國標法測定特醫(yī)食品中葉酸的方法研究

摘 要：目的：研究不同儲備菌株培養(yǎng)時間，檢測體系培養(yǎng)時間、樣品稀釋倍數以及試樣本底空白對特殊醫(yī)學配方食品（簡稱特醫(yī)食品）檢測結果的影響。方法：比較儲備菌株培養(yǎng)24 h和48 h后制備的種子液進行檢測后結果的差異；比較標準曲線和試樣系列管培養(yǎng)20 h后，每間隔2 h吸光度值的變化和檢測結果的差異；比較樣品進行0.5 f、f、2 f稀釋后檢測結果的差異；比較是否扣除試樣本底空白對檢測結果的影響。結果：儲備菌株活化24 h測得質控樣平均值為97.2 μg/100 g，儲備菌株活化48 h測得質控樣平均值為106 μg/100 g；培養(yǎng)時間20～38 h內，質控樣檢測結果標準差為5.37%，符合給定的數值范圍；稀釋倍數對結果的影響跟樣品基質相關；試樣本底空白對檢測結果有影響，建議當本底空白A540超過0.05時，結果處理時扣除本底空白。結論：建議使用活化48 h的儲備菌株制備種子液，檢測體系培養(yǎng)時間可根據接種液濁度選擇培養(yǎng)時間，推薦對按照標簽值的1.5 f進行稀釋，并在結果處理時根據需要扣除試樣本底空白。

關鍵詞：特醫(yī)食品，國標法，葉酸

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.015.039

0 引 言

葉酸是一種水溶性的維生素，參與幾乎所有生物代謝，在物質的合成和代謝中起關鍵作用，人類無法離開葉酸而生存。一旦被機體吸收后，除了儲存于肝臟的一部分，它會轉變成至少5種具有活性的輔酶形式作為一碳單元的傳送裝置，從而參與DNA和RNA的生物合成[1]，氨基酸的代謝如同型半胱氨酸的再甲基化及血紅蛋白的合成等生理代謝過程[2]。此外，葉酸能提供大量游離碳離子，為神經末梢和構成傳遞神經沖動的重要化學原料物質，進而保障神經系統(tǒng)的正常發(fā)育[3]，因此它在嬰兒發(fā)育、懷孕過程中尤為重要。

特殊醫(yī)學配方食品是為了滿足進食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)人群對營養(yǎng)素或膳食的特殊需要，專門加工配制而成的配方食品[4]。國家強制標準規(guī)定葉酸是特殊醫(yī)學用途配方食品等食品的必需成分，且含量要求非常嚴格[5] ， 對葉酸檢測方法需要較高的靈敏度和較低的檢出限。目前常用葉酸檢測方法有分光光度計法[6]，熒光法[7]、高效液相色譜[8]、液相-質譜聯(lián)用法[9]、微生物法[10]和免疫法[11]。以上幾種方法各有優(yōu)缺點，適用基質各有不同。微生物法操作關鍵點多，檢測周期長，結果平行性和穩(wěn)定性差，工作量大，對環(huán)境、人員、菌種和培養(yǎng)基要求高，但傳統(tǒng)微生物法依然是我國現行檢測國家標準提出的方法，它可測定具有生物活性的葉酸，能滿足含量低和基質復雜的特醫(yī)食品檢測要求。

為使國標法進行葉酸檢測更準確，更便捷，本文從儲備菌株培養(yǎng)時間，檢測體系培養(yǎng)時間，樣品的稀釋倍數以及樣品空白對檢測結果的影響幾個方面討論微生物法葉酸測定的細節(jié)問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

鼠李糖乳桿菌ATCC 7469（美國菌種保藏中心ATCC）；菌種儲備用瓊脂培養(yǎng)基、葉酸測定培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司）；葉酸標準品（純度99.3%，北京科量技術有限公司）；葉酸定量分析質控樣品（QC-IP-705）（特性值109.82 μg/100 g、特性值區(qū)間90.36～129.28 μg/100 g，中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心）；9種特殊醫(yī)學用途配方食品。

1.2 主要儀器與設備

U V2 6 0 0紫外可見分光光度計（日本島津公司）；IN160plus恒溫培養(yǎng)箱（德國美墨爾特公司）；AW2 0 0 S G厭氧工作站（英國伊萊泰科公司）；DensiCHEK Plus比濁儀（生物梅里埃中國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 接種液的制備

選擇一批經驗證的鼠李糖乳桿菌（含20%甘油）作為工作菌株使用，實驗前將保存于-20℃的工作菌株劃線于菌種儲備用瓊脂培養(yǎng)基，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。按照GB 5009.211—2022 5.3進行種子液的制備。

1.3.2 試樣提取

采用直接提取法，準確稱取固體試樣0.1～2 g，精確至0.0001 g，轉入錐形瓶中，加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲振蕩2 h至試樣完全溶解或分散，轉入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

1.3.3 試樣測定

采用試管法進行試樣測定。

取3支試管，分別加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL試樣稀釋液，補水至5.0 mL，混勻，每個梯度做兩個平行。另取2支試管加入5 mL試樣，不接菌，作為試樣本底空白。

1.3.4 培養(yǎng)

置于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～40 h，培養(yǎng)20 h后，每隔2 h依次測定標準系列管和質控樣系列管的在540 nm處的吸光度值。

1.3.5 數據處理

以標準系列管的葉酸含量為橫坐標，每個標準點的吸光值平均值為縱坐標，做采用EL ISA進行四參數曲線擬合，得到標準曲線，計算試樣系列管中葉酸的含量。其他無變化檢測步驟參照GB5009.211—2022。

2 結果與分析

2.1 儲備菌株活化時間對測定結果的影響

葉酸測定菌株按照GB 5009.211—2022 5.2規(guī)定需要36℃±1℃培養(yǎng)20～24 h的活化菌株用于后續(xù)接種液的制備，但是鼠李糖乳桿菌在儲備用瓊脂培養(yǎng)基上36℃±1℃厭氧生長24 h后菌落較小，需培養(yǎng)至48 h菌落為正常大小。

取菌種儲備用瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h和48 h的鼠李糖乳桿菌分別制備的種子液進行后續(xù)實驗，記錄觀察葉酸含量為1.0 ng的標準系列管吸光度值到達0.95±0.2需要的時間t，以及得到的標準曲線和質控樣品測定值的結果，見表1。

由表1可見，生長至可測定吸光度值需要的時間跟接種液的濁度相關，接種液濁度大，生長至可測定渾濁度需要的時間短；儲備菌株活化24 h和48 h獲得標準曲線r 2均大于0.995，相關性較好，但是由菌株活化2 4 h進行后續(xù)實驗測定的質控樣值偏低（平均值為97.2 μg /10 0 g），菌株活化48 h進行后續(xù)實驗測定的質控樣值（平均值為106μg/100 g）更接近特性值。建議菌種活化48 h后再進行接種液的制備。

2.2 培養(yǎng)時間對檢測結果的影響

G B 5 0 0 9. 211—2 0 2 2中試管法培養(yǎng)時間為20～40 h，獲得最大渾濁度時終止培養(yǎng)。由于培養(yǎng)時間跨度比較大，對于最大渾濁度較難準確獲得，不方便日常檢測。經過培養(yǎng)20 h后，每隔2小時測定不同含量的葉酸標準系列管和試樣系列管隨著培養(yǎng)時間吸光度值的變化見表2。

由表2可以得出，在20～40 h的培養(yǎng)時間內，每隔2 h測定標準曲線吸光度值得到的線性結果線性較好，r 2均大于0.9900。低含量（葉酸含量＜0.5 ng）時隨著培養(yǎng)時間的OD值出現整體增加趨勢，質控樣品和高含量（葉酸含量≥0.5 ng）的標準系列管隨著培養(yǎng)時間逐漸增加，但是當培養(yǎng)至40 h，OD開始降低，可見培養(yǎng)至38 h時獲得最大渾濁度。除培養(yǎng)40 h外，質控樣品試樣的吸光度值隨著培養(yǎng)時間逐漸增加，測定結果均在特性值區(qū)間。當培養(yǎng)至40 h，生長測得質控值偏離特性值區(qū)間。推測隨著培養(yǎng)時間的延長，鼠李糖乳桿菌對反應管中的葉酸利用度達到頂峰后，難以再繼續(xù)生長繁殖導致吸光度值開始下降?？梢姰斀臃N液濁度為2.5 MCF時，培養(yǎng)至38 h時獲得最大渾濁度，在培養(yǎng)時間20～38 h內，都可以進行檢測。但當接種液濁度增加或減少時，達到培養(yǎng)至最大渾濁度的時間則會縮短或延長。

另外，標準曲線對檢測結果影響較大，以A540為0.500時為例，代入表2不同培養(yǎng)時間的標準曲線，對應的葉酸含量在1.8～0.5 ng之間，結果差異較大。盡管每次獨立檢測采用同一標準溶液，由于檢測過程影響因素較多，故每次獨立實驗都必須進行標準系列管的制備，減少實驗誤差。史方等[12]在做葉酸測定的測量不確定分析發(fā)現，測量不確定度主要來源于標準曲線擬合，其次是測量重復性，分析認為微生物法測量影響因素的發(fā)散性較大，建議實驗過程中必須嚴格控制實驗條件，嚴格規(guī)范操作從而獲得重復性好的理想結果，減小測量結果的不確定度，保證檢測結果的質量。

2.3 稀釋倍數的估算對結果的影響

由表3可見，隨著稀釋倍數增加，測定結果偏高；稀釋過程推測跟基質關系較大，基質簡單的，不受稀釋倍數影響；基質復雜的，隨著稀釋倍數增大，結果變化較大。為提高檢測的準確度和減少實驗重復次數，推薦將樣品同時進行f和2f的稀釋倍數；根據測定值和標示值之比，既能接近樣品實際含量又能減少稀釋過程帶來的工作量，建議優(yōu)先考慮1.5f稀釋倍數，以使其葉酸濃度在0.2～0.3 ng/mL之間。

2.4 樣品空白對結果的影響

特醫(yī)食品多以乳清蛋白粉、脫脂乳粉和脂肪粉等多種原料進行加工，顏色有淡黃色，乳白色等，為排除樣品基質顏色和澄清度對吸光度帶來的影響，本試驗增加了試樣本底空白對照。表4中試樣本底空白為5 mL樣品稀釋液與5 mL 培養(yǎng)基混勻培養(yǎng)后在540處的吸光度值。由表4可見，不同試樣空白有明顯差異，對比是否扣除試樣本底空白得到的結果，兩組數據差距高達26%，只有當本底空白小于0.05時，數據偏差小于10%。建議本底空白A540超過0.05時，扣除樣品空白再進行數據處理，以減少由此引起的結果偏差。

3 結 語

特醫(yī)食品中葉酸的測定過程影響因素較多，經試驗，儲備菌種活化時間、檢測體系培養(yǎng)時間、標準曲線、樣品稀釋倍數以及樣品空白都對檢測結果產生影響。

由儲備菌株活化24 h進行后續(xù)實驗測定的質控樣值偏低，菌株活化48 h進行后續(xù)實驗測定的質控樣值更接近特性值，偏差更小。這可能與菌株活化24 h后鼠李糖乳桿菌活力較低，在接種液的制備過程活力也非最佳狀態(tài)，導致試樣的培養(yǎng)階段對試樣中的葉酸未達到完全利用的狀態(tài)，造成檢測結果偏低。另外，檢測體系培養(yǎng)時間的長短與接種液的濁度負相關，當接種液濁度高時，達到可測定的培養(yǎng)時間短；接種液濁度低時，達到可測定的培養(yǎng)時間長，可結合接種液濁度進行培養(yǎng)時間的調整。結合陸其聰[13]等人發(fā)現檢測體系pH值對鼠李糖乳桿菌生長有影響，培養(yǎng)至22 h活菌數急劇下降，通常推薦培養(yǎng)22～24 h進行測定。另外，微生物法進行葉酸測定實驗環(huán)節(jié)較多，工作量較大，選擇合適稀釋倍數對減少工作量，提高檢測結果的準確性有決定性作用，特醫(yī)食品優(yōu)先推薦1. 5f 稀釋倍數。且再進行結果處理需考慮試樣本底空白的影響。

微生物法測定葉酸的原理是在一定控制條件下，將營養(yǎng)缺陷型的鼠李糖乳桿菌菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間后測定透光率（或吸光度值），在一定測定范圍內可以根據葉酸含量與透光率（或吸光度值）的標準曲線計算出試樣中葉酸的含量。培養(yǎng)過程既包含鼠李糖乳桿菌的生長過程，又包含鼠李糖乳桿菌對不同含量的葉酸利用情況，影響因素較多，陸其聰等[13]，孫瀟惠等[14]，吳思敏等[15]，夏亞文等[16]各從不同角度對葉酸測定過程中影響因素進行了研究，以使葉酸測定過程更簡便，影響因素更精準，檢測結果更準確。今后如有更多從鼠李糖乳桿菌代謝葉酸方向的研究，將對微生物法進行葉酸精準測定更有靶向性。

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作者簡介

于瑞莉，碩士研究生，高級工程師，研究方向為食品微生物檢測和維生素檢測。

黃麗俊，通信作者，碩士研究生，高級工程師，主要研究方向為食品安全檢測。

（責任編輯：張佩玉）