核桃低聚肽對吲哚美辛致大鼠胃潰瘍的作用研究

劉睿，郝云濤，劉欣然，珠娜，康家偉，毛瑞雪，胡佳妮，于曉晨，李臻，李勇

（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191）

非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是一類具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎和降低血小板黏附力的藥物，被廣泛用于疼痛、發(fā)熱、類風(fēng)濕、軟組織損傷等疾病的治療[1]。 研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs 對胃腸道、肝臟、神經(jīng)、泌尿、血液和心血管系統(tǒng)等都會產(chǎn)生諸多藥物不良反應(yīng)， 尤其以胃腸道反應(yīng)最為明顯，可引起胃黏膜糜爛、潰瘍、出血和穿孔等[2-3]。 據(jù)統(tǒng)計，約有25%的長期服用者會并發(fā)胃潰瘍，一般年發(fā)病率為2%～4%。 隨著NSAIDs 應(yīng)用范圍和用量的不斷增加，NSAIDs 相關(guān)性胃腸病的發(fā)病率隨之上升。根據(jù)其致病機(jī)制， 目前已有多種方法防治NSAIDs 導(dǎo)致的胃黏膜損傷，然而各種方法均有其局限性及副作用[4]。 因此，從營養(yǎng)治療的角度出發(fā)，積極尋找安全、有效的能改善胃黏膜損傷異常狀態(tài)的功效成分，具有重要的科學(xué)意義和實際應(yīng)用價值。

核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）是利用生物酶解技術(shù)從核桃蛋白中提取的小分子生物活性肽，目前研究已證實WOPs 具有提高記憶力[5]、抗輻射[6]、潤腸通便[7]、抗疲勞[8]等多種生理活性，但尚無針對NSAIDs相關(guān)胃潰瘍的研究報道。 因此，本研究通過建立吲哚美辛誘發(fā)的大鼠胃潰瘍模型，設(shè)立乳清蛋白和奧美拉唑作為陽性對照組， 來探討WOPs 對NSAIDs 相關(guān)胃黏膜損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。 此外，前期研究在小鼠背部皮膚切口手術(shù)模型中發(fā)現(xiàn)牛骨膠原低聚肽（bovine collagen oligopeptides，BCOPs）具有一定的促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用[9-10]。 因此，特設(shè)了BCOPs 與WOPs 的配伍劑量組， 探討其配伍后對胃黏膜損傷的聯(lián)合保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃低聚肽（淡黃色固體粉末，經(jīng)高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)，分子量小于1 000 Da 的低聚肽占86.5%）、牛骨膠原低聚肽（肽含量為92.77 g/100 g）：吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司；吲哚美辛：Sigma-Aldrich 公司；奧美拉唑腸溶片（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H19990114）：北京太洋藥業(yè)股份有限公司；乳清蛋白（蛋白含量為78%）：北京中柏公司；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）檢測試劑盒：聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

AdventurerTM 通用型分析天平： 美國OHAUS 公司；LXJ-IIC 大容量低速離心機(jī)：德國Eppendorf 公司；Nihon Kohden Celltac 2 全自動血球計數(shù)儀： 日本光電工業(yè)株式會社；FSH-2A 可調(diào)高速電動勻漿機(jī)：金壇市金南儀器廠；GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司；FLUOstar Omega 多功能酶標(biāo)儀：德國BMG LABTECH 公司。

1.3 動物分組及干預(yù)

實驗采用雄性SD 大鼠80 只，體重（200±20）g ，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。 實驗大鼠飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部大鼠實驗室。 此外，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)WOPs 440 mg/kg bw 劑量組表現(xiàn)出較好的提高記憶力[5]、抗輻射[6]、抗疲勞[8]的效果。 因此，本研究以440 mg/kg bw 為中間劑量，設(shè)置了低、中、高3 個WOPs 劑量組， 以進(jìn)一步探索WOPs 的最佳干預(yù)劑量。 因此，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、乳清蛋白組（440 mg/kg bw）、奧美拉唑組（20 mg/kg bw）、WOPs 干預(yù)組（220、440、880 mg/kg bw）和配伍組（WOPs 440 mg/kg bw+ BCOPs 1.5 g/kg bw），每組10 只。干預(yù)溶液均用蒸餾水配制，每日經(jīng)口灌胃干預(yù)，正常對照組和模型對照組給予蒸餾水，其余組給予相應(yīng)濃度受試物，灌胃30 d。

1.4 方法

1.4.1 胃潰瘍造模

干預(yù)30 d 后，禁食24 h（不禁水）后，給予吲哚美辛溶液（溶于1%吐溫80，劑量為48 mg/kg bw）腹腔注射，正常對照組給予等量1%吐溫80 腹腔注射，4 h 后乙醚麻醉處死動物，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測[11-12]。

1.4.2 胃黏膜損傷評分

快速取出胃組織，沿著胃大彎剪開，冰凍生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物，以損傷發(fā)生率、損傷積分指數(shù)和損傷抑制率來表示各組大鼠胃黏膜損傷程度。

損傷積分指數(shù)：用游標(biāo)卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度，長度＜1 mm（包括糜爛點）為1 分，1 mm～2 mm為2 分，2 mm～3 mm 為3 分，3 mm～4 mm 為4 分，長度＞4 mm 分段測量；寬度＞2 mm 者，分?jǐn)?shù)乘以2；分?jǐn)?shù)之和為損傷總積分[13-14]。

式中：A、B 分別為模型組與試驗組的損傷積分。

1.4.3 血常規(guī)檢測

取全血40 μL，加入稀釋液中，用全自動血球計數(shù)儀測定大鼠血常規(guī)指標(biāo)。

1.4.4 胃組織PGE2、NO、MPO 指標(biāo)的測定

準(zhǔn)確稱取胃組織，按照1 ∶9（g/mL）的比例加入勻漿介質(zhì)，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清液貯藏于-20 ℃冰箱中，根據(jù)試劑盒說明書對胃組織PGE2、NO、MPO 的水平進(jìn)行檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 連續(xù)變量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 行單因素方差分析并采用最小顯著性差異法進(jìn)行組間的統(tǒng)計檢驗。 P＜0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況

WOPs 對大鼠初始體重和終末體重的影響見圖1。

圖1 WOPs 對大鼠初始體重和終末體重的影響Fig.1 Effects of WOPs on initial body weight and final body weight of rats

如圖1 所示，在30 d 的實驗周期內(nèi)，各實驗組大鼠外觀體征和行為活動、糞便性狀、食量等均未見異常，無中毒體征及死亡。 WOPs 灌胃干預(yù)30 d 后，各實驗組間初始體重、終末體重未見明顯差異（P＞0.05）。

2.2 WOPs 對大鼠胃潰瘍積分指數(shù)的影響

WOPs 對大鼠胃潰瘍積分指數(shù)的影響見表1。

表1 WOPs 對吲哚美辛誘發(fā)大鼠胃潰瘍積分指數(shù)的影響Table 1 Effect of WOPs on gastric ulcer index in indomethacintreated rats

如表1 所示，與模型對照組相比，3 個WOPs 干預(yù)組及配伍組損傷積分指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與乳清蛋白組相比，WOPs（220mg/kgbw）、WOPs（880 mg/kg bw）組和配伍組損傷積分指數(shù)降低，損傷抑制率升高，但未觀察到統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。奧美拉唑組損傷積分指數(shù)最低，損傷發(fā)生率僅為40%，損傷抑制率則達(dá)到了78.65%，且與WOPs（220 mg/kg bw）、WOPs（440mg/kgbw）和乳清蛋白組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）。

2.3 WOPs 對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

2.3.1 WOPs 對大鼠白細(xì)胞和血小板的影響

WOPs 對大鼠白細(xì)胞和血小板的影響見表2。

表2 WOPs 對大鼠白細(xì)胞的影響Table 2 The effect of WOPs on white blood cell of rats

如表2 所示，與正常對照組相比，模型對照組白細(xì)胞（white blood cell，WBC）數(shù)量、單核細(xì)胞（monocyte，MOD） 數(shù)量、 單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、 嗜中性粒細(xì)胞（neutrophilic granulocyte，GRN） 數(shù)量和嗜中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高（P＜0.05）。 與模型對照組相比，WOPs 各劑量組淋巴細(xì)胞（lymphocyte，LYM）百分?jǐn)?shù)嗜中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高。與奧美拉唑組相比，WOPs 各劑量組及配伍組單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均顯著下降（P＜0.05），WOPs 高劑量組GRN 數(shù)量顯著下降（P＜0.05）。

2.3.2 WOPs 對大鼠紅細(xì)胞血小板和血紅蛋白的影響WOPs 對大鼠紅細(xì)胞、 血紅蛋白和血小板的影響見表3。

表3 WOPs 對大鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板的影響Table 3 The effect of WOPs on red blood cell，hemoglobin and platelet of rats

如表3 所示，與正常對照組相比，模型對照組血小板（platelet，PLT）水平明顯下降（P＜0.05）。 與模型對照組相比，WOPs 改善了血小板的異常變化，WOPs（880 mg/kg bw） 組紅細(xì)胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）明顯降低（P＜0.05）。 紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）在各組間無明顯差異（P＞0.05）。

2.4 WOPs 對大鼠胃組織PGE2、MPO、NO 水平的影響

WOPs 對大鼠胃組織PGE2、MPO、NO 水平的影響見表4。

表4 WOPs 對大鼠胃組織PGE2、MPO 和NO 水平的影響Table 4 Effects of WOPs on gastric PGE2，MPO and NO levels of rats

如表4 所示， 與正常對照組相比， 模型對照組MPO、NO 水平明顯增加，PGE2 水平降低（P＜0.05）。 與模型對照組相比，WOPs 各劑量組和配伍組的MPO 水平均顯著下降。 與奧美拉唑組相比，WOPs 中、高劑量組和配伍組MPO 水平均明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

NSAIDs 多呈弱酸性，脂溶性高，可穿過胃黏膜表面進(jìn)入胃黏膜細(xì)胞并停留聚集在細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生直接細(xì)胞毒效應(yīng)，破壞上皮細(xì)胞層的完整性。 此外，局部刺激性NSAIDs 可降低胃黏膜屏障的疏水性， 削弱胃黏膜屏障作用，使胃黏膜更易受到損傷[15]。吲哚美辛是研究NSAIDs 相關(guān)胃潰瘍的最常用藥。本研究對經(jīng)吲哚美辛處理大鼠的胃黏膜觀察發(fā)現(xiàn)，WOPs 可減輕吲哚美辛對大鼠胃黏膜的直接損傷程度，且高劑量組損傷程度明顯輕于乳清蛋白組，但在奧美拉唑組胃黏膜損傷程度最輕，損傷發(fā)生率僅為40%，損傷抑制率高于其它各組。 血常規(guī)是最基本的實驗室檢查指標(biāo)之一，根據(jù)血液細(xì)胞形態(tài)分布及數(shù)量的變化，可及早發(fā)現(xiàn)病情或?qū)膊∽龀龀醪皆\斷。在本研究中，WOPs 對大鼠白細(xì)胞和血小板水平的異常變化具有一定改善作用，且WOPs 對單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和嗜中性粒細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于奧美拉唑組，提示W(wǎng)OPs 具有較好的抗炎效果。

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）在體內(nèi)的代謝途徑主要有兩種：一種是在環(huán)氧合酶催化作用下合成前列腺素（prostaglandins，PGs）、前列環(huán)素及血栓素；另一種在脂加氧酶的作用下生成白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、白三烯C4（leukotriene C4，LTC4）、白三烯D4（leukotriene D4，LTD4）等[16]。 NSAIDs 會導(dǎo)致花生四烯酸第一種代謝途徑被抑制， 造成PGs 合成減少。PGE2 是人體胃腸道最重要含量也最高的PGs，不僅能夠維持胃黏膜的完整性，還可以有效拮抗各種侵襲因子對胃黏膜的損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛（48 mg/kg）腹腔注射造模后，模型對照組、乳清蛋白組、奧美拉唑組大鼠胃組織PGE2 活性明顯低于正常對照組（P＜0.05），WOPs（440 mg/kg bw）和WOPs（880 mg/kg bw）組PGE2 活性則明顯高于模型對照組、 乳清蛋白組和奧美拉唑組（P＜0.05），提示W(wǎng)OPs 可通過提高PGE2 活性的方式保護(hù)胃黏膜免受有害因素的刺激損傷，且WOPs 中、 高劑量對PGE2 合成的促進(jìn)作用強(qiáng)于乳清蛋白和奧美拉唑組。

一氧化氮是胃黏膜正常生理功能的基本調(diào)控介質(zhì)，常是各種胃黏膜病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 生理條件下，結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（construtive nitric oxide synthase，cNOS）反應(yīng)持續(xù)產(chǎn)生極少量的NO，具有改善胃黏膜血流量，促進(jìn)胃黏液的分泌等保護(hù)胃黏膜的作用[18]。但當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 在炎癥等刺激因素的誘導(dǎo)下會產(chǎn)生大量NO，造成血管微循環(huán)障礙，引起炎癥反應(yīng)[19-20]。 髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性常被用來評估組織中的中性粒細(xì)胞的聚集浸潤程度[21]。NSAIDs 攝入會激活花生四烯酸第二種代謝途徑，造成LTB4、LTC4、LTD4 等的大量生成， 趨化中性粒細(xì)胞聚集脫粒，導(dǎo)致氧自由基的大量產(chǎn)生。 當(dāng)氧自由基在體內(nèi)堆積不能被及時清除時，會直接損害胃黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞， 且中性粒細(xì)胞易黏附在血管內(nèi)皮造成微血栓，引起胃黏膜損傷。 本研究發(fā)現(xiàn)，WOPs 干預(yù)明顯抑制了大鼠胃組織MPO 水平的升高， 且配伍組MPO 水平低于奧美拉唑組（P＜0.05），表明WOPs 可以通過抑制中性粒細(xì)胞聚集浸潤及iNOS 介導(dǎo)的NO 的過度產(chǎn)生，從而發(fā)揮對胃黏膜保護(hù)作用，且配伍組對MPO 的抑制作用強(qiáng)于奧美拉唑組。

4 結(jié)論

綜上，WOPs 可以減輕NSAIDs 對胃黏膜的直接損傷程度，促進(jìn)胃黏膜保護(hù)因子PGE2 的合成，并抑制中性粒細(xì)胞的聚集浸潤和NO 含量的異常增高， 從而對吲哚美辛誘發(fā)的胃潰瘍發(fā)揮較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善機(jī)體營養(yǎng)狀況、 減輕NSAIDs 對前列腺素介導(dǎo)途徑的抑制作用及NSAIDs 引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化損傷有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)WOPs 的作用效果呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性， 在WOPs 高劑量組（880 mg/kg bw） 表現(xiàn)出較好的胃黏膜保護(hù)效果，但配伍組與WOPs 干預(yù)組的整體效果差異并不顯著。 后續(xù)研究還需在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，繼續(xù)優(yōu)化劑量設(shè)置，并在體外研究和人群研究進(jìn)一步證實其生理作用及適宜劑量， 以期為WOPs 在人群中的應(yīng)用提供更多的科研依據(jù)。