淺談化妝品中銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢驗?zāi)芰︱炞C方法與結(jié)果

摘 要：為了提高化妝品中銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢驗?zāi)芰?，增強實驗室間競爭能力，本實驗室連續(xù)兩年參加中檢院NIFDC-PT中銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢驗?zāi)芰︱炞C。按照作業(yè)指導(dǎo)書及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）的要求進行前期增菌及生化實驗，采用Microfiex LT/SH Smart微生物質(zhì)譜鑒定儀及VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定儀對分離出的可疑菌進行鑒定。結(jié)果顯示，兩次能力驗證結(jié)果均檢出目標菌，與中檢院指定值一致，結(jié)果滿意。本文對實驗過程及結(jié)果進行分析討論，探討提高檢驗結(jié)果準確性的方法。

關(guān)鍵詞：化妝品，能力驗證，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，微生物質(zhì)譜儀，全自動微生物鑒定儀（VITEK2）

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.015.040

0 引 言

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種革蘭氏陰性桿菌，好氧，呈長棒形的細菌，廣泛分布于自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種革蘭氏陽性球菌，成葡萄狀排列，無芽孢莢膜，可耐干燥和低溫，該菌是葡萄球菌中致病力最強的這一種[2]。銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均會引起皮膚化膿感染，皮膚有外傷及眼疾的患者若感染銅綠和金葡這兩種菌常會引起化膿性疾病，嚴重時可引發(fā)敗血癥[3]。當皮膚有創(chuàng)傷時使用被污染的化妝品感染的幾率則會大大增加，因此檢驗化妝品中是否含有銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有重要的意義。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中規(guī)定：每g或每mL中均不得檢出這兩種菌[4]。本所實驗室連續(xù)兩年參加由中國食品藥品檢定研究院組織的NIFDCPT- 4 0 2化妝品中銅綠假單胞菌檢驗?zāi)芰︱炞C和NIFDC-PT-451化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗?zāi)芰︱炞C，均取得滿意的結(jié)果。本文通過對兩次能力驗證實驗的過程及結(jié)果進行分析與研究，探討可以提高檢驗結(jié)果準確性的方法和可能影響實驗結(jié)果準確性的因素，并對此提出改正措施，為完成相關(guān)檢驗工作提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

由中國食品藥品檢定研究院提供能力驗證樣品。

銅綠假單胞菌：編號：T C 0 4 0 2 0 1 7 3 、TC04020050。

金黃色葡萄球菌：編號：T C 0 4 5 1 0 1 2 6 、TC04510478。

樣品為白色球狀物，真空放置于含有粉底膏的西林瓶中，規(guī)格為1 g/瓶。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

SCDLP（北京陸橋，批號：220602；廣東環(huán)凱，批號：1102291）；十六烷三甲基溴化銨瓊脂（青島海博，批號：2 0 210 714）；乙酰胺（廣東環(huán)凱，批號：1087081）；綠膿菌素測定培養(yǎng)基（青島海博，批號：20220128）；營養(yǎng)瓊脂（廣東環(huán)凱，批號：10 932 41）；硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基（青島海博，批號：20211105）；明膠培養(yǎng)基（青島海博，批號：20220519）；Baird-Parker培養(yǎng)基（北京陸橋，批號：230307）；血平板（北京陸橋，批號：230317）；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基（北京陸橋，批號：220418）；BHI腦心浸出液肉湯（青島海博，批號：20210819）；金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基（北京陸橋，批號：220819）；革蘭氏染色液（常德比克曼，批號：2021/10/18；青島海博，批號：20221203）。

1.3 標準菌株

銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，均購置于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 儀器與設(shè)備

IC612CW恒溫培養(yǎng)箱（雅馬拓）；BKQ-B10011壓力蒸汽滅菌器（山東博科）；101-3-BS鼓風干燥箱（上海躍進）；CX21生物顯微鏡（奧林巴斯）；BSC-1300IIA2生物安全柜（蘇州安泰）；VITEK 2COMPACT（法國梅里埃）；Microfiex LT/SH Smart微生物質(zhì)譜鑒定儀（布魯克）。

1.5 方法

依據(jù)NIFDC-PT-402化妝品中銅綠假單胞菌檢驗和NIFDC-PT-451化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗作業(yè)指導(dǎo)書以及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）的規(guī)定進行增菌、分離和鑒定。同時采用全自動微生物鑒定儀生化鑒定系統(tǒng)（VITEK 2 COMPACT）和微生物質(zhì)譜鑒定儀進行菌種鑒定，最終綜合以上結(jié)果出具報告。

1.5.1 樣品的前處理

（1）西林瓶的開啟：由于西林瓶處于高度真空狀態(tài)，開啟時應(yīng)在生物安全柜中進行。

（2）樣品的稀釋及培養(yǎng)：無菌操作向每個西林瓶樣品中加入6 mL SCDLP，將樣品充分振蕩混勻，轉(zhuǎn)移到滅菌的試管中，然后再用SCDLP分4次潤洗西林瓶，每次1 mL，最終試管中的SCDLP體積為10 mL。以同樣的方式分別處理其他樣品，將所得增菌液放置36℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24 h。同時取銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌冷凍甘油管接種于SCDLP中于36℃培養(yǎng)24 h作為陽性對照，取10mLSCDLP液體培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.5.2 鑒定

（1）銅綠假單胞菌

1）分離、純化從上述培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，分別劃線接種于十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基和乙酰胺培養(yǎng)基中，于36℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2）染色鏡檢分別從上述平板中挑取典型菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

3）氧化酶試驗取一小塊潔凈的白色濾紙上置于滅菌的平皿中，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙上，然后再滴加一滴新配制的1%二甲基對苯二胺試液，30 s內(nèi)觀察結(jié)果。

4）綠膿菌素試驗挑取分離平板上培養(yǎng)出的可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基于36℃培養(yǎng)24 h，加入氯仿5 mL充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液中，用吸管將氯仿轉(zhuǎn)移到另一個試管中并加入1mol/L的鹽酸1 mL，振蕩，靜置片刻，觀察結(jié)果。

5）硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中于36℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

6）明膠液化試驗取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基中于36℃培養(yǎng)24 h，取出置于4℃冰箱中30 min之內(nèi)觀察結(jié)果。

7）42℃生長試驗挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上于42℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

（2）金黃色葡萄球菌

1）分離、純化從上述培養(yǎng)液中取一環(huán)劃線接種于Bp平板和血平板于36℃培養(yǎng)48 h和24 h，觀察結(jié)果。

2）染色鏡檢分別從上述平板中挑取典型菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

3）甘露醇發(fā)酵試驗取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)液面上加入高度為2 mm的滅菌液體石蠟于36℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

4）血漿凝固酶試驗將純培養(yǎng)菌落接種于BHI肉湯中36℃培養(yǎng)24 h，取新鮮的肉湯培養(yǎng)物加入血漿中于36℃恒溫箱中，每半個小時觀察一次，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌

根據(jù)表1銅綠假單胞菌生化鑒定結(jié)果分析，TC04020173和TC04020050兩個樣品均符合銅綠假單胞菌陽性特征，結(jié)果可判斷均檢出銅綠假單胞菌。

為了進一步進行確證實驗，對典型菌落采用微生物質(zhì)譜的方式進行確認，兩個編號分別選取了三個可疑菌落，進行質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜儀對可疑菌鑒定結(jié)果均大于2.00，確信度均趨于最佳，利用微生物質(zhì)譜儀進一步確定兩個樣品中均含有銅綠假單胞菌，結(jié)果見表2。

2.2 金黃色葡萄球菌

根據(jù)表3金黃色葡萄球菌生化鑒定結(jié)果分析，TC04510126和TC04510478兩個樣品中均符合金黃色葡萄球菌陽性特征，結(jié)果可判斷TC04510126和TC04510478樣品中均檢出金黃色葡萄球菌。但TC04510478因干擾菌的影響，5 h后血漿才開始凝固，為了進一步進行確證實驗，并判斷有哪些干擾菌，對典型菌落和可疑菌落采用VITEK 2微生物鑒定儀的方式進行確認，得到了以下結(jié)果。

通過以上數(shù)據(jù)分析，T C 0 4 5 1 0 1 2 6 和TC04510478中均檢出金黃色葡萄球菌，并且兩個樣品中還存在大腸埃希菌、糞腸球菌、沙門菌群以及阪崎新生兒感染桿菌群等其他混合菌，結(jié)果見表4。不同的可疑菌對金黃色葡萄球菌的鑒定存在較大的干擾，因此選用外部鑒定手段能有助于結(jié)果判斷。

2.3 結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果，通過采用傳統(tǒng)的致病菌特征鑒定方式及質(zhì)譜儀和全自動微生物鑒定儀的方式進行鑒定，對檢驗結(jié)果進行判斷和確證，TC04020173、TC04020050兩份樣品中均檢出銅綠假單胞菌，TC04510126、TC04510478兩份樣品中均檢出金黃色葡萄球菌，該結(jié)果與中檢院指定值一致，結(jié)果滿意。

3 討 論

本實驗室參加的化妝品中銅綠假單胞菌檢驗?zāi)芰︱炞C和金黃色葡萄球菌檢驗?zāi)芰︱炞C是評價本實驗室在化妝品中致病菌檢驗檢測能力的重要手段，用以幫助實驗室識別在化妝品中致病菌檢測過程中可能存在的問題并及時做好改正措施[5]。2022年NIFDC-PT-402化妝品中銅綠假單胞菌檢出能力驗證結(jié)果報告中統(tǒng)計，該次能力驗證共115家實驗室上報結(jié)果，113家結(jié)果均評定為滿意，滿意度為98.26%，其中的兩家實驗室不滿意原因主要是在鑒定環(huán)節(jié)中出現(xiàn)問題或是樣品間存在交叉污染；2023年NIFDC-PT-451化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗?zāi)芰︱炞C結(jié)果報告中統(tǒng)計，該次能力驗證共220家實驗室上報結(jié)果，206家結(jié)果為滿意，14家結(jié)果為不滿意，滿意率為93.64%，這14家實驗室出現(xiàn)不滿意原因有三點：（1）增菌液、分離平板等培養(yǎng)基的質(zhì)量對金黃色葡萄球菌的分離效果影響很大，質(zhì)量不合格的培養(yǎng)基會影響目標菌的復(fù)蘇和分離效果，導(dǎo)致假陰性結(jié)果；（2）實驗室人員操作技術(shù)對檢驗結(jié)果也產(chǎn)生了很大的影響，導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果；（3）金黃色葡萄球菌在人體皮膚及環(huán)境中均存在，檢驗過程中無菌操作執(zhí)行不到位，導(dǎo)致了假陽性結(jié)果。為避免上述問題對實驗結(jié)果準確性的影響，需要從檢驗人員、檢驗設(shè)備、檢驗材料、檢驗方法及檢驗環(huán)境五個方面進行質(zhì)量控制。例如，保證實驗環(huán)境符合潔凈要求，減少由于環(huán)境中的微生物而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性的情況；操作人員具備專業(yè)知識和實踐水平，實驗過程中應(yīng)保證無菌操作，這樣可避免因人員操作而造成的交叉感染；對實驗中所使用的試劑、培養(yǎng)基等做好質(zhì)控，同時也可采用選擇性培養(yǎng)基幫助判斷，提高檢驗結(jié)果的準確性；配置必要的微生物鑒定設(shè)備，在不確定的情況下可采用多種鑒定方法進行驗證，可得到更為準確的結(jié)果[6]。

參考文獻

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作者簡介

胡陽，本科，主管藥師，研究方向食品藥品化妝品微生物檢驗。

（責任編輯：張瑞洋）