連翹苷對銅綠假單胞菌黏附功能及生物被膜形成能力的影響

王業(yè)梅，程惠娟

(安徽中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥 230038)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是常見的院內(nèi)感染的條件致病菌，被世界衛(wèi)生組織公認(rèn)為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，該菌在感染機(jī)體過程中常以生物被膜方式生長，以此來阻隔抗生素的攻擊［1］，一旦形成生物被膜，細(xì)菌將具有極強(qiáng)的抗生素耐藥性和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的能力［2］。鑒于此，目前國內(nèi)外很多學(xué)者以生物被膜為研究對象進(jìn)行新型抗菌藥物的研究。課題組前期研究證實(shí)穿心蓮內(nèi)酯、黃芩苷、沒食子酸、魚腥草素鈉等中藥有效成分可抑制某些細(xì)菌生物被膜形成，并對已形成的生物被膜有明顯的破壞作用［3-5］。但中藥連翹的有效成分連翹苷對銅綠假單胞菌生物被膜是否能發(fā)揮作用尚未見報(bào)道，本研究采用體外建立生物被膜模型，觀察連翹苷對銅綠假單胞菌生物被膜的作用，為中藥治療銅綠假單胞菌生物被膜相關(guān)感染提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物、菌株與培養(yǎng)基 連翹苷對照品(批號(hào)ZB2012060523，純度 98%)、紅霉素品(批號(hào) 30307-200716，純度93.5%)、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATcc27853均購于中國藥品生物制品檢定所，PBS(實(shí)驗(yàn)室自配)，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB:青島高科海博生物技術(shù)有限公司)，結(jié)晶紫(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.2 試劑與儀器 96孔微量培養(yǎng)板(美國Corning公司)，318-酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司)，QYC系列全溫空氣搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，Sirion200型掃描電鏡(FEI公司)。

2 方法

2.1 連翹苷對銅綠假單胞菌最低抑菌濃度(MIC)的檢測 按文獻(xiàn)［6］采用微量稀釋法，將濁度為0.5麥?zhǔn)系木?00μL加入到事先加入了2倍稀釋濃度藥物的96孔板，37℃培養(yǎng)24 h，以無菌生長的最小藥物稀釋度為MIC。

2.2 連翹苷對銅綠假單胞菌早期黏附性影響的檢測 按文獻(xiàn)［4，7］并改進(jìn)將濁度為0.5麥?zhǔn)系木?00μL接種于96孔板中，37℃分別培養(yǎng)2、4、6 h。吸棄培養(yǎng)基及未黏附菌，PBS清洗3次，分別加入以培養(yǎng)基10倍連續(xù)稀釋(1000，100，10 mg/L)的連翹苷和紅霉素(每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，共6個(gè)96孔板)，繼續(xù)37℃培養(yǎng)24 h。吸棄藥物與懸浮菌，PBS清洗3次，待自干，0.4%結(jié)晶紫染色20 min，吸棄結(jié)晶紫，PBS清洗5次，95%酒精脫色，靜置15 min后于650 nm處測其A值。另設(shè)陰性對照孔(只加細(xì)菌)。

2.3 連翹苷對銅綠假單胞菌的生物膜最小抑膜濃度(SMIC)的測定 按文獻(xiàn) ［4，7］將濁度為0.5麥?zhǔn)系木?00μL接種入96孔板中，37℃培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基與懸浮菌，PBS清洗3次，分別加入以培養(yǎng)基對倍稀釋(1024、512、256、128、64、32 mg/L)的連翹苷和紅霉素(每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，共6個(gè)96孔板)，再于37℃培養(yǎng)24 h，結(jié)晶紫染色法于650 nm處測其A值。另設(shè)陰性對照孔(只加細(xì)菌)。

2.4 連翹苷對銅綠假單胞菌生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響［5，8］取培養(yǎng)皿6個(gè)，先加入濁度為0.5麥?zhǔn)系木杭芭囵B(yǎng)基，同時(shí)將預(yù)先滅菌的蓋玻片浸入其中，培養(yǎng)3 d，使之形成初步生物被膜，再分別以培養(yǎng)基10倍連續(xù)稀釋(1000、100、10 mg/L)的連翹苷和紅霉素為給藥質(zhì)量濃度，對各模型分別作用6 d(每48 h換1次藥液)，用銀染法電鏡觀察各組的形態(tài)。另設(shè)陰性對照組(只加細(xì)菌)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 for Windows軟件處理。采用方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 對銅綠假單胞菌的浮游菌MIC及黏附功能的影響連翹苷和紅霉素對銅綠假單胞菌的 MIC分別為512、32 mg/L。與陰性對照組相比，1000 mg/L的連翹苷在2、4、6 h對銅綠假單胞菌的黏附均有明顯抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。100 mg/L的連翹苷對2、4 h的銅綠假單胞菌的黏附有抑制作用(P＜0.05)，而對6 h的黏附無明顯抑制作用，100、1000 mg/L紅霉素在2、4、6 h能明顯抑制銅綠假單胞菌的黏附(見圖1，2)。

圖1 不同質(zhì)量濃度連翹苷對銅綠假單胞菌黏附性的影響(n=8，)

3.2 對銅綠假單胞菌生物被膜菌SMIC 連翹苷對銅綠假單胞菌生物被膜菌的SMIC50(與陰性對照相比，抑制生物被膜菌活性50%的藥物質(zhì)量濃度)為256 mg/L，SMIC80(與陰性對照相比，抑制生物被膜菌活性80%的藥物質(zhì)量濃度)為1024 mg/L。紅霉素對銅綠假單胞菌生物被膜SMIC50與SMIC80分別為256、128 mg/L(見圖3，圖4)。

圖2 不同質(zhì)量濃度紅霉素對銅綠假單胞黏附性的影響(n=8，)

圖3 不同質(zhì)量濃度連翹苷對銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響(n=8，)

圖4 不同質(zhì)量濃度紅霉素對銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響(n=8，)

3.3 鏡下觀察連翹苷對銅綠假單胞菌生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 掃描電鏡下對照組圖5A顯示TSB培養(yǎng)3 d時(shí)生物被膜初步形成，圖5B顯示TSB培養(yǎng)7 d時(shí)生物被膜發(fā)育成熟。與對照組相比，在100 mg/L連翹苷和紅霉素的分別作用下，生物被膜被破壞，但仍可見較多細(xì)菌聚集在一起(圖5C為連翹苷，圖5D為紅霉素);而在1000 mg/L連翹苷的作用下，生物被膜被破壞的較為徹底，只可見少數(shù)細(xì)菌聚集及散落的單個(gè)細(xì)菌(圖5E)，在1000 mg/L紅霉素作用下生物被膜被破壞的更為徹底(圖5F)。

4 討論

生物被膜是一個(gè)微生物聚集群體，是微生物不可逆地與生物或非生物組織表面接觸后由自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)包裹著活菌細(xì)胞形成的微生態(tài)，是微生物在生長過程中為了適應(yīng)生存環(huán)境而形成的相對于單個(gè)分散浮游狀態(tài)菌細(xì)胞而言的另一種獨(dú)特的微生物生存方式［1-2］。生物被膜相關(guān)感染已成為基礎(chǔ)和臨床研究必須直面的一個(gè)重要問題。連翹為木犀科落葉灌木植物連翹 Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的果實(shí)，味苦，性微寒，有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、消癰散結(jié)、強(qiáng)心利尿和降血壓、止嘔等功效［9］。連翹苷是連翹的有效成分之一。研究表明，連翹苷具有抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)非特異性免疫功能和破壞表皮葡萄球菌生物膜的作用［10-12］。但連翹苷對銅綠假單胞菌生物膜的作用未見報(bào)道。

圖5 鍍銀染色法不同作用條件下細(xì)菌生長狀況(×20000)

本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株，SMIC測定中使用的結(jié)晶紫染色法，在不破壞生物被膜結(jié)構(gòu)的條件下能檢測出生物被膜中菌細(xì)胞的活性。有報(bào)道證實(shí)［13］紅霉素體外對細(xì)菌生物被膜具有較好的抑制作用，故本實(shí)驗(yàn)采用做為對照，證實(shí)實(shí)驗(yàn)方法正確有效。結(jié)果表明，連翹苷對銅綠假單胞菌 MIC為 512 mg/L，SMIC50與 SMIC80分別為 256、1024 mg/L。細(xì)菌生物被膜的形成要經(jīng)過菌細(xì)胞黏附、微菌落形成、微菌落融合、生物被膜成熟、菌細(xì)胞從生物被膜中釋放出來等5個(gè)階段［14］，由此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了多個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)來研究;其中初始的黏附對生物被膜的形成來說尤其重要，因此又設(shè)計(jì)了早期黏附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1000 mg/L的連翹苷在2、4、6 h對銅綠假單胞菌的黏附均有明顯抑制作用，100 mg/L在2、4 h也顯示抑制作用，提示連翹苷可以部分干預(yù)該菌生物被膜早期的發(fā)育。電子顯微下觀察，對照組TSB培養(yǎng)3 d時(shí)生物被膜已初步形成，鏡下可見大量的細(xì)菌聚集在一起，部分被分泌物包裹，但細(xì)菌的形態(tài)依然可見，而培養(yǎng)7 d時(shí)生物被膜已發(fā)育成熟，呈團(tuán)狀聚集，由于其外包裹大量細(xì)菌分泌的基質(zhì)物，其內(nèi)細(xì)菌形態(tài)并不清楚。與對照組相比，100 mg/L與1000 mg/L連翹苷均可明顯干預(yù)銅綠假單胞菌生物被膜的發(fā)育，并且隨著藥物濃度的增加，對該菌生物被膜的發(fā)育的抑制作用有增強(qiáng)趨勢。以上結(jié)果表明連翹苷對銅綠假單胞菌生物被膜的形成及已形成的生物被膜均有一定的抑制作用。

文獻(xiàn)［15］報(bào)道金絲桃屬植物提取物具有抗銅綠假單胞菌生物被膜的功能。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)連翹苷也有類似的作用，而抗菌藥物易產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)眾所周知，因而中藥及有效成分可望成為抗生物被膜藥物研究的新方向。

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