槲皮素調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號通路對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織血管數(shù)的影響

摘要：目的 探討槲皮素（QUE）對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織血管數(shù)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路的影響。方法 正畸牙移動大鼠隨機(jī)分為模型（Model）組、槲皮素低/高劑量（QUE-L/QUE-H）組、槲皮素高劑量+通路抑制劑YC-1組（QUE-H+YC-1組），每組12只；另取12只為對照組（Control組）。測量各組大鼠第一磨牙移動距離；HE染色觀察牙周組織病理變化并統(tǒng)計(jì)牙周組織血管數(shù)；免疫組化檢測牙周組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2、BMP4表達(dá)情況；蛋白質(zhì)印跡檢測HIF-1α/VEGF信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 Model組較Control組牙周組織纖維排列分散紊亂，細(xì)胞間隙增大，大量炎性細(xì)胞浸潤及骨吸收陷窩，第一磨牙移動距離增大，牙周組織血管數(shù)減少，BMP2、BMP4、HIF-1α、VEGF表達(dá)降低（P＜0.05）；QUE-L、QUE-H組較Model組牙周組織纖維排列相對緊密，炎性細(xì)胞浸潤減少，牙槽骨吸收現(xiàn)象減輕，第一磨牙移動距離減小，牙周組織血管數(shù)增多，BMP2、BMP4、HIF-1α、VEGF表達(dá)升高（P＜0.05）；QUE-H+YC-1組較QUE-H組牙周組織纖維排列分散紊亂，細(xì)胞間隙明顯，炎性細(xì)胞浸潤加劇，骨吸收陷窩增多，第一磨牙移動距離增大，牙周組織血管數(shù)減少，BMP2、BMP4、HIF-1α、VEGF表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論 槲皮素可促進(jìn)大鼠正畸牙移動過程中牙周組織血管生成，其作用機(jī)制與激活HIF-1α/VEGF信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：槲皮素；缺氧誘導(dǎo)因子1；血管內(nèi)皮生長因子類；牙正畸牽引；牙周組織；血管重塑

中圖分類號：R783.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240663

Effects of quercetin on periodontal tissue angiogenesis during orthodontic tooth movement in rats by regulating HIF-1α/VEGF signaling pathway

ZHENG Yaru， HUANG Yibin， SU Xiaoping△， ZHANG Yanjun

Department of Stomatology， The 909th Hospital/Dongnan Hospital of Xiamen University， Zhangzhou 363000， China

△Corresponding Author E-mail： q15lbl@163.com

Abstract： Objective To investigate the impacts of quercetin （QUE） on angiogenesis and hypoxia inducible factor-1α/vascular endothelial growth factor （HIF-1α/VEGF） signaling pathway in periodontal tissue of orthodontic tooth movement in rats. Methods A rat model of orthodontic tooth movement was constructed， and the modeled rats were randomly separated into the model group， the low-dose quercetin treatment （QUE-L） group， the high-dose quercetin treatment （QUE-H） group and the QUE-H+pathway inhibitor YC-1 （QUE-H+YC-1） group， with 12 rats in each group. Another 12 rats were regarded as the control group. The movement distance of the first molar of rats in each group was measured. HE staining was applied to observe the pathological changes of periodontal tissue and count the number of blood vessels generated in periodontal tissue. Immunohistochemistry was applied to detect expression levels of bone morphogenetic protein 2 （BMP2） and bone morphogenetic protein 4 （BMP4） in periodontal tissue. Western blot assay was applied to detect the expression of HIF-1α/VEGF signaling pathway related proteins. Results Compared with the control group， the periodontal tissue fibers were scattered and disordered in the model group， with an increased intercellular space， infiltration of a large number of inflammatory cells and bone resorption pits， the movement distance of the first molar increased， the number of periodontal tissue blood vessels decreased， and the expression of BMP2， BMP4， HIF-1α and VEGF decreased （P＜0.05）. The fibrous arrangement of periodontal tissue was relatively tight in the QUE-L group and the QUE-H group compared to the model group， with reduced infiltration of inflammatory cells and reduced alveolar bone resorption. The movement distance of the first molar decreased， the number of periodontal tissue blood vessels increased， and the expression of BMP2， BMP4， HIF-1α and VEGF increased （P＜0.05）. Compared with the QUE-H group， the periodontal tissue fibers in the QUE-H+YC-1 group were scattered and disordered， with obvious intercellular gaps， increased infiltration of inflammatory cells and increased bone resorption pits， the movement distance of the first molar increased， the number of blood vessels in periodontal tissue decreased， and the expression of BMP2， BMP4， HIF-1α and VEGF decreased （P＜0.05）. Conclusion Quercetin can promote angiogenesis in periodontal tissue during orthodontic tooth movement in rats， and its mechanism is related to the activation of the HIF-1α/VEGF signaling pathway.

Key words： quercetin; hypoxia-inducible factor 1; vascular endothelial growth factors; orthodontic extrusion; periodontium; vascular remodeling

牙齒畸形是指兒童在生長過程中受多種因素影響導(dǎo)致其頜骨、顱面、牙齒發(fā)生畸形，影響咀嚼功能，進(jìn)而影響患者正常生活，而且其造成的不美觀面部形象易使患者產(chǎn)生自卑心理［1］。目前，臨床主要通過佩戴矯形器進(jìn)行正畸治療［2］。但正畸牙移動較慢，治療恢復(fù)時間長，且期間易引發(fā)牙根吸收、牙周炎等并發(fā)癥，因此尋求安全高效并可加快牙移動速度的有效藥物是研究重點(diǎn)［3］。槲皮素（quercetin，QUE）是具有抗菌抑炎、抗過敏、抗自由基等多種生物活性的黃酮醇類化合物，可增強(qiáng)機(jī)體免疫及牙周組織工程的成骨分化。研究顯示，槲皮素干預(yù)可以恢復(fù)牙周韌帶干細(xì)胞的成骨/血管生成能力，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，發(fā)揮骨免疫調(diào)節(jié)作用［4］。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路是參與血管及骨生成的關(guān)鍵通路，激活該通路可促進(jìn)毛細(xì)血管生成，改善骨修復(fù)過程中的血管數(shù)［5］。目前，有關(guān)槲皮素能否通過調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路以改善正畸牙移動大鼠牙周組織血管數(shù)研究鮮見。本研究通過探討槲皮素對正畸牙移動大鼠牙周組織血管數(shù)及HIF-1α/VEGF信號通路的影響，以期為正畸牙的移動治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 主要材料及儀器 SPF級雄性SD大鼠60只，7周齡，體質(zhì)量（190±10）g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)，生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2023-0001；槲皮素（濃度≥98％，P0242）購自廣東一方制藥公司；YC-1（Y102）購自美國MCE公司；HE染色試劑盒（G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2、BMP4一抗抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔lgG二抗購自英國Abcam公司；兔源HIF-1α、VEGF一抗抗體購自美國圣克魯斯生物公司。BH-2顯微鏡購自日本Olympus公司；4200SF型凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能公司。本研究在廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，已通過廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理號：202401003）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠正畸牙移動模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)［6］，取48只大鼠麻醉后仰臥位固定，用不銹鋼結(jié)扎絲緊密結(jié)扎大鼠上頜右側(cè)第一磨牙牙頸部及鎳鈦螺旋拉簧一端，再取一根結(jié)扎絲結(jié)扎拉簧另一端并固定在上頜前牙上，固定結(jié)扎絲使拉簧力量維持在100 g，持續(xù)10 d，每天檢查加力裝置，如有脫落及時重新結(jié)扎，建立正畸牙移動大鼠模型。將造模大鼠參照隨機(jī)抽樣法分為模型（Model）組、槲皮素低（QUE-L）/高（QUE-H）劑量組、槲皮素高劑量+通路抑制劑YC-1（QUE-H+YC-1）組，每組12只。另取剩余12只正常健康大鼠作為對照（Control）組，只在上頜第一磨牙與切牙之間放置結(jié)扎絲，但無彈簧牽引力；QUE-L、QUE-H組分別給予75、150 mg/（kg·d）槲皮素灌胃［7］；QUE-H+YC-1組給予150 mg/（kg·d）槲皮素灌胃及10 mg/kg的YC-1腹腔注射［8］；Control組與Model組給予與QUE-L、QUE-H組等劑量的生理鹽水灌胃；連續(xù)給藥6周。

1.2.2 第一磨牙移動距離測量 給藥結(jié)束后處死各組大鼠，分離右側(cè)整個上頜組織，游標(biāo)卡尺測量第一磨牙與第二磨牙鄰面接觸點(diǎn)間的距離，每只測量6次，取平均值作為第一磨牙移動距離，全程由同一名實(shí)驗(yàn)人員操作。

1.2.3 牙周組織病理觀察 麻醉處死各組大鼠后，取部分上頜右側(cè)第一磨牙周圍的牙周組織，各組任選6只大鼠牙周組織進(jìn)行4%多聚甲醛固定，隨后加入EDTA脫鈣，浸蠟包埋切片，脫蠟水化后HE染色，清洗后干燥封片，顯微鏡觀察牙周組織病理及血管情況。取每塊切片的6個視野血管數(shù)量的均值作為每例樣本血管數(shù)。

1.2.4 HIF-1α/VEGF信號通路相關(guān)蛋白檢測 將各組剩余的6只大鼠第一磨牙周圍的牙周組織加入裂解液震蕩以充分裂解蛋白，提取總蛋白并進(jìn)行定量，沸水浴變性，電泳分離，濕轉(zhuǎn)膜封閉，然后與兔源HIF-1α（1∶500）、VEGF（1∶500）一抗4 ℃共孵育過夜，清洗后再與羊抗兔lgG二抗（1∶1 000）孵育，ECL顯色，Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析并計(jì)算其相對表達(dá)量。

1.2.5 牙周組織BMP2、BMP4表達(dá)檢測 取1.2.3制備的石蠟切片，常規(guī)脫蠟，加入3% H2O2除去過氧化氫酶，清洗后膜蛋白酶處理進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉，再將兔源BMP2（1∶" " " 1 000）、BMP4（1∶600）一抗分別與封閉膜4 ℃孵育過夜，再與羊抗兔lgG二抗（1∶1 000）室溫孵育，參照免疫組化檢測試劑盒說明書染色，顯微鏡觀察切片染色結(jié)果并分析BMP2、BMP4平均光密度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用[[x] ±s]表示，2組間比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組第一磨牙移動距離和牙周組織血管數(shù)比較 與Control組比較，Model組第一磨牙移動距離增大，牙周組織血管數(shù)減少（P＜0.05）；與Model組比較，QUE-L、QUE-H組第一磨牙移動距離依次減小，牙周組織血管數(shù)依次增加（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+YC-1組第一磨牙移動距離增大，牙周組織血管數(shù)減少（P＜0.05），見表1。

2.2 各組牙周組織病理變化 Control組牙周組織纖維排列緊密，細(xì)胞排列整齊，無明顯炎性細(xì)胞浸潤及牙槽骨吸收現(xiàn)象；Model組較Control組牙周組織纖維排列分散紊亂，細(xì)胞間隙增大，有大量炎性細(xì)胞浸潤及骨吸收陷窩；QUE-L、QUE-H組較Model組牙周組織纖維排列相對緊密，炎性細(xì)胞浸潤減少，牙槽骨吸收現(xiàn)象減輕，其中QUE-H組變化最顯著；QUE-H+YC-1組較QUE-H組牙周組織纖維排列分散紊亂，細(xì)胞間隙明顯，炎性細(xì)胞浸潤加劇，骨吸收陷窩增多，見圖1。

2.3 槲皮素對HIF-1α/VEGF信號通路的影響 與Control組比較，Model組HIF-1α、VEGF表達(dá)降低（P＜0.05）；與Model組比較，QUE-L、QUE-H組HIF-1α、VEGF表達(dá)依次升高（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+YC-1組HIF-1α、VEGF表達(dá)降低（P＜0.05）；見圖2、表2。

2.4 各組BMP2、BMP4相對表達(dá)水平比較 與Control組比較，Model組BMP2、BMP4表達(dá)降低（P＜0.05）；與Model組比較，QUE-L、QUE-H組BMP2、BMP4表達(dá)依次升高（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+YC-1組BMP2、BMP4表達(dá)降低（P＜0.05），見表3、圖3。

3 討論

牙齒畸形發(fā)病率較高，機(jī)械治療可一定程度上改善牙齒畸形，但牙齒畸形仍易復(fù)發(fā)［9］。目前，針對牙齒畸形，臨床主要通過外科手術(shù)、藥物、物理等方法激活鄰近組織相應(yīng)的破骨、成骨活性，加速骨吸收及合成，快速改建局部軟硬組織，加快骨改建進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)正畸牙移動，達(dá)到矯正牙齒的目的［10］。槲皮素廣泛存在于多種植物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)成骨/血管生成等多種藥理活性，其在牙周組織保護(hù)等方面也具有重要作用［11］。研究顯示，槲皮素可促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，防止骨質(zhì)流失［12］。槲皮素還可促進(jìn)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨分化，加強(qiáng)牙周組織的成骨效果［13］。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可縮短第一磨牙移動距離，減少牙周組織炎性細(xì)胞浸潤及牙槽骨吸收現(xiàn)象，增加血管數(shù)量，證實(shí)其可促進(jìn)正畸牙移動大鼠牙周組織血管的生成。

牙周組織改建是正畸牙移動的基礎(chǔ)，過程復(fù)雜，主要受牙槽骨吸收和新骨形成的影響，主要機(jī)制為牙槽骨張力側(cè)受到牽引力誘導(dǎo)會產(chǎn)生大量成骨細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)新生骨組織產(chǎn)生和沉積，壓力側(cè)受到牽引力的作用會促進(jìn)牙周膜細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，形成破骨細(xì)胞，促進(jìn)牙槽骨吸收［14-15］。BMP蛋白家族在牙髓細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，而BMP2、BMP4蛋白屬于BMP蛋白家族，是參與骨質(zhì)形成的關(guān)鍵蛋白，其高表達(dá)可促進(jìn)骨質(zhì)快速形成，可作為判定骨改建能力的重要標(biāo)志物。研究顯示，BMP2、BMP4表達(dá)升高可加速骨質(zhì)生成，促進(jìn)正畸牙復(fù)發(fā)大鼠牙周組織改建，減緩大鼠正畸牙復(fù)發(fā)［16］。本研究結(jié)果證實(shí)，槲皮素可升高牙周組織中BMP2、BMP4表達(dá)，證實(shí)了槲皮素尤其高劑量可促進(jìn)骨生成，加速牙周組織改建。

牙周組織血管數(shù)在正畸牙移動過程中同樣具有重要作用，而HIF-1α/VEGF信號通路是參與牙周組織血管數(shù)的關(guān)鍵通路。正畸牙移動過程中，正畸力可改變張力側(cè)與壓力側(cè)牙周膜形態(tài)及牙周膜內(nèi)血管擴(kuò)張和收縮情況，導(dǎo)致血供減少和機(jī)體缺氧，誘導(dǎo)血管數(shù)的啟動因子HIF-1α高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)并活化VEGF等下游成血管基因規(guī)律釋放，促進(jìn)血管數(shù)增加并向缺氧骨組織內(nèi)輸送營養(yǎng)與氧氣，促進(jìn)骨形成，加快牙周組織早期改建及組織修復(fù)過程［17-18］。有研究顯示，過表達(dá)HIF-1α可促進(jìn)乳牙牙髓干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化［19］。VEGF參與牙周組織再生的細(xì)胞增殖、遷移和分化等過程，HIF-1α可通過激活VEGF促進(jìn)血管新生并通過輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)參與骨形成過程，進(jìn)而整合新生的牙周組織，促進(jìn)牙周組織的修復(fù)再生［20-21］。上調(diào)HIF-1α、VEGF表達(dá)可促進(jìn)血管生成及牙髓干細(xì)胞的成骨分化［22］。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可升高HIF-1α、VEGF表達(dá)，推測其可能通過激活HIF-1α/VEGF信號通路促進(jìn)大鼠正畸牙移動牙周組織血管生成，而通路抑制劑YC-1可部分逆轉(zhuǎn)槲皮素對正畸牙移動大鼠牙周組織血管生成的促進(jìn)作用，證實(shí)了槲皮素可通過激活HIF-1α/VEGF信號通路促進(jìn)正畸牙移動大鼠牙周組織血管生成。

綜上所述，槲皮素可促進(jìn)正畸牙移動大鼠牙周組織血管生成，其作用機(jī)制與激活HIF-1α/VEGF信號通路有關(guān)，但槲皮素對該信號通路的具體作用機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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（2024-05-28收稿 2024-08-15修回）

（本文編輯 陸榮展）