紫花苜蓿種子產(chǎn)量與大小相關(guān)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

摘要：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好的豆科牧草，在我國(guó)種植面積不斷擴(kuò)大，其優(yōu)質(zhì)種子的需求量也逐年增多。因此，提高單位面積的種子產(chǎn)量對(duì)我國(guó)紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。為挖掘調(diào)控種子產(chǎn)量與外形的相關(guān)基因，本研究中，利用從世界各地收集的220份紫花苜蓿種子材料，對(duì)其種子重量（Seed weight，SW）、種子面積（Seed area，SA）、種子周長(zhǎng)（Seed perimeter，SP）進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）。表型分析表明3個(gè)性狀存在不同程度的變異，變異系數(shù)分別為10.96%（SW），8.31%（SA），4.43%（SP）。通過(guò)GWAS，共在7條染色體上發(fā)現(xiàn)20個(gè)與3個(gè)性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)，單倍型分析證實(shí)了優(yōu)異等位基因的數(shù)量與SW，SA和SP之間存在正相關(guān)性。對(duì)這20個(gè)顯著SNP上下游各20 kb范圍內(nèi)的基因進(jìn)行搜索注釋，最終篩選到4個(gè)與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)的候選基因。本研究的結(jié)果可為優(yōu)化紫花苜蓿種子大小，提高種子產(chǎn)量的分子育種提供新的標(biāo)記與候選基因。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；全基因組關(guān)聯(lián)分析；種子大??；種子產(chǎn)量

中圖分類號(hào)：S963.22+3.3""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）08-2419-09

Genome-Wide Association Study （GWAS） of Seed Yield and Size-Related

Traits of Alfalfa （Medicago sativa L.）

XU Ming1，2， JIANG Xue-qian2， HE Fei2， ZHANG Fan2， YANG Tian-hui3，

LONG Rui-cai2， YANG Qing-chuan2*， CONG Li-li1*

（1.College of Grassland Science， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong Province 266109， China；

2.Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China；

3.Institute of Animal Science， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002， China）

Abstract：Alfalfa （Medicago sativa L.），as a leguminous forage with high nutritional value and good palatability，has been grown in more areas of China，and the demand of high-quality seeds is increasing year by year. Therefore，increasing the seed yield per unit area is of great significance to the development of alfalfa industry in China. In order to explore the genes related to the regulation of seed yield and shape，in this study，220 alfalfa seed materials collected from all over the world were used to evaluate their seed weight （SW），seed area （SA） and seed perimeter （SP） using Genome-wide association study （GWAS）. Phenotypic analysis showed that the three traits had different degrees of variation，and the coefficients of variation were 10.96% （SW），8.31% （SA），and 4.43% （SP），respectively. Through GWAS，a total of 20 single nucleotide polymorphism （SNP） sites associated with three traits were found on 7 chromosomes. Haplotype analysis confirmed that there was a positive correlation between the number of excellent alleles and SW，SA and SP. Genes near these 20 significant SNPs were searched and labeled in the upstream and downstream 20 kb range，and finally 4 candidate genes related to seed yield and size were selected. The results of this study could provide new markers and candidate genes for molecular breeding to optimize alfalfa seed size and increase seed yield.

Key words：Alfalfa；GWAS；Seed size；Seed yield

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種廣泛種植且適口性好的多年生豆科牧草，有著“牧草之王”的美譽(yù)［1］。近年來(lái)，由于飼草的“增產(chǎn)節(jié)糧”作用，需求量不斷攀升，而苜蓿作為優(yōu)質(zhì)飼草，更是供不應(yīng)求［2］。隨著紫花苜蓿種植面積的不斷擴(kuò)大，市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿種子的需求也在不斷增加［3］。2021年，我國(guó)紫花苜蓿種子產(chǎn)量為0.29萬(wàn)噸，進(jìn)口量為0.52萬(wàn)噸［4］，為滿足我國(guó)紫花苜蓿種植需求，仍需從其他國(guó)家大量進(jìn)口草種。另外，種子的質(zhì)量差，成本高也是中國(guó)紫花苜蓿種子生產(chǎn)面臨的主要問(wèn)題［5］。因此，提高苜蓿種子產(chǎn)量是解決中國(guó)苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑之一。

種子生產(chǎn)長(zhǎng)期以來(lái)一直都是草業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)領(lǐng)域，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的種子是草地建設(shè)以及畜牧業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)物質(zhì)保障［6］。近年來(lái)，我國(guó)在增加紫花苜蓿種子產(chǎn)量方面的研究逐漸增多。王琴等［7］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于寧夏干旱地區(qū)，紫花苜蓿種植株距15 cm，行距100 cm為提高紫花苜蓿種子產(chǎn)量的最佳配比。陳濤等［8］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于蘭州大學(xué)培育的抗寒苜蓿新品系，種子生產(chǎn)最適灌溉次數(shù)為3次，灌溉時(shí)施硼肥濃度最適為0.6%。對(duì)于種子發(fā)育的遺傳機(jī)理，有報(bào)道稱，植物激素在種子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，比如脫落酸與赤霉素［9-10］。Zhao等［11］為探究脫落酸和赤霉素在紫花苜蓿種子發(fā)育過(guò)程中作用機(jī)理，對(duì)紫花苜蓿種子的5個(gè)發(fā)育階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，最終找到14個(gè)與脫落酸相關(guān)，20個(gè)與赤霉素相關(guān)的差異表達(dá)基因，揭示了這些差異表達(dá)基因在種子發(fā)育過(guò)程中的重要作用。MPK（絲裂原活化蛋白激酶）蛋白家族多種轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)一系列磷酸化過(guò)程，也能正調(diào)控種子發(fā)育［12］。此外，如GRF4，KLU等轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控種子種皮細(xì)胞增殖和胚乳的生長(zhǎng)等過(guò)程也能來(lái)調(diào)控植物種子大?。?3-14］。相較于對(duì)特定地區(qū)或者特定品系的研究，探索控制種子產(chǎn)量構(gòu)成因素的遺傳機(jī)理及挖掘相關(guān)基因更是我國(guó)提高種子產(chǎn)量的迫切需求。

種子重量是種子產(chǎn)量重要的構(gòu)成因素，面積與大小是種子大小的重要性狀，均屬典型的數(shù)量性狀。數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait loci，QTL）定位和GWAS是研究數(shù)量性狀的主要方法［15］。QTL定位是利用雙親雜交群體進(jìn)行遺傳位點(diǎn)定位的方法，后期可以將關(guān)聯(lián)標(biāo)記用分子標(biāo)記輔助育種（Marker-assisted selection，MAS）或者結(jié)合GWAS進(jìn)行分析。GWAS是以群體為研究對(duì)象，定位性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，這個(gè)策略相比于QTL定位在群體構(gòu)建方面會(huì)節(jié)省時(shí)間，定位到的候選區(qū)間也更小，關(guān)聯(lián)標(biāo)記可以直接用于MAS［16］。Chen等［17］對(duì)茶樹(shù)（Camellia spp.）葉片相關(guān)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出6個(gè)與葉片大小等形態(tài)性狀相關(guān)的候選基因，并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了2個(gè)葉片大小相關(guān)候選基因的表達(dá)，證實(shí)了它們的功能作用。近年來(lái)，GWAS被廣泛應(yīng)用于闡明紫花苜蓿數(shù)量性狀的遺傳位點(diǎn)，比如品質(zhì)［18］、黃萎病抗性［19］、抗旱性［20］和耐鹽性［21］。同樣，GWAS在籽粒性狀方面也取得了一定成就。嚴(yán)勇亮等［22］對(duì)298份小麥（Triticum aestivum L.）材料進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，找到84個(gè)顯著SNP位點(diǎn)，并篩選得到6個(gè)可能與小麥籽粒性狀相關(guān)的候選基因。楊丹丹等［23］對(duì)124份水稻（Oryza sativa L.）材料進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，找到22個(gè)與水稻籽粒性狀相關(guān)的顯著SNP位點(diǎn)。

由于紫花苜蓿是同源四倍體作物以及高度雜合性［24］，目前對(duì)紫花苜蓿種子產(chǎn)量與大小相關(guān)遺傳機(jī)理的研究少之又少。為了鑒定與種子產(chǎn)量與大小相關(guān)的顯著SNP，本研究從世界各地收集了220份紫花苜蓿種子材料，并測(cè)量了其千粒重、面積、周長(zhǎng)。分析其大小、重量的自然變異，并基于875 023個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定了一些與紫花苜蓿種子大小和產(chǎn)量有關(guān)的顯著相關(guān)位點(diǎn)和候選基因。該結(jié)果將有助于更好地理解控制紫花苜蓿種子大小和產(chǎn)量的遺傳和分子過(guò)程，以及為標(biāo)記輔助育種提供新的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用了一個(gè)由220個(gè)苜蓿種質(zhì)組成的關(guān)聯(lián)群體來(lái)分析SNP標(biāo)記與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)性狀之間的關(guān)系。該群體的材料來(lái)自于50個(gè)國(guó)家，由220個(gè)基因型組成，其中包括16個(gè)野生材料，93個(gè)地方品種，86個(gè)栽培品種，以及25個(gè)改良狀況不明確的材料［25］。194個(gè)種子材料來(lái)源于美國(guó)國(guó)家植物種質(zhì)資源系統(tǒng)（https：//npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/search），26個(gè)種子材料來(lái)源于全國(guó)畜牧總站國(guó)家牧草種質(zhì)資源中期庫(kù)。

1.2 表型數(shù)據(jù)收集與分析

對(duì)于每份材料，測(cè)量了三個(gè)與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)的性狀：種子重量（Seed weight，SW），種子面積（Seed area，SA），種子周長(zhǎng)（Seed perimeter，SP）。對(duì)于SW，測(cè)量千粒重作為表型值，每份材料測(cè)量5次，取平均值作為表型值。對(duì)于SA和SP，將種子平鋪到紙上進(jìn)行拍照，采用ImageJ軟件對(duì)種子投影到紙上的面積與周長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，每份材料測(cè)100粒種子，最終取平均值進(jìn)行表型分析與全基因組關(guān)聯(lián)分析。使用EXCEL、SPSS19、R4.1.3進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，變異系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值。

1.3 群體建立

對(duì)表型數(shù)據(jù)收集完畢之后，進(jìn)行GWAS群體的建立。2017年，將種質(zhì)材料種植于河北廊坊中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)際農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園溫室中，于2018年四月份移至田間。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用隨機(jī)區(qū)組方式，共包含三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)單株，單株間距30 cm，不同種質(zhì)材料間行距和列距都為65 cm。田間管理根據(jù)生長(zhǎng)情況人工除草，沒(méi)有進(jìn)行額外施肥或者灌溉工作。

1.4 重測(cè)序與SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)

重測(cè)序和SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)根據(jù)課題組之前已報(bào)道的研究方法［25］。即基于田間表型觀察，從每份材料中選取有代表性的一株（一個(gè)種質(zhì)材料中生長(zhǎng)跟其他個(gè)體相對(duì)一致的單株個(gè)體）進(jìn)行DNA提取。每份材料取單株大約100 mg，然后使用康為植物基因組提取試劑盒按照說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取。全基因組重測(cè)序首先是將DNA利用超聲波打斷，然后選擇片段大小大約300 bp的片段，接著末端修復(fù)，然后添加通用接頭，使用PCR方法擴(kuò)增DNA。最后使用NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行DNA測(cè)序。整個(gè)測(cè)序流程在北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。每個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量大約10 Gb，測(cè)序質(zhì)量Q30達(dá)到85%。原始數(shù)據(jù)上傳至國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NGDC，https：//bigd.big.ac.cn/），BioProject編號(hào)為PRJCA004024。

測(cè)序數(shù)據(jù)首先使用Trimmomatic軟件進(jìn)行過(guò)濾，去除測(cè)序接頭和引物序列，同時(shí)也會(huì)去掉測(cè)序質(zhì)量值較低的序列。然后使用BWA-MEM軟件進(jìn)行序列比對(duì)，將重測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到‘中苜4號(hào)’參考基因組上，使用SAMtools軟件將上一步的SAM文件轉(zhuǎn)換為BAM文件并進(jìn)行排序。Picard軟件用來(lái)標(biāo)記重復(fù)序列，GATK軟件用來(lái)矯正小片段插入及缺失對(duì)SNP結(jié)果的干擾。利用SAMtools mpileup結(jié)合VarScan檢測(cè)SNP。以上軟件參數(shù)使用默認(rèn)參數(shù)。最后使用VCFtools進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾條件缺失值小于10%，次等位基因頻率大于等于0.05，最小測(cè)序深度超過(guò)5。最終開(kāi)發(fā)了875 023個(gè)高質(zhì)量SNP。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于開(kāi)發(fā)的875 023個(gè)高質(zhì)量SNP，本研究使用GAPIT3的BLINK模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析［26］。顯著性位點(diǎn)的閾值（-Log10（P），logarithm of odds，LOD）設(shè)置為5。使用R包“CMplot”進(jìn)行GWAS結(jié)果可視化。另外，對(duì)所有LOD≥5的顯著SNP位點(diǎn)進(jìn)行共定位SNP位點(diǎn)數(shù)量分析以及單倍型分析。使用R包“broom”“ggplot2”等進(jìn)行單倍型顯著性分析，顯著性檢驗(yàn)方式為T-test。對(duì)于每個(gè)SNP，選擇表型較為優(yōu)異的等位基因作為優(yōu)異等位基因。

1.6 候選基因分析

根據(jù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)信息以及連鎖不平衡鑒定候選基因?；凇熊?號(hào)’參考基因組，在顯著SNP位點(diǎn)上下游各20 kb范圍內(nèi)鑒定所有基因。使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Protein BLAST功能對(duì)這些基因進(jìn)行搜索。與種子形態(tài)和植物發(fā)育相關(guān)的已知基因被優(yōu)先考慮為影響種子產(chǎn)量與大小的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

220份材料在三個(gè)表型中出現(xiàn)了不同程度的變異（表1）。其中，SW的分布范圍為1.417～3.013 g，SA的分布范圍為1.995～3.070 mm2，SP的分布范圍為5.572～7.072 mm。三個(gè)表型的變異系數(shù)分別為10.96%（SW），8.31%（SA），4.43%（SP），SW的變異系數(shù)最大，SP的變異系數(shù)最小。其他統(tǒng)計(jì)信息比如平均值、極大值、極小值、峰度、偏度如表1所示。SW，SA和SP均呈正態(tài)分布（圖1），證實(shí)了3個(gè)表型遵循典型的數(shù)量性狀的遺傳模式。相關(guān)性分析表明（圖2），三個(gè)表型之間存在正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.001），SW與SA和SP之間的R2分別為0.3818和0.3616，SA與SP之間的R2達(dá)到了0.9780。

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于SW，SA和SP與之前研究得到的875 023個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，對(duì)220份材料進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。本研究采用GAPIT3的BLINK模型，以LOD≥5作為閾值，共得到20個(gè)與這三個(gè)種子產(chǎn)量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)（圖3和表2）。其中，與SW相關(guān)聯(lián)的有6個(gè)，與SA相關(guān)聯(lián)的8個(gè)，與SP相關(guān)聯(lián)的有6個(gè)。這20個(gè)顯著SNP分布于除2號(hào)染色體以外的7條染色體上。在這20個(gè)顯著SNP中，C/T等位基因出現(xiàn)的頻率最高，總共出現(xiàn)7次，占35%。

進(jìn)一步對(duì)GWAS結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在這20個(gè)顯著SNP中有5個(gè)SNP（chr7__10556808，chr1__75410059，chr6__20720026，chr7__54495445和chr4__11495564）共同出現(xiàn)在SA與SP中（圖4）。然而，SW并沒(méi)有出現(xiàn)與其他2個(gè)性狀共同定位的SNP位點(diǎn)，可能是因?yàn)榉N子重量與種子大小存在不同的遺傳機(jī)制。

對(duì)于顯著SNP位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行單倍型分析。選取每個(gè)SNP位點(diǎn)表型較為優(yōu)異的等位基因作為優(yōu)異等位基因。最終獲得每份材料中所含優(yōu)異等位基因數(shù)量與各表型之間關(guān)系散點(diǎn)圖（圖5），通過(guò)線性回歸曲線顯示，每份材料中所含有的優(yōu)異等位基因數(shù)量與各表型之間均存在正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.001）。其中，每份材料中優(yōu)異等位基因的數(shù)量與SA的擬合度最高（R2=0.3762），與SW的擬合度最?。≧2=0.2752）。

2.3 候選基因分析

基于‘中苜4號(hào)’參考基因組，在20個(gè)顯著SNP上下游各20 kb范圍內(nèi)共檢測(cè)到42個(gè)基因。通過(guò)基因注釋以及前人對(duì)基因功能的報(bào)道，篩選到21個(gè)參與植物發(fā)育或者生殖相關(guān)的基因（表3）。在這21個(gè)基因中，有4個(gè)基因已被報(bào)道與種子或者籽粒性狀相關(guān)。其中，與SW相關(guān)的基因有Msa0385030（FHA結(jié)構(gòu)域蛋白）、Msa0385050（MADS-box蛋白）、Msa0013950（咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶）。與SA和SP相關(guān)的基因有Msa0043950（LOB結(jié)構(gòu)域蛋白）。值得注意的是，我們篩選到的與SW相關(guān)的其中2個(gè)候選基因都位于同一個(gè)SNP位點(diǎn)（chr3__88499752）附近。而基因Msa0043950則是位于SA與SP共定位的chr1__75410059附近。

3 討論

為解決我國(guó)紫花苜蓿種子供不應(yīng)求、仍需從國(guó)外進(jìn)口草種的問(wèn)題，提高種子產(chǎn)量是可行的方法之一。種子重量與種子大小是種子產(chǎn)量的重要構(gòu)成因素。探索種子發(fā)育的遺傳機(jī)理是提高種子產(chǎn)量的首要目標(biāo)。有報(bào)道稱，在大豆（Glycine max）中，較大的種子不一定能提高種子產(chǎn)量，對(duì)比較小的種子，有時(shí)甚至?xí)档头N子產(chǎn)量［27］。但是，較大的種子被認(rèn)為能量?jī)?chǔ)備較多，并擁有較大的子葉與初始活力，種子的品質(zhì)也就比較好［28］，所以本研究以種子重量、種子面積與周長(zhǎng)較大為優(yōu)異表型。對(duì)于表型分析，三個(gè)性狀之間存在正相關(guān)關(guān)系，這與之前的研究一致［29］。另外，種子周長(zhǎng)的變異系數(shù)在三個(gè)性狀中最?。?.43%），千粒重、種子面積也存在不同程度的表型變異，表明不同苜蓿品種間存在表型多樣性，這種變異為通過(guò)優(yōu)化種子形態(tài)來(lái)育種提供了有用的遺傳潛力。

本研究選擇GAPIT3的BLINK模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，BLINK模型能更好的控制假陽(yáng)性，且BLINK模型會(huì)考慮顯著SNP的連鎖性，從而去除部分顯著SNP，只保留與性狀最相關(guān)的SNP位點(diǎn)，所以不會(huì)出現(xiàn)某一染色體區(qū)域成簇關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記［30］。本研究使用BLINK模型共在除2號(hào)染色體以外的7條染色體上發(fā)現(xiàn)20個(gè)與種子產(chǎn)量相關(guān)的顯著SNP位點(diǎn)，其中5個(gè)顯著SNP位點(diǎn)在SA與SP中被同時(shí)定位到，是值得注意的SNP位點(diǎn)。由于對(duì)紫花苜蓿種子產(chǎn)量與大小相關(guān)性狀的GWAS分析較少，本研究的發(fā)現(xiàn)將為標(biāo)記輔助育種提供新的分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)GWAS在三個(gè)性狀中找到的顯著SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，證實(shí)了每份材料中存在的優(yōu)異等位基因的數(shù)量與表型之間存在正相關(guān)關(guān)系。

本研究一共鑒定出了20個(gè)顯著SNP與4個(gè)與種子產(chǎn)量相關(guān)的候選基因。chr3__88499752周圍發(fā)現(xiàn)2個(gè)候選基因，其中Msa0385030的功能注釋為FHA結(jié)構(gòu)域蛋白，Morris等［31］發(fā)現(xiàn)，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）含有FHA結(jié)構(gòu)域蛋白的區(qū)域插入T-DNA破壞后，產(chǎn)生了一個(gè)功能缺失的突變體，該突變體對(duì)比期野生型表現(xiàn)出嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)和生殖器官缺陷，且結(jié)實(shí)率大幅降低，該試驗(yàn)證實(shí)了FHA結(jié)構(gòu)域蛋白在種子生產(chǎn)中的重要作用。chr3__88499752周圍的另一個(gè)候選基因Msa0385050的功能注釋為MADS-box蛋白，該蛋白報(bào)道的與種子相關(guān)的研究較多。MADS-box基因在植物中主要分為I型和II型MADS-box基因，部分I型MADS-box基因影響配子和種子的發(fā)育［32］，它們能夠通過(guò)促進(jìn)胚乳細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞化的發(fā)生來(lái)影響種子的發(fā)育［33］。Zhang等［34］在小麥中發(fā)現(xiàn)基因TaMADS-GS編碼MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子在小麥籽粒發(fā)育早期調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)籽粒大小和重量。chr1__21815402周圍的Msa0013950功能注釋為咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶，Huangfu等［35］研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因是水稻籽粒產(chǎn)量的正調(diào)節(jié)因子，即使在高產(chǎn)品種背景下，過(guò)表達(dá)該基因也能提高單株籽粒產(chǎn)量。與SA和SP相關(guān)的chr1__75410059，在其附近發(fā)現(xiàn)的Msa0043950，其功能注釋為L(zhǎng)OB結(jié)構(gòu)域蛋白，Bajaj等［36］曾將轉(zhuǎn)錄組分析、種子重量QTL/eQTL定位、分子單倍型和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合，確定了LOB結(jié)構(gòu)域蛋白正向調(diào)控鷹嘴豆（Cicer arietinum）種子重量。本研究中鑒定的這4個(gè)基因可為紫花苜蓿種子產(chǎn)量與大小的分子研究提供重要的候選基因。

4 結(jié)論

在本研究中，使用來(lái)自世界各地的220份紫花苜蓿種子材料，基于篩選到的875 023個(gè)高質(zhì)量SNP，對(duì)種子種子重量、種子面積、種子周長(zhǎng)3個(gè)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到20個(gè)顯著SNP和4個(gè)與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)的候選基因，其功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究旨在更好地理解控制紫花苜蓿種子大小與產(chǎn)量的遺傳和分子過(guò)程，以及為標(biāo)記輔助育種提供新的分子標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）