-MS/MS對(duì)大狼毒根、莖葉中的次生代謝物進(jìn)行檢測，根據(jù)測定結(jié)果，明確大狼毒次生代謝物。依據(jù)相對(duì)定量值及其物質(zhì)類別，從相對(duì)豐度排名前30的物質(zhì)中篩選出根、莖葉均有檢測到的具有化感活性的3大類物質(zhì)，分別為：酚酸類（4-硝基苯酚）、生物堿（2-苯乙胺）和有機(jī)酸（奎寧酸），以分析純化學(xué)試劑代替其進(jìn)行化感強(qiáng)度的生物測試［13］。

開展3種主要次生代謝物化感強(qiáng)度的生物測試時(shí)，依據(jù)預(yù)試驗(yàn)及各次生代謝物的豐度，將4-硝基苯酚的濃度設(shè)定為0（設(shè)為對(duì)照），10，30，50，70 mg·L-1，2-苯乙胺的濃度設(shè)定為0（設(shè)為對(duì)照），100，400，800，1200 μL·L-1，奎寧酸的濃度設(shè)定為0（設(shè)為對(duì)照），100，400，800，1200 mg·L-1，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 大狼毒次生代謝物測定 將大狼毒根、莖葉樣品置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥，然后用研磨機(jī)研磨成粉末。稱取100 mg粉末，溶于1.2 mL70%甲醇提取液中，每30 min渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共6次。將樣品置于4℃冰箱中過夜，離心，吸取上清液并用微孔濾膜過濾，儲(chǔ)存在注射瓶中按照儀器工作條件測定。

液相條件主要包括：色譜柱：Agilent SB-C18 （2.1 mm∶100.0 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00—11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量4 μL。

質(zhì)譜條件主要包括：LIT和三重四極桿（QQQ） 掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP），AB6500 Q TRAP UPLC/ MS/ MS系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件（AB Sciex） 控制運(yùn)行正負(fù)兩種離子模式。

基于百邁客平臺(tái)代謝數(shù)據(jù)庫，對(duì)樣本的代謝物進(jìn)行了質(zhì)譜定性定量分析。通過三重四級(jí)桿篩選出每個(gè)物質(zhì)的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號(hào)強(qiáng)度（CPS），用MultiaQuant軟件打開樣本下機(jī)質(zhì)譜文件，進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作。

1.3.2 主要次生代謝物化感強(qiáng)度測定 采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。分別挑選100粒飽滿種子，用2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，浸泡20 min，用自來水沖洗3次，蒸餾水沖洗2次，放入培養(yǎng)皿中，以雙層濾紙作為培養(yǎng)基，用相應(yīng)濃度的次生代謝物溶液濕潤濾紙，在溫度（25±1）℃，14 h光照/10 h黑暗，光強(qiáng)6000 lx的人工智能光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每處理設(shè)置3次重復(fù)。發(fā)芽試驗(yàn)開始時(shí)添加3 mL相應(yīng)濃度的次生代謝物溶液（對(duì)照組添加等量蒸餾水），逐日觀察記錄發(fā)芽種子并補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，使各處理液濃度維持不變，計(jì)數(shù)持續(xù)進(jìn)行到經(jīng)過3 d再無種子發(fā)芽為止。發(fā)芽結(jié)束后參照李春英等［14］的方法計(jì)算發(fā)芽率。參照單貴蓮等［3］的方法取樣測定單株鮮重、株高和根長。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA方差分析及Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大狼毒次生代謝物分析

如表1所示，通過對(duì)大狼毒生長旺盛期的根、莖葉進(jìn)行分析，檢測出大狼毒根部含有898種次生代謝物，莖葉含有1025種次生代謝物，它們分屬于酚酸類、氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)、黃酮、生物堿、有機(jī)酸、核苷酸及其衍生物、木脂素和香豆素、鞣質(zhì)、萜類、醌類和其他類12大類。其中，以酚酸類數(shù)量最多，其在根、莖葉中的種數(shù)分別有190種和220種，分別占總量的21.158%和21.463%；其次是氨基酸及其衍生物和脂質(zhì)，分別有129種和174種，分別占總量的14.365%和16.976%；脂類和黃酮類物質(zhì)種類也較多，相對(duì)占比在12%以上。

表2是依據(jù)總離子流程圖各色譜峰篩選獲得的大狼毒根、莖葉中豐度前30的次生代謝物。由表2可知，在大狼毒根和莖葉兩個(gè)組織中次生代謝物有所不同，具體如下：大狼毒根部豐度前30的次生代謝物包含酚酸類（10種），有機(jī)酸（4種），鞣質(zhì)（4種），脂質(zhì)（3種），氨基酸及其衍生物（3種），生物堿（2種），核苷酸及其衍生物（1種），以及其他類（3種）。大狼毒莖葉中豐度前30的次生代謝物包含酚酸類（9種），氨基酸及其衍生物（7種），黃酮（5種），生物堿（4種），脂質(zhì)（2種），有機(jī)酸（1種），木脂素和香豆素（1種），以及核苷酸及其衍生物（1種）。可以看出酚酸類、氨基酸及其衍生物、生物堿、有機(jī)酸、脂質(zhì)五大類物質(zhì)是大狼毒根、莖葉均有檢測到且含量最高的次生代謝物，其中4-硝基苯酚、L-正亮氨酸*、2-苯乙胺、棕櫚醛、奎寧酸是共有且豐度最高的酚酸類、氨基酸及其衍生物、生物堿、脂質(zhì)、有機(jī)酸代表物質(zhì)。

2.2 大狼毒主要次生代謝物化感效應(yīng)研究

2.2.1 酚酸類代表物質(zhì)化感效應(yīng)研究 由圖1可知，與對(duì)照相比，添加質(zhì)量濃度為10，30，50，70 mg·L-1的酚酸類代表物質(zhì)4-硝基苯酚顯著降低了多年生黑麥草和紅三葉種子的發(fā)芽率（添加10 mg·L-1對(duì)多年生黑麥草發(fā)芽率的影響除外），降低幅度隨溶液濃度升高而增加（Plt;0.05）。

由表3可知，與CK相比，低于50 mg·L-1的4-硝基苯酚溶液的添加對(duì)多年生黑麥草地上部的生長有一定的促進(jìn)作用，濃度增加至70 mg·L-1時(shí)，多年生黑麥草幼苗受到顯著抑制。具體為：10 mg·L-1的濃度顯著增加了多年生黑麥草的單株鮮重（Plt;0.05），30，50 mg·L-1的濃度顯著促進(jìn)了多年生黑麥草的株高（Plt;0.05），70 mg·L-1的濃度顯著降低了多年生黑麥草的單株鮮重、株高和根長（Plt;0.05）。與CK相比，10，30 mg·L-1的4-硝基苯酚溶液的添加顯著降低了紅三葉單株鮮重、株高和根長（Plt;0.05），降低幅度隨溶液濃度的增加而增加，濃度增加至50 mg·L-1時(shí)，紅三葉幼苗無法存活。

2.2.2 生物堿類代表物質(zhì)化感效應(yīng)研究 由圖2可知，與對(duì)照相比，添加質(zhì)量濃度為100，400，800，1200 μL·L-1的生物堿類代表物質(zhì)2-苯乙胺顯著降低了2種牧草種子的發(fā)芽率（添加100 μL·L-1對(duì)紅三葉發(fā)芽率的影響除外），降低幅度隨溶液濃度的升高而增加（Plt;0.05）。

由表4可知，與CK相比，低于800 μL·L-1的2-苯乙胺溶液的添加對(duì)多年生黑麥草地上部的生長有一定的促進(jìn)作用，濃度添加至1200 μL·L-1時(shí)，多年生黑麥草幼苗生長受到顯著抑制。400 μL·L-1的濃度顯著促進(jìn)了多年生黑麥草的株高（Plt;0.05），1200 μL·L-1的濃度顯著降低了多年生黑麥草的單株鮮重和根長（Plt;0.05）。與CK相比，100，400 μL·L-1的2-苯乙胺溶液的添加顯著降低了紅三葉單株鮮重、株高和根長（Plt;0.05），降低幅度隨溶液濃度的增加而增加，濃度增加至1200 μL·L-1時(shí)，紅三葉幼苗無法存活。

2.2.3 有機(jī)酸類代表物質(zhì)化感效應(yīng)研究 由圖3可知，與對(duì)照相比，添加質(zhì)量濃度為100，400，800，1200 mg·L-1的有機(jī)酸類代表物質(zhì)奎寧酸顯著降低了多年生黑麥草種子的發(fā)芽率，降低幅度隨濃度升高而增加（Plt;0.05）。就紅三葉種子萌發(fā)結(jié)果來看，與CK相比，低于800 mg·L-1的奎寧酸溶液的添加顯著提高了紅三葉種子發(fā)芽率，當(dāng)濃度增加至1200 mg·L-1時(shí)，紅三葉種子發(fā)芽率顯著降低（Plt;0.05）。

由表5可知，與CK相比，低于800 mg·L-1的奎寧酸溶液的添加對(duì)多年生黑麥草地上部的生長有一定的促進(jìn)作用，濃度增加至1200 mg·L-1時(shí)，多年生黑麥草幼苗生長受到顯著抑制。具體為：100 mg·L-1的濃度顯著促進(jìn)了多年生黑麥草的株高（Plt;0.05），1200 mg·L-1的濃度顯著降低了多年生黑麥草的單株鮮重和根長（Plt;0.05）。與CK相比，當(dāng)濃度增加至1200 mg·L-1時(shí)，奎寧酸溶液的添加顯著降低了紅三葉的單株鮮重和根長（Plt;0.05），但不同濃度奎寧酸溶液的添加對(duì)紅三葉株高無顯著影響。

3 討論

化感物質(zhì)是植物在生長發(fā)育中產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)［15］。植物次生代謝物在其生長發(fā)育時(shí)并不是必需的但卻是其與環(huán)境相互作用不可缺少的［16-17］，它通過影響受體植物的生理生化活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)其化感作用［18］。因此，探究化感作用機(jī)制的關(guān)鍵就是分析其化感活性物質(zhì)。本研究檢測出大狼毒植株體內(nèi)含有1000余種次生代謝物，它們分屬12大類，以酚酸類數(shù)量最多，種類占比21%以上，酚酸類次生代謝物中又以4-硝基苯酚豐度最高。酚酸類物質(zhì)是植物中最常見的化感物質(zhì)，對(duì)植物生長和土壤活性具有破壞性的影響［19］。酚酸類次生代謝物能顯著抑制植物種子萌發(fā)及幼苗生長，并引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［20-23］?；行?yīng)的強(qiáng)度與來源部位也有關(guān)。大狼毒根浸提液對(duì)受體植物萌發(fā)生長抑制強(qiáng)度大于莖葉浸提液［11，24］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在豐度前30的次生代謝物中大狼毒根系的酚酸類物質(zhì)高于莖葉，這可能是次生代謝物在植物組織中分布不均衡，合成和釋放存在不同，導(dǎo)致根部和莖葉組織中的化感物質(zhì)有所差異進(jìn)而影響其化感強(qiáng)度。

種子萌發(fā)及幼苗生長抑制試驗(yàn)是鑒定化感作用存在的最常用方法［25］?；形镔|(zhì)通過影響受體生物膜系統(tǒng)，改變酶及其他蛋白質(zhì)的活性，調(diào)控激素的合成，影響種子的吸脹作用，進(jìn)而造成細(xì)胞傷害，植物體內(nèi)活性氧自由基代謝失衡，導(dǎo)致膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能受損，最終表現(xiàn)為種子萌發(fā)及幼苗生長均受影響［24，26-28］?；凶饔眠€具有一定的濃度效應(yīng)，低濃度的化感物質(zhì)可能會(huì)促進(jìn)植物生長，但當(dāng)其累積量高于某一濃度閾值時(shí)就會(huì)產(chǎn)生抑制作用，同一種次生代謝物下，不同濃度和受體材料其化感敏感性也存在差異［29-30］。本研究表明，酚酸類代表物質(zhì)4-硝基苯酚對(duì)受體植物的萌發(fā)生長均具有顯著抑制作用，高濃度下抑制強(qiáng)度增強(qiáng)，且多年生黑麥草較紅三葉更耐化感。此研究結(jié)果與宋亮等［22］、陶茸等［23］研究得出酚酸類次生代謝物對(duì)受體植物萌發(fā)生長均具有化感自毒作用，抑制效應(yīng)與濃度顯著相關(guān)的結(jié)果基本一致。2-苯乙胺和奎寧酸的添加對(duì)受體植物萌發(fā)及生長表現(xiàn)出明顯的低濃度下促進(jìn)、高濃度下抑制的雙重作用，此結(jié)果與馬銀山等［31］、牛瓊梅等［32］研究受試牧草的化感響應(yīng)中得出的結(jié)論相符，其原因可能是低濃度下的化感物質(zhì)有限，未能有效抑制受體植物萌發(fā)及生長。

本研究通過檢測得出大狼毒植株體內(nèi)次生代謝物種類多，組成較復(fù)雜，并對(duì)豐度較高的3種次生代謝物進(jìn)行了生物活性檢測，表明這些次生代謝物具有化感效應(yīng)。本研究僅開展了對(duì)2種受體試驗(yàn)植物化感敏感性的比較，材料相對(duì)偏少，后續(xù)建議進(jìn)一步開展有針對(duì)性的雜草受試材料對(duì)大狼毒化感耐受性的比較研究，以促進(jìn)大狼毒植株體內(nèi)潛在化感活性物質(zhì)加以開發(fā)利用，為研發(fā)植物源新型除草劑提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

大狼毒植株含有12類1000余種次生代謝物，莖葉所含次生代謝物種類（1025種）高于根（898種）。4-硝基苯酚、奎寧酸、2-苯乙胺等次生代謝物在根、莖葉中均有檢測到且相對(duì)豐度較高，對(duì)多年生黑麥草和紅三葉均具有不同程度的抑制作用，4-硝基苯酚抑制效果最強(qiáng)，2-苯乙胺次之，奎寧酸最弱。推斷4-硝基苯酚和2-苯乙胺具有開發(fā)為植物源除草劑或成為除草劑中間體的潛力，今后需對(duì)相應(yīng)的雜草進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)其控草機(jī)制機(jī)理進(jìn)行深入研究。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）