鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體抗氧化性能的影響

摘要：為探討鹽脅迫對白羊草（Bothriochloa ischaemum）幼苗線粒體抗氧化性能的影響，以期為培育耐鹽白羊草新品種提供理論依據(jù)。試驗以白羊草種子為材料，在Na+濃度為0（CK），10，30，90 mmol·L-1的鹽脅迫下進行萌發(fā)試驗，分析其幼苗線粒體抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化含量的變化規(guī)律。結(jié)果表明：隨著Na+濃度的增加，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（Catalase，CAT），谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）活性均高于CK，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶，谷胱甘肽還原酶活性逐漸降低，胚根線粒體抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）活性顯著降低（Plt;0.05），而胚芽線粒體APX活性先升高后降低，H2O2和丙二醛含量逐漸升高。鹽脅迫對白羊草幼苗不同部位線粒體抗氧化性能的影響存在差異，胚根線粒體比胚芽更敏感，SOD，CAT，GPX是維持鹽脅迫下白羊草幼苗線粒體ROS動態(tài)平衡的關(guān)鍵酶。

關(guān)鍵詞：白羊草；鹽脅迫；幼苗；線粒體；抗氧化性能

中圖分類號：S603.4""" 文獻標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2498-07

Effects of Salt Stress on Mitochondrial Antioxidant Resistance of

Bothriochloa ischaemum Seedlings

LI Yin-lin#， CHEN Yi-lin#， XIA Fang-shan*， ZHONG Hua， CEN Hui-fang

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：In order to explore the effects of salt stress on mitochondrial antioxidant resistance of Bothriochloa ischaemum seedlings and provide a theoretical basis for breeding new salt-tolerant varieties of Bothriochloa ischaemum，the seeds of Bothriochloa ischaemum were used as materials to conduct germination experiment under different concentration of Na+ （0（CK），10，30，90 mmol·L-1）. The changes of mitochondrial antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation contents in seedlings were analyzed. The results showed that the activities of superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GPX） in mitochondria of radicle and plumule were higher under the Na+ treatments than CK，but as the concentration of Na+ increased，the the activities of glutathione S-transferase and glutathione reductase gradually decreased，the ascorbate peroxidase （APX） activity of mitochondria in radicle decreased significantly （Plt;0.05），the APX activity of mitochondria in plumule increased firstly and then decreased，and their contents of H2O2 and malondialdehyde increased gradually. Salt stress had different effects on the antioxidant resistance of mitochondria in different parts of Bothriochloa ischaemum seedlings，and the mitochondria in radicle was more sensitive than that in plumule. SOD，CAT and GPX were the key enzymes to maintain the ROS homeostasis of mitochondria in Bothriochloa ischaemum seedlings under salt stress.

Key words：Bothriochloa ischaemum;Salt stress;Seedling;Mitochondria;Antioxidant resistance

土地鹽堿化是當(dāng)下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的一個世界性難題，嚴重制約著全球生態(tài)建設(shè)和社會經(jīng)濟的高質(zhì)量發(fā)展，進而影響到人類生活質(zhì)量的提升［1］。中國的鹽堿地分布廣泛［2］，并以西北、華北、東北及沿海灘涂地區(qū)最為嚴重［3］。鹽堿地中往往伴隨發(fā)生著鹽脅迫和堿脅迫，但鹽脅迫主要由NaCl和Na2SO4引起，而堿脅迫主要由Na2CO3和NaHCO3引起［4-5］。種子萌發(fā)及幼苗建成是植物生命周期中對逆境脅迫響應(yīng)最關(guān)鍵的階段［6］。輕度鹽堿脅迫下，植物的種子萌發(fā)、植株生長發(fā)育及產(chǎn)量等都會受到影響，而嚴重鹽堿脅迫時，植物出現(xiàn)早衰甚至死亡［7］。鹽堿脅迫會造成植物體內(nèi)營養(yǎng)缺失、水分缺乏及離子失衡等，并引起氧化脅迫而產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），致使植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與ROS積累的失衡［8］，從而導(dǎo)致細胞蛋白質(zhì)、脂類、核酸和質(zhì)膜的氧化損傷，甚至細胞凋亡［9-11］。近年來，關(guān)于鹽堿脅迫下抗氧化能力的變化在辣椒（Capsicum annuum）［12］、番茄（Lycopersicon pennellii）［13］、堿蓬（Suaeda salsa）［14］等植物中均有研究。目前，培育耐鹽堿植物新品種成為科學(xué)工作者的研究熱點和重點，這對鹽堿地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益［15］。

線粒體是植物體內(nèi)最主要的細胞器之一，是細胞物質(zhì)代謝和能量代謝的主要場所，也是產(chǎn)生ROS的最主要位點［16-17］。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）及抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循環(huán)是線粒體中清除ROS的重要途徑［17］。SOD主要是催化超氧陰離子生成H2O2和O2；CAT可直接催化H2O2生成H2O和O2，AsA-GSH循環(huán)中抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）以AsA為電子供體催化H2O2還原成H2O，而GSH被脫氫抗壞血酸還原酶還原成氧化型谷胱甘肽（Glutathione oxidized，GSSG），而GSSG可以通過谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）還原成GSH來維持GSH庫的持續(xù)還原能力；谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）則通過GSH來清除H2O［17-19］2。近年來，關(guān)于逆境對植物線粒體抗氧化性能影響的研究主要涉及低溫脅迫［20］、低氧脅迫［21］、硝酸鈣脅迫［22］等方面，而關(guān)于鹽堿脅迫方面的影響則鮮有報道。因此，研究鹽脅迫下植物線粒體抗氧化性能的變化規(guī)律，對于揭示植物響應(yīng)鹽堿脅迫的抗氧化機制具有重要意義。

白羊草（Bothriochloa ischaemum）為禾本科孔穎草屬暖季型多年生草本植物，是干旱半干旱地區(qū)草地建植的主要禾草種質(zhì)資源，也是退化草地恢復(fù)和碳儲存的重要物種［23-24］。白羊草喜沙壤土環(huán)境，具有須根發(fā)達、分蘗力強、耐旱、耐踐踏、固土保水力強等特性，是黃土高原丘陵區(qū)植被恢復(fù)過程中重要的鄉(xiāng)土草種之一［25-26］。重視白羊草的開發(fā)和利用，對其種質(zhì)資源的保護及山西乃至全國的畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)建設(shè)提供有力保障。山西省共有鹽堿地2.62×105 hm2，占平川土地總面積的9.9%［27］。因此，探究白羊草種質(zhì)資源耐鹽堿利用機理，對山西省及其周邊區(qū)域的生態(tài)草牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有至關(guān)重要的作用。目前關(guān)于耐鹽堿白羊草的研究主要體現(xiàn)在種子活力［28］、地上部葉片生理特性方面［29］，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于其幼苗線粒體抗氧化性能方面的研究。試驗分析兩種鹽及不同Na+濃度對白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體抗氧化性能的影響，探究鹽脅迫下白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生與清除平衡的內(nèi)在原因，以期為進一步開展耐鹽白羊草新品種培育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為‘太行’白羊草種子，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草類植物育種與種子科學(xué)實驗室收集于2019年10月，于-20℃條件下密封保存至2021年8月試驗進行。

1.2 試驗處理

1.2.1 發(fā)芽試驗及幼苗獲取處理 挑選去除內(nèi)外稃后均勻飽滿的白羊草種子，每100粒放入一個置有雙層濾紙的消毒培養(yǎng)皿中，分別加入4 mL Na+濃度為0（CK），10，30，90 mmol·L-1的NaCl和Na2SO4溶液后稱重，在25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗，每天添加蒸餾水以保持恒重，發(fā)芽12 d后獲得幼苗樣品［30］，在-80℃條件下密封保存以備試驗。每個處理重復(fù)4次。

1.2.2 線粒體提取 分離幼苗胚根和胚芽，并分別稱取0.1 g樣品。參照Yin等［31］的方法，進行線粒體的提取。線粒體提取液在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測定

SOD活性的測定參照Beyer等［32］的方法，CAT活性的測定參照Aebi［33］的方法，APX活性的測定參照Nakano等［34］的方法，GPX活性的測定參照Flohé等［35］的方法，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）活性的測定參照Nagalakshmi等［36］的方法，GR活性的測定參照Madamanchi等［37］的方法，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的測定參照Bailly等［38］的方法，可溶性蛋白及H2O2含量的測定使用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，多重比較用Duncans法（Plt;0.05），采用Origin 2018軟件進行作圖。以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示最后結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體SOD活性的影響

由表1可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體SOD活性隨著Na+濃度的增加均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（Plt;0.05）。Na+濃度為0 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫的白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體SOD活性差異不顯著；Na+濃度為10和30 mmol·L-1時，NaCl脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體SOD活性顯著高于胚根線粒體SOD活性（Plt;0.05），Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚根線粒體SOD活性顯著高于胚芽線粒體SOD活性（Plt;0.05）；Na+濃度為90 mmol·L-1時，NaCl脅迫下的白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體SOD活性之間差異不顯著，Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體SOD活性顯著高于胚根線粒體SOD活性（Plt;0.05）。

2.2 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體CAT活性的影響

由表2可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體CAT活性隨著Na+濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。Na+濃度為0和10 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚根線粒體CAT活性均顯著高于胚芽線粒體CAT活性（Plt;0.05）；Na+濃度為30 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫的白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體CAT活性之間差異不顯著；Na+濃度為90 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體CAT活性均顯著高于胚根線粒體CAT活性（Plt;0.05）。

2.3 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體APX活性的影響

由表3可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根線粒體APX活性隨著Na+濃度的增加呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（Plt;0.05），而白羊草幼苗胚芽線粒體APX活性隨著Na+濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且Na+濃度為10 mmol·L-1時的胚芽線粒體APX活性顯著高于其他濃度時（Plt;0.05）。Na+濃度為0 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚根線粒體APX活性均顯著高于胚芽線粒體APX活性（Plt;0.05）；Na+濃度為10 mmol·L-1時，NaCl脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體APX活性顯著高于胚根線粒體APX活性（Plt;0.05），Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體APX活性之間差異不顯著；Na+濃度為30和90 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體APX活性均顯著高于胚根線粒體APX活性（Plt;0.05）。

2.4 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體GPX活性的影響

由表4可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根線粒體GPX活性隨著Na+濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且Na+濃度為10 mmol·L-1時的胚根線粒體GPX活性顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），而白羊草幼苗胚芽線粒體GPX活性隨著Na+濃度的增加呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（Plt;0.05）。Na+濃度為0 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體GPX活性均顯著高于胚根線粒體GPX活性（Plt;0.05）；Na+濃度為10和30 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚根線粒體GPX活性均顯著高于胚芽線粒體GPX活性（Plt;0.05）；Na+濃度為90 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體GPX活性均顯著高于胚根線粒體GPX活性（Plt;0.05）。

2.5 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體GST活性的影響

由表5可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體GST活性隨著Na+濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。Na+濃度為0，10和30 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚根線粒體GST活性均顯著高于胚芽線粒體GST活性（Plt;0.05）；Na+濃度為90 mmol·L-1時，NaCl脅迫下的白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體GST活性之間差異不顯著，Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體GST活性顯著高于胚根線粒體GST活性（Plt;0.05）。

2.6 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體GR活性的影響

由表6可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體GR活性隨著Na+濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。Na+濃度為0，10，30和90 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚芽線粒體GR活性均顯著高于胚根線粒體GR活性（Plt;0.05）。

2.7 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體H2O2含量的影響

由表7可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體H2O2含量隨著Na+濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。Na+濃度為0，10，30和90 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫下的白羊草幼苗胚根線粒體H2O2活性均顯著高于胚芽線粒體H2O2含量（Plt;0.05）。

2.8 鹽脅迫對白羊草幼苗線粒體MDA含量的影響

由表8可知，NaCl和Na2SO4脅迫時，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體MDA含量隨著Na+濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。Na+濃度為0，10，30和90 mmol·L-1時，NaCl和Na2SO4脅迫的白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體MDA含量之間差異均不顯著。

3 討論

H2O2既是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一種小分子信號物質(zhì)，又是調(diào)節(jié)其體內(nèi)ROS平衡的動態(tài)核心，鹽脅迫下，H2O2大量積累，植物的滲透調(diào)節(jié)、抗氧化等能力均會被破壞，進而植物生長被抑制，因而維持H2O2的動態(tài)平衡是植物適應(yīng)逆境能力的一種重要表現(xiàn)［39］。本試驗中，隨著Na+濃度的增加，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體的H2O2含量逐漸增加，并導(dǎo)致其MDA含量也逐漸增加，這說明鹽脅迫造成了白羊草幼苗胚根和胚芽的脂質(zhì)過氧化損傷［40］，因而白羊草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均顯著下降（Plt;0.05）［26］。這與鹽脅迫小黑麥（Triticale）［41］、鹽爪爪（Kalidium foliatum）［42］結(jié)論相似。試驗中，隨著Na+濃度的增加，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體SOD，CAT，GPX活性均始終高于CK，這說明SOD，CAT和GPX在鹽脅迫下白羊草幼苗線粒體的抗氧化作用中發(fā)揮主要作用，原因可能是鹽脅迫引起了白羊草幼苗線粒體呼吸電子傳遞鏈紊亂，并產(chǎn)生了氧化脅迫，從而誘導(dǎo)了SOD活性的升高以催化不斷產(chǎn)生的超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，H2O2的增加進一步誘導(dǎo)了CAT，GPX活性的升高以清除過量積累的H2O2，以期維持其內(nèi)部H2O2的動態(tài)平衡［43-44］。然而，白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體GST，GR活性均隨著Na+濃度的增加而逐漸降低，這可能是鹽脅迫抑制了GR的還原能力，卻誘導(dǎo)了GPX活性的升高，在清除過量積累的H2O2過程中消耗了GSH，致使其GSH含量減少，因而造成GST反應(yīng)的底物不足［17］，從而導(dǎo)致了白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體GST活性也降低，這也表明鹽脅迫抑制了白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體GST，GR活性。這與夏方山等［45］的研究結(jié)果中GR活性變化相反，可能是因為試驗的材料不同，且模擬非生物脅迫也不同，細胞及線粒體內(nèi)清除ROS的主要作用酶有差異。

鹽脅迫對白羊草幼苗不同部位線粒體抗氧化作用的影響存在差異。試驗中，白羊草幼苗胚根線粒體APX活性隨著Na+濃度的增加而顯著降低（Plt;0.05），其胚芽線粒體APX活性卻出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，原因可能是因為白羊草種子萌發(fā)過程中胚根最先萌發(fā)生長，并直接與鹽溶液接觸，故其胚根最先表現(xiàn)出鹽脅迫的不良反應(yīng)［46］，因而其線粒體APX活性對鹽脅迫的響應(yīng)比胚芽更為敏感。同樣，白羊草幼苗胚根線粒體GPX活性隨Na+濃度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而其胚芽線粒體GPX活性則隨Na+濃度的增加呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢（Plt;0.05），這也說明胚根線粒體GPX活性對鹽脅迫的響應(yīng)比胚芽敏感。因此，鹽脅迫下，白羊草幼苗胚根對鹽脅迫響應(yīng)比胚芽要更敏感。

4 結(jié)論

鹽脅迫下，白羊草幼苗線粒體抗氧化作用的發(fā)揮主要依賴于超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，其白羊草幼苗胚根和胚芽線粒體谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽還原酶活性均被抑制，胚根線粒體過氧化物酶活性被抑制，但其不同部位線粒體抗氧化性能的響應(yīng)存在差異，胚根要比胚芽更敏感。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）