酶法輔助提取北蒼術(shù)揮發(fā)油的工藝及成分分析

孟利娜， 于 敬， 許 靜， 南 楠， 周 晶

(天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070)

北蒼術(shù)為菊科植物北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC．)Koidz．的干燥根莖［1］，為《中國(guó)藥典》2010年版收載的蒼術(shù)藥材之一。其性味辛、苦、溫，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾、燥濕、解郁、辟穢之功效［2］。現(xiàn)代藥理研究表明，蒼術(shù)揮發(fā)油具有抗?jié)儭⒖剐穆适С?、降血壓、利尿、保肝、抗菌等作用?］。因此，簡(jiǎn)便而有效的獲取蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)充分利用蒼術(shù)藥材具有重要的實(shí)用價(jià)值。

目前蒼術(shù)揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾法［4］，超臨界 CO2萃取法［5］，同時(shí)蒸餾萃取法［6］，頂空固相微萃取法［7］等。上述方法中有的揮發(fā)油提取率較低，有的需要特定的設(shè)備，目前實(shí)施于生產(chǎn)中仍有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)采用酶法處理藥材，結(jié)合直接蒸餾法提取北蒼術(shù)揮發(fā)油，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到最佳的酶解提取工藝，該條件下，不需要特殊的儀器設(shè)備即可以顯著地提高蒼術(shù)油的提取率。為生產(chǎn)中充分利用蒼術(shù)藥材資源及工業(yè)化生產(chǎn)推廣提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (安捷倫公司7890A-5975C型)，Agilent 190915-433 HP-5色譜柱:(30 m ×250 μm ×0.25μm);84-1磁力攪拌控溫電熱套 (華魯電熱公司);電子分析天平 (FA2004N)，PHS-25型精密酸度計(jì)(杭州亞美電子儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋 (北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)。

1.2 材料 酶 (活力單位5000 U/g)購(gòu)自天津利華酶制品廠 (批號(hào):11-08-30);北蒼術(shù) (河北安國(guó)市同利中藥材有限公司提供，由天津醫(yī)科大學(xué)生藥教研室周曄教授鑒定)，符合《中國(guó)藥典》2010版 (一部)要求;檸檬酸、檸檬酸鈉、無(wú)水乙醚 (分析純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司);無(wú)水硫酸鈉 (化學(xué)純，天津市塘沽鄧中化工廠);正己烷 (色譜純，天津康科德試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 水蒸氣蒸餾法提取 精密稱取40目北蒼術(shù)50 g，置于1 000 m L的圓底燒瓶中，加入12倍量蒸餾水，按《中國(guó)藥典》2010年版［1］項(xiàng)下的揮發(fā)油提取法提取4 h，所得揮發(fā)油經(jīng)乙醚萃取，無(wú)水硫酸鈉脫水，吸取乙醚溶液，揮干乙醚，得氣味芳香的棕紅色油狀物，精密稱取揮發(fā)油質(zhì)量。

2.2 酶法輔助提取蒼術(shù)油的單因素條件篩選

2.2.1 酶種類(lèi)的選擇 精密稱取40目北蒼術(shù)50 g，分別加入藥材質(zhì)量1.0%的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶，各溶于12倍量 pH4.5的檸檬酸緩沖液中，40℃條件下酶解1 h后，按照《中國(guó)藥典》(2010版)項(xiàng)下的揮發(fā)油提取法提取4 h，以下操作同2.1項(xiàng)下，結(jié)果顯示，由半纖維素酶處理的藥材，其揮發(fā)油的提取量最高，因此選用半纖維素酶進(jìn)行下列酶解工藝的條件篩選。

2.2.2 酶用量對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)率的影響 精密稱取40目北蒼術(shù)50 g，依據(jù)2.2.1項(xiàng)結(jié)果，分別加入相當(dāng)于藥材質(zhì)量的0、0.5%、1%、1.5%、2.0%、3.0% 的半纖維素酶，各溶于12倍量pH4.5的檸檬酸緩沖液中，40℃條件下酶解1 h后，以下操作同2.1項(xiàng)下，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)酶用量小于1%時(shí)，隨著酶用量的增加，揮發(fā)油產(chǎn)率升高，當(dāng)酶用量達(dá)到1%后，產(chǎn)率稍有下降且趨于平穩(wěn)，以酶用量為藥材質(zhì)量1%較好。

圖1 酶用量對(duì)揮發(fā)油提取量的影響

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)率的影響 精密稱取40目北蒼術(shù)50 g，依據(jù)2.2.2項(xiàng)結(jié)果，加入藥材質(zhì)量1%的半纖維素酶，以下操作同2.1項(xiàng)下，分別酶解0、0.5、1.0、1.5、2.0、3 h，結(jié)果見(jiàn)圖2，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)油產(chǎn)率也有所提高，當(dāng)酶解時(shí)間為1 h，揮發(fā)油產(chǎn)率最高，隨后揮發(fā)油產(chǎn)率逐漸下降。

2.2.4 酶解pH值對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)率的影響 精密稱取40目北蒼術(shù)50 g，加入藥材質(zhì)量1%的半纖維素酶，以下操作同2.1 項(xiàng)下，分別在pH3.0、4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)酶解1 h，結(jié)果如圖3所示。在pH4.5時(shí)，揮發(fā)油產(chǎn)率最高。pH過(guò)低或過(guò)高時(shí)揮發(fā)油產(chǎn)率都有所降低。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取量的影響

圖3 不同pH對(duì)揮發(fā)油提取量的影響

2.2.5 酶解溫度對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)率的影響 精密稱取40目北蒼術(shù)50 g，加入藥材質(zhì)量1%的半纖維素酶，以下操作同2.1項(xiàng)下，分別在35、40、45、50、55℃條件下酶解1 h。不同酶解溫度對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)率的影響如圖4所示。結(jié)果顯示，45℃時(shí)揮發(fā)油產(chǎn)率最高，而溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)產(chǎn)率都有所下降，其原因可能是溫度過(guò)高使酶失活，溫度過(guò)低又不能充分發(fā)揮酶的活性。

圖4 不同溫度對(duì)揮發(fā)油提取量的影響

2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選工藝條件

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取酶的用量、酶解時(shí)間、酶解溫度以及酶解pH四因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，見(jiàn)表1。

表1 L 9(34)正交試驗(yàn)因素水平

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 精密稱取40目北蒼術(shù)50 g，分別按L9(34)正交設(shè)計(jì)表設(shè)定的條件進(jìn)行酶解后，按照《中國(guó)藥典》2010年版揮發(fā)油項(xiàng)下提取揮發(fā)油，以下操作同2.1項(xiàng)下，以揮發(fā)油提取量為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表3 方差分析

從表2直觀分析，各因素對(duì)北蒼術(shù)揮發(fā)油提取率的影響程度大小為D(酶解溫度) ＞C(酶解pH)＞A(酶用量)＞B(酶解時(shí)間)，初步認(rèn)為工藝條件最佳組合為A2B3C2D2。方差分析結(jié)果表明，其中酶解溫度對(duì)揮發(fā)油提取量具顯著性影響 (P＜0.05)，A、B、C的影響均無(wú)顯著性 (P＞0.05)。綜合分析上述結(jié)果，確定最佳提取工藝條件是:酶用量為藥材的1.0%，在pH4.5，45℃條件下酶解1.0 h。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取40目北蒼術(shù)50g，按優(yōu)選工藝條件進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)做對(duì)照試驗(yàn)，由表4可知，酶解-蒸餾法揮發(fā)油提取量比直接蒸餾法提高20.82%，且重現(xiàn)性好。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 北蒼術(shù)揮發(fā)油成分測(cè)定

2.4.1 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定條件

氣相色譜條件:HP-5彈性石英毛細(xì)管柱 (30 m ×250 mm ×0.25μm)，初始溫度60℃;程序以6℃/min升溫至260℃;氣化室溫度260℃;進(jìn)樣量1.00μL;分流比10∶1;溶劑延遲3 min，載氣為高純氦氣。

質(zhì)譜條件:MS-EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍30～500 u;G1036A NIST2008版標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù)。

2.4.2 定性分析 分別取2.3.3項(xiàng)下直接蒸餾法和酶解輔助蒸餾法提取的揮發(fā)油適量，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定。通過(guò)ChemStation工作站檢索NIST譜圖庫(kù)，再結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工圖譜解析，確認(rèn)其化學(xué)成分。兩種方法提取揮發(fā)油中各主要組分的相對(duì)百分含量見(jiàn)表5。蒸餾法、酶解-蒸餾法提取北蒼術(shù)揮發(fā)油的氣相色譜圖見(jiàn)圖5、圖6。

表5 酶解輔助提取法和SD法提取北蒼術(shù)揮發(fā)油的化學(xué)成分及其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖5 直接蒸餾法提取北蒼術(shù)揮發(fā)油GC圖

圖6 酶解輔助提取北蒼術(shù)揮發(fā)油GC圖

圖5和圖6表明，蒸餾法和酶解輔助蒸餾法提取的北蒼術(shù)揮發(fā)油氣相色譜圖整體相同，各物質(zhì)的保留時(shí)間主要集中在9～15 min。由表5可知揮發(fā)油的主要成分為蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮、β-桉葉醇和B-香葉烯，酶解后蒼術(shù)酮和β-桉葉醇的百分含量明顯提高。

3 討論

2010 年版《中國(guó)藥典》中揮發(fā)油的測(cè)定采用直接蒸餾法，本研究采用酶解-蒸餾法提取蒼術(shù)油，其蒼術(shù)油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較《中國(guó)藥典》2010年版法提高了20.82%。這是因?yàn)橹参锛?xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)，選用適當(dāng)?shù)拿?，在合適的條件下，可以使細(xì)胞壁的組織水解，破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，減少細(xì)胞內(nèi)成分溶出的屏障，從而有利于有效成分的溶出。由于半纖維素酶是多種酶的復(fù)合體，由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶等組成，所以，分解植物細(xì)胞壁效果好于單一纖維素酶與果膠酶［8］。酶解輔助提取植物中的活性成分，不僅可以提高有效成分浸出率，且不需要特定的設(shè)備，易于實(shí)施，成本較低，為北蒼術(shù)揮發(fā)油的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

有研究表明，β-桉葉醇能夠促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)［9］，抗缺氧［10］，通過(guò)降低重復(fù)性刺激引起的乙酰膽堿的再生釋放對(duì)抗新斯的明誘導(dǎo)的神經(jīng)肌肉障礙［11］等;蒼術(shù)酮具有細(xì)胞毒性，能抑制肝毒細(xì)胞對(duì)肝組織的破壞作用，修復(fù)肝損傷［12］;也有體外實(shí)驗(yàn)證明，蒼術(shù)酮在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)對(duì)甲型流感病毒H3N2亞型、高致病性禽流感病毒H5N1亞型和乙型流感病毒株均有殺滅作用［13］。本研究通過(guò)酶解輔助提取較直接蒸餾法提取蒼術(shù)揮發(fā)油，其油中的活性成分蒼術(shù)酮和β-桉葉醇的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高32.79%和34.61%，為提高蒼術(shù)藥材的臨床應(yīng)用效果、減小劑量提供借鑒。

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