兒童肺炎支原體感染核酸與四種血清學(xué)抗體檢測方法比較

摘要：目的" 比較核酸及四種血清學(xué)抗體檢測方法在肺炎支原體感染診斷中的應(yīng)用價值。方法" 收集淄博市第一醫(yī)院2021年11月10日-12月22日收治的呼吸道感染患兒159例，分別采集咽拭子和血清樣本，咽拭子樣本應(yīng)用PCR法檢測肺炎支原體核酸，血清樣本分別用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法、間接免疫熒光法和被動凝集法檢測肺炎支原體IgM抗體。比較5種檢測方法的靈敏度、特異度以及與臨床診斷方法的一致性，分析核酸法與血清學(xué)方法的一致性，另通過顆粒凝集方法比較4種血清學(xué)抗體檢測的一致性。最后，比較不同病程間5種檢測方法的檢出率。結(jié)果" 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，確診MP感染127例，非MP感染32例。DNA檢測與臨床診斷一致性較好。4種血清學(xué)方法中CLIA靈敏度及特異性均高于ELISA；IFA檢測靈敏度較好，但特異性較差；PA靈敏度和特異性取決于判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中PA抗體滴度≥1∶160為判斷標(biāo)準(zhǔn)時，其檢測靈敏度最低，特異性最高。4種血清學(xué)檢測與DNA檢測的一致性較差，其中FA與DNA檢測的一致性處于微弱程度，其余3種方法學(xué)與DNA檢測的一致性處于弱程度。不同滴度的PA陽性標(biāo)本中，隨著PA抗體滴度升高，ELISA和CLIA檢出率逐步升高，與PA相關(guān)性較好，但PA與IFA相關(guān)性較差。DNA檢出率隨發(fā)病天數(shù)增多呈下降趨勢，血清學(xué)檢出率隨發(fā)病天數(shù)增多呈先升后降趨勢。結(jié)論" 核酸法檢測肺炎支原體的靈敏度和特異性高，病程早期其靈敏度優(yōu)于血清學(xué)檢測，而在病程中后期間免疫熒光法優(yōu)于核酸法，兩種方法學(xué)可相互補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞：肺炎支原體；核酸法；磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法；酶聯(lián)免疫法；間接免疫熒光法；被動凝集法

中圖分類號：R725.6" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " nbsp; "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.18.036

文章編號：1006-1959（2024）18-0166-04

Abstract：Objective" To compare the application value of nucleic acid and four serological antibody detection methods in the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection.Methods" A total of 159 children with respiratory tract infection admitted to Zibo First Hospital from November 10 to December 22， 2021 were collected. Throat swabs and serum samples were collected respectively. Throat swab samples were detected by PCR for Mycoplasma pneumoniae nucleic acid. Serum samples were detected by chemiluminescence immunoassay method， enzyme-linked immunosorbent assay， indirect immunofluorescence method and passive agglutination method for Mycoplasma pneumoniae IgM antibody. The sensitivity， specificity and consistency with clinical diagnostic methods of the five detection methods were compared. The consistency between nucleic acid method and serological method was analyzed. The consistency of the four serological antibody detections was compared by particle agglutination method. Finally， the detection rates of the five detection methods were compared among different course of disease.Results" With clinical diagnosis as the standard， 127 cases of MP infection and 32 cases of non-MP infection were diagnosed. The consistency between DNA detection and clinical diagnosis was good. The sensitivity and specificity of CLIA were higher than those of ELISA. The sensitivity of IFA was good， but the specificity was poor. The sensitivity and specificity of PA depended on the criteria. When the titer of PA antibody ≥1∶160 was the criterion， the detection sensitivity was the lowest and the specificity was the highest. The consistency between the four serological tests and DNA detection was poor， among which the consistency between FA and DNA detection was weak， and the consistency between the other three methods and DNA detection was weak. In PA positive samples with different titers， the detection rates of ELISA and CLIA gradually increased with the increase of PA antibody titers， and the correlation with PA was good， but the correlation between PA and IFA was poor. The detection rate of DNA decreased with the increase of the number of days of onset， and the serological detection rate increased first and then decreased with the increase of the number of days of onset.Conclusion" The sensitivity and specificity of nucleic acid method in the detection of Mycoplasma pneumoniae are high， the sensitivity is better than that of serological detection in the early stage of the disease， while the indirect immunofluorescence method is better than the nucleic acid method in the middle and later stages of the disease， the two methods can complement each other.

Key words：Mycoplasma pneumoniae;Nucleic acid method;Chemiluminescence immunoassay method;Enzyme-linked immunosorbent assay;Indirect immunofluorescence method;Passive agglutination method

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）大小介于細(xì)菌和病毒之間，經(jīng)飛沫傳播，是引起兒童無癥狀性、輕度或少數(shù)嚴(yán)重上呼吸道和下呼吸道感染的常見病原體。據(jù)報道[1-3]，肺炎支原體感染占所有兒童肺炎病例的10%～40%?；純焊腥綧P后的臨床癥狀與其他呼吸道感染癥狀極其相似，難以區(qū)分。實驗室常見檢測方法有分離培養(yǎng)、抗原檢測、分子檢測和血清學(xué)檢測?！秲和窝字гw呼吸道感染實驗室診斷中國專家共識》[4]中推薦的一級方法是核酸RNA檢測和血清學(xué)抗體檢測。目前臨床實驗室開展的血清學(xué)抗體檢測方法有被動凝集法（passive agglutination， PA）、酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）、間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay， IFA）和磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法（chemiluminescence immunoassay， CLIA）。本研究應(yīng)用核酸（DNA檢測）和四種血清學(xué)方法檢測兒童呼吸道感染患者M(jìn)P感染狀況，對方法學(xué)進(jìn)行比較，探討不同檢測方法在MP感染中的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料" 選取淄博市第一醫(yī)院2021年11月10日-12月22日收治的呼吸道感染患兒159例。納入標(biāo)準(zhǔn)：就診患兒主要臨床特征為發(fā)熱、干咳、咽喉腫痛；入院后采用5種方法檢測MP；病史信息完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：自身免疫性疾病、重要臟器功能受損、先天畸形等。本研究通過淄博市第一醫(yī)院倫理委員會審核，患兒監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 DNA檢測" 應(yīng)用上海之江生物肺炎支原體及肺炎衣原體核酸聯(lián)合檢測試劑盒，采用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，F(xiàn)AM熒光通道檢測肺炎支原體，Ct值≤38判斷為陽性。

1.2.2 PA" 應(yīng)用賽樂迪亞-麥克Ⅱ肺炎支原體抗體檢測試劑盒，日本富士瑞必歐株式會社生產(chǎn)。說明書推薦抗體效價＞40判定為陽性。根據(jù)《兒童肺炎支原體呼吸道感染實驗室診斷中國專家共識》，以抗體效價≥160判為急性感染。

1.2.3 ELISA" 應(yīng)用肺炎支原體抗體IgM檢測試劑盒，以色列Savyon Diagnostics公司生產(chǎn)。采用間接法檢測血清中的IgM抗體，樣本濃度值＞20 BU/ml判定為陽性，＜10 BU/ml判定為陰性，10～20 BU/ml判為臨界值，本研究中將臨界值結(jié)果按照陽性統(tǒng)計。

1.2.4 IFA" 應(yīng)用呼吸道病原體譜抗體IgM檢測試劑盒，歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司生產(chǎn)。抗肺炎支原體抗體陽性，主要在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)產(chǎn)生顆粒到粗的滴狀熒光。

1.2.5 CLIA" 應(yīng)用肺炎支原體抗體IgM檢測試劑盒，采用安圖生物全自動免疫檢驗分析儀AutoLumo A2000檢測。采用間接法檢測血清中的IgM抗體，S/CO值≥1.0判定為陽性，＜1.0判定為陰性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法" 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。方法間的一致性用Kappa值表示，Kappa值＜0表示一致性強(qiáng)度極差，0～0.2表示一致性微弱，0.21～0.40表示一致性弱，0.41～0.60表示一致性中等，0.61～0.8表示一致性較好，＞0.81表示幾乎完全一致。4種血清學(xué)之間的相關(guān)性及5種方法學(xué)和病程的關(guān)系使用GraphPad Prism 8作圖。

2結(jié)果

2.1臨床資料統(tǒng)計" 選取呼吸道感染患兒159例，確診MP感染127例，非MP感染32例。其中，男86例，女73例；年齡7個月～12歲，平均年齡（6.18±2.65）歲；發(fā)病0～7 d 124例，發(fā)病8～14 d 25例，發(fā)病15～30 d 10例。所有患者入院時分別采集1份咽拭子和1份血清樣本，樣本采集及保存嚴(yán)格按照廠家試劑說明書要求執(zhí)行。

2.2核酸及4種血清學(xué)方法靈敏度、特異性比較及一致性分析" DNA檢測與臨床診斷一致性較好。4種血清學(xué)方法中CLIA靈敏度及特異性均高于ELISA；IFA檢測靈敏度較好，但特異性較差；PA靈敏度和特異性取決于判斷標(biāo)準(zhǔn)，PA抗體滴度≥1∶160為判斷標(biāo)準(zhǔn)時其檢測靈敏度最低，特異性最高，見表1。

2.3核酸與4種血清學(xué)方法檢測結(jié)果一致性比較" 4種血清學(xué)檢測與DNA檢測的一致性較差，其中FA與DNA檢測的一致性處于微弱程度，其余3種方法學(xué)與DNA檢測的一致性處于弱程度，見表2。不同滴度的PA陽性標(biāo)本中，隨著PA抗體滴度升高，ELISA和CLIA檢出率逐步升高，與PA相關(guān)性較好，但PA與IFA相關(guān)性較差，見表3。

2.4核酸與4種血清學(xué)方法與病程的關(guān)系" DNA檢測檢出率隨發(fā)病天數(shù)增多呈下降趨勢，4種血清學(xué)檢出率隨發(fā)病天數(shù)增多呈先升后降趨勢，見表4。

3討論

肺炎支原體感染廣泛存在于世界各地，平時散在性發(fā)病，每隔3～7年出現(xiàn)一次地區(qū)流行，每次流行持續(xù)1～2年[5，6]。近年來，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥MP在全球各地流行的證據(jù)越來越多，對臨床抗菌治療造成一定的影響，部分地區(qū)MP耐藥率甚至高達(dá)100%[7]。重癥和難治性MP肺炎治療挑戰(zhàn)性大，嚴(yán)重者可累及多個系統(tǒng)，危及生命，因此需要早診斷、早治療[8]。MP感染臨床癥狀及體征缺乏特異性，實驗室病原學(xué)診斷是MP感染診斷的關(guān)鍵[4]。

目前的肺炎支原體實驗室診斷方法有分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)需要特定的培養(yǎng)基，耗時耗力，在實驗室并不被常規(guī)使用[9，10]，同時肺炎支原體培養(yǎng)檢測還容易受到其他病原微生物影響[11]。本研究就常用的核酸和血清學(xué)方法對肺炎支原體感染的檢測進(jìn)行比較，以評估其臨床應(yīng)用價值。機(jī)體感染肺炎支原體后，可特異性產(chǎn)生IgA、IgM、IgG類抗體[12]。MP-IgM為支原體肺炎發(fā)病后免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，可作為早期MP感染的診斷指標(biāo)。本研究選擇了4種有代表性的血清學(xué)檢測方法，包括PA、ELISA、CLIA和IFA來檢測血清MP-IgM抗體，結(jié)果顯示4種血清學(xué)方法之間有很高的一致性。MP的DNA檢測法簡單快速，本研究顯示與血清學(xué)方法相比，DNA檢測法與臨床診斷的一致性更好，靈敏度和特異度也高于血清學(xué)檢測，這種差異可能跟樣本的采集時間有關(guān)。肺炎支原體感染后需要經(jīng)過2～3周的潛伏期才出現(xiàn)癥狀[13]，機(jī)體對抗原刺激進(jìn)行免疫應(yīng)答繼而產(chǎn)生抗體需要一個過程，IgM抗體在發(fā)病后1～3周后才會產(chǎn)生[14，15]，故對于病程短于1周的患兒，單純檢測MP-IgM極易漏診，而在出現(xiàn)癥狀后DNA檢測的MP檢出時間會早于血清抗體，因此具有較好的早期診斷價值。DNA檢測與4種血清學(xué)方法之間的一致性較差。隨著發(fā)病時間增加，DNA檢測檢出率下降而抗體檢出率升高，兩種方法學(xué)有互補(bǔ)作用，這一結(jié)果與其他研究結(jié)果相似[16]。本研究有26例臨床診斷肺炎支原體感染樣本DNA檢測漏檢，原因可能跟核酸樣本采集質(zhì)量有關(guān)。本研究中使用的是口咽拭子屬于上呼吸道樣本，其靈敏度低于下呼吸道樣本[17-20]。此外，MP-DNA檢驗結(jié)果不能很好地用于治療效果的評估，在本研究中有4例患者DNA檢測為陽性IgM抗體為陰性，但I(xiàn)gG抗體為陽性，可能與DNA殘留或支原體定植有關(guān)。MP死亡后，其DNA仍可存在于部分患者體內(nèi)，時間達(dá)7周～7個月，且不易降解[21，22]。因此，結(jié)合臨床癥狀分析可能是既往感染肺炎支原體尚未被完全清除。

綜上所述，對于肺炎支原體感染早期的檢測，DNA檢測靈敏度高于IgM抗體，但DNA檢測也存在上呼吸道標(biāo)本陽性率低、對采樣人員要求較高的局限性，從而導(dǎo)致肺炎支原體感染患者漏檢。血清學(xué)IgM抗體檢測方法與DNA聯(lián)合檢測可提高兒童MP的檢出率，為兒童MP早診斷和早治療提供證據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rodriguez N，Mondeja B，Sardi？觡as R，et al.First detection and characterization of macrolide-resistant mycoplasma pneumoniae strains in cuba [J].Int J Infect Dis，2019，80：115-117.

[2]Meyer Sauteur PM，Krautter S，Ambroggio L，et al.Improved diagnostics help to identify clinical features and biomarkers that predict mycoplasma pneumoniae community-acquired pneumonia in children[J].Clin Infect Dis，2020，71（7）：1645-1654.

[3]Xue Y，Wang M，Han H.Interaction between alveolar macrophages and epithelial cells during Mycoplasma pneumoniae infection[J].Front Cell Infect Microbiol，2023，13：1052020.

[4]中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會臨床檢驗學(xué)組.兒童肺炎支原體呼吸道感染實驗室診斷中國專家共識[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2019，42（7）：507-513.

[5]Li F，Kong S，Xie K，et al.High ratio of c-reactive protein/procalcitonin predicts mycoplasma pneumoniae infection among adults hospitalized with community acquired pneumonia [J].Scand J Clin Lab Invest，2021，81（1）：65-71.

[6]Lv YT，Sun XJ，Chen Y，et al.Epidemic characteristics of mycoplasma pneumoniae infection： A retrospective analysis of a single center in suzhou from 2014 to 2020[J].Ann Transl Med，2022，10（20）：1123.

[7]Zhao F，Li J，Liu J，et al.Antimicrobial susceptibility and molecular characteristics of mycoplasma pneumoniae isolates across different regions of china[J].Antimicrob Resist Infect Control，2019，8：143.

[8]Liu J，He R，Wu R，et al.Mycoplasma pneumoniae pneumonia associated thrombosis at beijing children's hospital[J].BMC Infect Dis，2020，20（1）：51.

[9]Waites KB，Xiao L，Liu Y，et al.Mycoplasma pneumoniae from the respiratory tract and beyond[J].Clin Microbiol Rev，2017，30（3）：747-809.

[10]Zhu YG，Tang XD，Lu Y T，et al.Contemporary situation of community-acquired pneumonia in china： A systematic review[J].J Transl Int Med，2018，6（1）：26-31.

[11]白經(jīng)緯.微生物快速培養(yǎng)檢測在小兒肺炎支原體感染中的診斷價值[J].醫(yī)學(xué)信息，2022，35（24）：151-153.

[12]田增春，梁璐，劉陽，等.咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原體-DNA水平與社區(qū)獲得性肺炎支原體肺炎炎性反應(yīng)及免疫功能的關(guān)系[J].安徽醫(yī)藥，2022，26（8）：1619-1623.

[13]Gao M，Yao X，Mao W，et al.Etiological analysis of virus， mycoplasma pneumoniae and chlamydia pneumoniae in hospitalized children with acute respiratory infections in Huzhou[J].Virol J，2020，17（1）：119.

[14]王居鵬，朱黎娜，馬明坤，等.被動凝集法、間接免疫熒光法和膠體金法聯(lián)合檢測肺炎支原體抗體對兒童肺炎支原體感染的診斷價值[J].天津醫(yī)藥，2022，50（4）：418-423.

[15]張志英，韓淑娟，張小寧，等.肺炎痰液支原體dna聯(lián)合血清mp-igm抗體檢測在小兒肺炎支原體肺炎早期診斷中的價值[J].中國臨床新醫(yī)學(xué)，2017，10（9）：866-868.

[16]林苗苗，施李芬，余堅，等.肺炎支原體RNA和DNA檢測技術(shù)對兒童肺炎支原體肺炎診斷的價值[J]. 中國婦幼保健，2018，33（5）：1054-1056.

[17]Tang M，Wang D，Tong X，et al.Comparison of different detection methods for mycoplasma pneumoniae infection in children with community-acquired pneumonia[J].BMC Pediatr，2021，21（1）：90.

[18]Ishimaru N，Suzuki S，Shimokawa T，et al.Predicting mycoplasma pneumoniae and chlamydophila pneumoniae in community-acquired pneumonia （cap） pneumonia： Epidemiological study of respiratory tract infection using multiplex pcr assays[J].Intern Emerg Med，2021，16（8）：2129-2137.

[19]Cho MC，Kim H，An D，et al.Comparison of sputum and nasopharyngeal swab specimens for molecular diagnosis of mycoplasma pneumoniae，chlamydophila pneumoniae，and legionella pneumophila[J].Ann Lab Med，2012，32（2）：133-138.

[20]劉金榮，劉立雍，趙順英，等.咽拭子與支氣管肺泡灌洗液熒光定量PCR檢測兒童肺炎支原體感染分析[J].疾病監(jiān)測，2019，34（5）：389-393.

[21]Meyer Sauteur PM，Van Rossum AM，Vink C.Mycoplasma pneumoniae in children： Carriage，pathogenesis，and antibiotic resistance[J].Curr Opin Infect Dis，2014，27（3）：220-227.

[22]Lin LJ，Chang FC，Chi H，et al.The diagnostic value of serological studies in pediatric patients with acute mycoplasma pneumoniae infection[J].J Microbiol Immunol Infect，2020，53（2）：351-356.

收稿日期：2023-05-09；修回日期：2023-05-26

編輯/杜帆

基金項目：1.山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（編號：2018WS008）；2.淄博市醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目（編號：20231800130）

作者簡介：宋波（1985.12-），男，山東臨沂人，碩士，主管技師，主要從事免疫學(xué)的研究

通訊作者：李慶（1975.5-），男，山東淄博人，碩士，主任技師，主要從事免疫學(xué)的研究