金合歡素調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4信號通路對脂多糖誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡的影響

摘要：目的 探究金合歡素（ACE）通過調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白1（HMGB1）/Toll樣受體4（TLR4）信號通路對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡的影響。方法 從5例正畸、阻生患者拔除的健康牙齒的牙髓中分離、克隆、純化第三代牙髓細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)并通過免疫熒光鑒定基質(zhì)細(xì)胞表面抗原1（STRO1）；流式細(xì)胞術(shù)鑒定表皮抗原CD90、CD105、CD34、CD45；MTT鑒定ACE對原代牙髓細(xì)胞（DPSCs）活性影響。將DPSCs分為Control組（0 μmol/L ACE培養(yǎng)）、LPS組（1 ng/L LPS處理）、L-ACE組（LPS組基礎(chǔ)上加20 μmol/L ACE）、H-ACE組（LPS組基礎(chǔ)上加40 μmol/L ACE）、pcDNA-NC組（H-ACE組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染pcDNA-NC質(zhì)粒），HMGB組（H-ACE組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染pcDNA-HMGB）。CCK-8檢測細(xì)胞增殖；克隆形成實驗檢測克隆形成數(shù)；Western blot實驗檢測HMGB1/TLR4通路、凋亡、炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量。結(jié)果 從細(xì)胞形態(tài)、STRO1陽性表達(dá)以及CD90、CD105呈陽性，CD34、CD45呈陰性鑒定成功分離DPSCs。與Control組比較，LPS組細(xì)胞增殖活力、克隆細(xì)胞數(shù)、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、IL-4水平減少，細(xì)胞凋亡率、通路相關(guān)蛋白HMGB1、TLR4，凋亡相關(guān)蛋白胱天蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-7、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）以及炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，L-ACE組、H-ACE組細(xì)胞增殖活力、Bcl-2、IL-4依次升高，細(xì)胞凋亡率、HMGB1、TLR4、Caspase-3、Caspase-7、Bax以及IL-1β、TNF-α水平依次降低（P＜0.05）；過表達(dá)HMGB逆轉(zhuǎn)了H-ACE對細(xì)胞增殖、凋亡、相關(guān)蛋白及炎癥因子表達(dá)的影響（P＜0.05）。結(jié)論 ACE通過影響HMGB1/TLR4信號通路活化，實現(xiàn)抑制LPS誘導(dǎo)的DPSCs凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。

關(guān)鍵詞：HMGB1蛋白質(zhì)；Toll樣受體4；金合歡屬；脂多糖類；牙髓炎；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；牙髓細(xì)胞

中圖分類號：R781.31，R34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240738

Effect of acacetin on lipopolysaccharide induced apoptosis of dental pulp cells by regulating the HMGB1/TLR4 signaling pathway

LIN Yao1， LIU Congna2， WANG Shixia2， ZHANG Zhiyong2△

1 Department of Stomatology， Tangshan Maternal and Child Health Hospital， Tangshan 063000， China;

2 Department of Stomatology， Second Hospital of Hebei Medical University

△Corresponding Author E-mail： p39cck@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of acacetin （ACE） on the apoptosis of dental pulp cells induced by lipopolysaccharide （LPS） by regulating the high mobility histone 1 （HMGB1）/Toll-like receptor 4 （TLR4） signaling pathway. Methods Third generation dental pulp cells were isolated， cloned and purified from pulp of five patients with healthy teeth extracted from orthodontics and impaction. Cell morphology was observed and identification of stromal cell surface antigen1（STRO1） by immunofluorescence， and epidermal antigens CD90， CD105， CD34 and CD45 were identified by flow cytometry. MTT was applied to identify the effect of ACE on the activity of primary dental pulp cells （DPSCs）. DPSCs were divided into the control group （0 μmol/L ACE culture）， the LPS group （1 ng/L LPS treatment）， the L-ACE group （added 20 μmol/L ACE on the basis of LPS group）， the H-ACE group （added 40 μmol/L ACE on the basis of LPS group）， the pcDNA-NC group （transfected pcDNA-NC plasmid on the basis of H-ACE group） and the HMGB group （transfected pcDNA-HMGB on the basis of H-ACE group）. Cell proliferation was detected by CCK-8. Clone formation number was detected by clone formation assay. Western blot experiments were applied to detect the expression of HMGB1/TLR4 pathway， apoptosis and inflammation related proteins. ELISA assay was applied to detect levels of interleukin （IL-）-1β， IL-4 and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in cell supernatant. Results DPSCs were successfully isolated and identified based on cell morphology， positive expression of STRO1， positive expression of CD90 and CD105， and negative identification of CD34 and CD45. Compared with the control group， cell proliferation activity， clonal cell count， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） and IL-4 levels were decreased in the LPS group， while apoptosis rate， the pathway related proteins HMGB1， TLR4， apoptosis related proteins aspartate-specific cysteine protease （Caspase） -3， Caspase-7， Bcl-2 associated X protein （Bax）， and inflammatory factors IL-1β， TNF-α were increased in the LPS group （P＜0.05）. Compared with the LPS group， cell proliferation activity， Bcl-2 and IL-4 were increased successively in the L-ACE group and the H-ACE group， and apoptosis rate， pathway-related proteins HMGB1， TLR4， Caspase-3， Caspase-7 and Bax， and inflammatory factors IL-1β， TNF-α were reduced successively （P＜0.05）. Overexpression of HMGB reversed the effects of H-ACE on cell proliferation， apoptosis， expression of related proteins and inflammatory factors （P＜0.05）. Conclusion ACE inhibits LPS induced apoptosis of dental pulp cells， and it may be achieved by inhibiting the HMGB1/TLR4 signaling pathway.

Key words： HMGB1 protein; Toll-like receptor 4; acacia; lipopolysaccharides; pulpitis; apoptosis; cell proliferation; pulp cell

牙髓組織炎癥是由細(xì)菌感染引起的齲病、牙周疾病等，其中牙髓炎是一種由口腔細(xì)菌在牙齒表面積聚引起的感染性疾?。?］。牙髓炎包括可逆牙髓炎和不可逆牙髓炎（irreversible pulpitis，IP），其中IP如果不治療會導(dǎo)致牙髓死亡甚至牙髓組織壞死［2］。目前，較為有效的治療IP方案是重要牙髓療法（important endodontic therapy，VPT），但也只能在一定程度上維持牙齒的健康和完整性［3-4］。研究顯示，IP與炎癥、氧化應(yīng)激以及牙髓組織細(xì)胞凋亡等相關(guān)［5］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡，但其作用機制不明。金合歡素（acacetin，ACE）具有抗癌和抗炎等生物活性，能抑制LPS誘導(dǎo)的IP［6-7］。有研究認(rèn)為，ACE可通過降低高遷移率族蛋白1（high mobility histone 1，HMGB1）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）等蛋白的表達(dá)，抑制HMGB1/TLR4通路的激活，達(dá)到抑制IP牙髓細(xì)胞活力并誘導(dǎo)其凋亡的作用［8］。本研究以牙髓組織分離培養(yǎng)的原代牙髓細(xì)胞（DPSCs）為研究對象，旨在探究ACE是否通過調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4信號通路對LPS誘導(dǎo)的DPSCs凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 無菌條件下，取2021年3月—2021年6月于唐山市婦幼保健院口腔科進(jìn)行正畸、阻生拔除的5例患者（年齡19～30歲）的健康牙齒。LPS購自MeRck公司；基質(zhì)細(xì)胞表面抗原1（STRO1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、HMGB1、TLR4、胱天蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-7、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）購自英國Abcam公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、基質(zhì)膠、CCK-8測定試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）、蛋白抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；倒置激光共聚焦顯微鏡（型號：VK-X3000）購自KEYENCE；垂直電泳儀（型號：CriterionTM）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、化學(xué)發(fā)光成像儀（型號：ChemiDoc）購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀（型號：Varioskan LUX）購自美國Thermo Fisher公司。本研究經(jīng)唐山市婦幼保健院倫理委員會審批（202212025）。

1.2 研究方法

1.2.1 DPSCs分離 用含100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的PBS沖洗牙髓組織并剪成碎塊，加膠原酶I，37 ℃水浴消化1 h，無菌吸管吸打至完全消化；加完全培養(yǎng)基終止消化，" " " 1 000 r/min、10 min/次多次離心以去除消化酶，接種至25 T瓶中培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 免疫熒光鑒定分離的DPSCs 將分離第三代對數(shù)生長期DPSCs接種于6孔板中，PBS浸洗1遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗1遍，TritonX-100通透15 min，PBS浸洗1遍，山羊血清封閉30 min，一抗STRO1（1∶500）4 ℃孵育過夜，加熒光二抗（1∶500）室溫孵育1 h（以下操作均避光），PBS浸洗1遍，DAPI復(fù)染核，封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 DPSCs表皮抗原鑒定 選取對數(shù)生長期的DPSCs，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL，加適量抗體CD90、CD105、CD34、CD45，陰性對照IgG，4 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測STRO1陽性表達(dá)情況以及IgG、CD90、CD105、CD34、CD45陽性率［9］。

1.2.4 CCK-8法檢測DPSCs活力 參照文獻(xiàn)［10］，用1 ng/L LPS誘導(dǎo)DPSCs建立細(xì)胞炎癥模型，以每孔3 000個細(xì)胞接種于96孔板。細(xì)胞貼壁生長時加入濃度分別為0、5、10、20、40、80 μmol/L的ACE［11］，培養(yǎng)24 h后，加10 μL CCK-8溶液，4 h避光培養(yǎng)，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度（OD）值，選擇對細(xì)胞存活率增加幅度較大的濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.5 細(xì)胞分組 DPSCs按干預(yù)方式分為Control組（0 μmol/L ACE培養(yǎng)）、LPS組（1 ng/L LPS處理）、L-ACE組（LPS組基礎(chǔ)上加20 μmol/L ACE）、H-ACE組（LPS組基礎(chǔ)上加40 μmol/L ACE）、pcDNA-NC組（H-ACE組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染pcDNA-NC質(zhì)粒）、HMGB組（H-ACE組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染pcDNA-HMGB）。

1.2.6 CCK-8和克隆形成實驗檢測各組細(xì)胞增殖情況 CCK-8實驗：取1.2.5各組細(xì)胞懸液加入96孔板中培養(yǎng)，加入10 μL CCK-8液孵育培養(yǎng)1 h，在450 nm處檢測培養(yǎng)24、48、72 h的OD值?？寺⌒纬蓪嶒灒涸?孔板中加入各組細(xì)胞（500個/孔），培養(yǎng)10 d，每3 d換1次培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍攝計數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率 收集并處理各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，避光取195 μL細(xì)胞懸液于EP管，加入5 μL Annexin V-FITC，室溫孵育10 min，Binding Buffer清洗，加入20 ng/L的碘化丙啶5 μL，混勻并避光孵育10 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.8 Western blot法檢測相關(guān)通路蛋白 收集各組細(xì)胞，" 5 000 r/min離心10 min提取蛋白，BCA蛋白定量，上樣，轉(zhuǎn)印，封閉，PBS漂洗。一抗HMGB1（1∶5 000）、TLR4（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Caspase-7（1∶500）、Bax（1∶5 000）、Bcl-2（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）。4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯影儀ECL發(fā)光顯色。

1.2.9 ELISA檢測IL-1β、IL-4、TNF-α含量 收集各組細(xì)胞上清液，避免反復(fù)凍融，按照ELISA試劑盒實驗步驟操作，先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀在450 nm處波長檢測細(xì)胞上清中IL-1β、IL-4、TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用[[x] ±s]表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPSCs形態(tài)及表皮抗原鑒定 細(xì)胞呈三角形、多角形或長梭形，由中心向四周不規(guī)則放射排列，見圖1。STRO1陽性表達(dá)的呈現(xiàn)紅色熒光，見圖2。IgG、CD90、CD105、CD34、CD45陽性率（%）分別為0、99.63±0.35、99.74±0.24、1.03±0.04、0.07±0.01，證實細(xì)胞有較好的增殖和分化能力，原代培養(yǎng)克隆純化的為DPSCs，濃度和純度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，可用于后續(xù)實驗。

2.2 ACE對LPS誘導(dǎo)的DPSCs活力影響 與0 μmol/L ACE培養(yǎng)細(xì)胞比較，5、10、20、40、80 μmol/L ACE處理使LPS誘導(dǎo)的DPSCs存活率上升，其中20、40 μmol/L ACE處理時細(xì)胞存活率增加幅度較大，選定20、40 μmol/L ACE為后續(xù)實驗所用濃度。見圖3。

2.3 各組細(xì)胞增殖情況比較 與Control組比較，LPS組細(xì)胞增殖活力、克隆數(shù)降低（P＜0.05）；與LPS組比較，L-ACE組、H-ACE組細(xì)胞增殖活力、克隆細(xì)胞數(shù)依次升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC組和H-ACE組比較，HMGB組的細(xì)胞增殖活力、克隆數(shù)降低（P＜0.05）。見表1、圖4。

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 與Control比較，LPS組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與LPS組比較，L-ACE組、H-ACE組細(xì)胞凋亡率依次降低（P＜0.05）；與pcDNA-NC組和H-ACE組比較，HMGB組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖5、6。

2.5 各組細(xì)胞中HMGB1/TLR4通路和凋亡蛋白表達(dá)情況 與Control組比較，LPS組HMGB1、TLR4、Bax、Caspase-3、Caspase-7的蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與LPS組比較，L-ACE組、H-ACE組HMGB1、TLR4、Caspase-3、Caspase-7、Bax的蛋白表達(dá)依次降低，Bcl-2依次升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC組和H-ACE組比較，HMGB組HMGB1、TLR4、Caspase-3、Caspase-7、Bax的蛋白表達(dá)升高，Bcl-2降低（P＜0.05），見表2、圖7。

2.6 各組細(xì)胞上清液炎癥相關(guān)因子含量比較 與Control組比較，LPS組細(xì)胞上清液IL-1β、TNF-α含量增加，IL-4含量減少（P＜0.05）；與LPS組比較，L-ACE組、H-ACE組IL-1β、TNF-α含量依次減少，IL-4含量依次增多（P＜0.05）；與pcDNA-NC組和H-ACE組比較，HMGB組IL-1β、TNF-α含量增加，IL-4含量減少（P＜0.05）。見表3。

3 討論

IP治療不及時容易導(dǎo)致牙髓壞死，引起根尖牙周炎，常伴有牙齦疼痛和功能受限，導(dǎo)致身體和心理不適，產(chǎn)生心理障礙、社交障礙等。Wang等［12］研究表明，LPS是牙髓炎的重要誘因，能夠誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞中炎性因子和黏附因子上調(diào)，誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡。Wang等［13］研究表明，LPS誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，抑制牙髓細(xì)胞活力，上調(diào)NUTM2A-AS1基因和HMGB1蛋白的表達(dá)；而HMGB1的過表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。本研究結(jié)果亦顯示，與誘導(dǎo)前比較，LPS誘導(dǎo)后可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加促炎因子的產(chǎn)生，表明LPS可誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡和炎癥，提示降低LPS可抑制牙髓細(xì)胞凋亡和炎癥，有效治愈牙髓炎。

ACE是一種天然膳食類黃酮，常從金合歡樹和柑橘類水果中提取，具有抗炎作用。Wang等［14］研究表明，ACE能抑制氧化叔丁基誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)（COX-2、iNOS）的產(chǎn)生和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，通過激活Nrf2通路來緩解髓核細(xì)胞炎癥并促進(jìn)基質(zhì)降解，進(jìn)而改善體內(nèi)椎間盤變形。ACE能通過介導(dǎo)線粒體自噬實現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的［15］。Ren等［16］研究表明，ACE能通過抑制炎癥和調(diào)節(jié)腸道微生物群來減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。本研究結(jié)果顯示，ACE處理LPS誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞可導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-7、Bax表達(dá)降低，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)升高，抑制細(xì)胞凋亡及促炎因子IL-1β和TNF-α表達(dá)，增加抗炎因子IL-4的表達(dá)，提示ACE尤其是高濃度ACE對抑制細(xì)胞凋亡和炎癥發(fā)展具有一定作用，有望成為牙髓炎的治療藥物。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，存在于所有細(xì)胞類型中，當(dāng)過量的HMGB1釋放到細(xì)胞外時，HMGB1與IL-1β等促炎因子結(jié)合，形成的復(fù)合物與HMGB1同源受體（TLR4和RAGE）協(xié)同作用，從而引起炎癥反應(yīng)［17］。Li等［18］研究表明，胃癌（GC）細(xì)胞產(chǎn)生缺氧微環(huán)境，募集中性粒細(xì)胞并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NET）形成，抑制HMGB1/TLR4/p38 MAPK通路消除了缺氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化和NET形成，從而可誘導(dǎo)GC細(xì)胞侵襲和遷移。miR-216a-5p能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型中的炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，還可通過抑制HMGB1/TLR4/核因子kB（NF-kB）通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥來緩解超敏反應(yīng)［19］。Li等［20］研究表明，山楂酸可通過抑制HMGB1/TLR4通路抑制炎癥和細(xì)胞凋亡來緩解心肌缺血/再灌注。過表達(dá)HMGB1可逆轉(zhuǎn)miR-129-5p的抗細(xì)胞凋亡和抗炎作用，抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)的表達(dá)和激活，有效抑制小鼠細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，從而緩解小鼠的脊髓損傷［9］。本研究結(jié)果亦顯示，ACE處理有效抑制了LPS誘導(dǎo)的炎癥，使HMGB1、TLR4、Caspase-3、Caspase-7、Bax蛋白，IL-1β、TNF-α因子表達(dá)下降；HMGB組HMGB1、TLR4、Caspase-3、Caspase-7、Bax蛋白，IL-1β、TNF-α因子表達(dá)上升，炎癥反應(yīng)加重，證實了ACE可能通過調(diào)控HMGB1/TLR4通路有效抑制LPS誘導(dǎo)的DPSCs凋亡。

綜上所述，ACE可能通過抑制HMGB1/TLR4通路活化實現(xiàn)抑制LPS誘導(dǎo)的DPSCs凋亡，ACE有可能成為治療牙髓炎癥的有效藥物。后續(xù)將建立動物模型深入研究HMGB1/TLR4通路的作用機制，以期為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

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（2024-06-06收稿 2024-07-26修回）

（本文編輯 陸榮展）