多重PCR技術(shù)檢測(cè)食品中鼠傷寒沙門氏菌3 種毒力基因

譚燕，肖紫鳴，李小林，張潔，宋文軍，魏紀(jì)平，喬長(zhǎng)晟

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

大腸桿菌O157：H7 和鼠傷寒沙門氏菌是食物中毒暴發(fā)的病原體，大多數(shù)新鮮農(nóng)產(chǎn)品容易受到病原體的污染，從而導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)[1-2]。 沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，是引起食源性疾病的主要原因[3-4]。 據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，1996 年～2015 年的沙門氏菌食物中毒事件166 起，累計(jì)發(fā)病8 996 人[5]。 在沙門氏菌2 500 多種血清型中，少于100 種會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)人感染，鼠傷寒沙門氏菌引發(fā)的污染常占前兩位[6-7]。 感染鼠傷寒沙門氏菌輕至腸炎，臨床表現(xiàn)為腹瀉、惡心嘔吐，重至敗血癥和全身系統(tǒng)性播散引起的內(nèi)臟損害等癥狀[8-9]。 食源性致病菌的檢測(cè)顯得尤為重要。 近年來(lái)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)致病性細(xì)菌的致病力是大量細(xì)菌毒力相關(guān)基因相互作用的結(jié)果[10-13]。 近幾年來(lái)基于分子生物學(xué)技術(shù)中的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)[14]較于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)得到更多的應(yīng)用。 聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法不僅準(zhǔn)確、靈敏，還能比傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)更快速。 但是目前聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌存在靈敏度不高，準(zhǔn)確性不夠等缺點(diǎn)。 為了提高檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的準(zhǔn)確性和靈敏度，本研究用多重聚合酶鏈法對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的多種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與菌種

Premix Tap（TaKaRa Tap Version 2.0 plus dye）、Ta-KaRa 試劑盒、TIANGEN D2000 Marker：天根生化科技（北京） 有限公司；Solarbio 50хTAE 緩沖液、Solarbio Goldview I 核酸染料、葡萄糖瓊脂：北京索萊寶科技有限公司。 試驗(yàn)菌株信息見表1。

表1 菌株信息Table 1 Strain information

1.1.2 儀器

22331-Hambug 型PCR 儀： 蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；Tanon-1600 型凝膠成像儀：上海天能科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀：Bio-Rad 公司；MiniSpin plus 型離心機(jī)：美國(guó)eppendorf 公司；Nano-600 型超微量紫外分光計(jì)：美國(guó)DeNovix 公司；HHS-6S 型恒溫水浴鍋：北京市長(zhǎng)鳳儀器儀表公司；HNY-211B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 模板的制備

取單菌落鼠傷寒沙門氏菌于無(wú)菌的液體（Laria-Bertain，LB） 培養(yǎng)基中36 ℃、180 r/min 培養(yǎng)12 h，取1 mL 菌液12 000 r/min 離心2 min，棄上清液。在沉淀中加入180 μL 的緩沖液GL、20 μL 的蛋白酶K 溶液（20 mg/mL）和10 μL 的核糖核酸酶A（10 mg/mL）充分振蕩混勻，于56 ℃水浴溫育10 min，加入200 μL的緩沖液GB 和200 μL 的無(wú)水乙醇， 充分吸打混勻，將核酸純化柱安裝在接收管上，溶液移至核酸純化柱中，12 000 r/min 離心2 min，棄濾液。將500 μL 的緩沖液WA 加入至核酸純化柱，12 000 r/min 離心1 min，棄濾液。 將700 μL 的緩沖液WB 加入至核酸純化柱中，12 000 r/min 離心1 min， 棄濾液。 沿核酸純化柱管壁四周加入緩沖液WB，將核酸純化柱安置于接收管上，12 000 r/m 離心2 min。 將核酸純化柱置于新的1.5 mL離心管上， 加入100 μL 加熱至65 ℃的洗脫緩沖液，室溫24 ℃靜置5 min。 12 000 r/min 離心2 min 后洗脫DNA，得到100μL 沙門氏菌DNA 模板。 用超微量紫外分光計(jì)測(cè)提取的鼠傷寒沙門氏菌的核酸濃度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與制備

通過(guò)查詢資料選取鼠傷寒沙門氏菌的毒力島基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB 為本研究的目的基因， 其中mogA、sseL、araB、mgtC 是沙門氏菌的核心蛋白基因，毒力島SPI-1 編碼inva 基因， 毒力島SPI-2 編碼sseL 基因， 毒力島SPI-3 編碼mgtC 基因， 毒力島SPI-5 編碼araB 基因。 引物通過(guò)參考文獻(xiàn)[15-16]和應(yīng)用Primer6.0 設(shè)計(jì)獲得，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.3 單重PCR 反應(yīng)體系的建立

參考文獻(xiàn)[17]，初步建立單重PCR 反應(yīng)體系（25 μL）。樣品DNA 模板1 μL、正向引物和反向引物各0.5 μL、Premix Tap 12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。 PCR 擴(kuò)增條件參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，之后開始擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)椋?4 ℃變性30 s，分別在56.2、57.2、57.8、58.7 ℃下退火30 s、72 ℃延伸30 s、30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，降溫結(jié)束。 分別取上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，130 V 恒壓，20 min 電泳完成后放入凝膠成像儀，觀察電泳條帶是否清晰、是否有雜帶出現(xiàn)，目標(biāo)條帶是否擴(kuò)增出來(lái)。

根據(jù)對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖進(jìn)行分析，確定反應(yīng)體系的最佳退火溫度。

1.2.4 多重PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化

在單重PCR 的反應(yīng)條件下，將沙門氏菌的6 對(duì)毒力基因按照引物的DNA 解鏈溫度Tm 值、引物之間的交叉污染等因素進(jìn)行多重PCR 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇退火溫度相近，引物長(zhǎng)度不在同一區(qū)間的引物。多重PCR反應(yīng)體系參考方法[18-19]（50 μL）：樣品DNA 模板各2 μL、正向引物和反向引物各1 μL、Premix Tap 25 μL、ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件參數(shù)：94 ℃變性5 min，開始擴(kuò)增循環(huán)， 每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的程序?yàn)椋?4 ℃變性30 s、57.2 ℃下退火30 s、72 ℃延伸30 s、30 個(gè)循環(huán)， 然后72 ℃延伸10 min，降溫結(jié)束。

根據(jù)以上體系做響應(yīng)面優(yōu)化，見表3。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化反應(yīng)體系Table 3 Response surface optimization reaction system

分別取上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，130 V 恒壓20 min。 電泳完成后放入凝膠成像儀，觀察電泳條帶是否清晰、是否有雜帶出現(xiàn)，目標(biāo)條帶是否擴(kuò)增出來(lái)，引物之間是否有交叉污染。

1.2.5 特異性驗(yàn)證

在沙門氏菌DNA 模板里混合單增李斯特菌和大腸桿菌作為陰性對(duì)照，ddH2O 為空白對(duì)照，在單重PCR條件下進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以鑒定該方法的特異性。

1.2.6 靈敏度檢測(cè)

分別用無(wú)菌ddH2O 將提取的沙門氏菌DNA 濃度為0.165 ng/mL 進(jìn)行10 倍梯度稀釋為0.165、0.165×10-1、0.165×10-2、0.165×10-3、0.165×10-4、0.165×10-5、0.165×10-6、0.165×10-7ng/mL， 再將梯度稀釋后的DNA作為模板，通過(guò)優(yōu)化后的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的靈敏性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

本研究中的所有試驗(yàn)，均重復(fù)3 次，以驗(yàn)證試驗(yàn)方法的重復(fù)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用Design-expert 響應(yīng)面分析軟件對(duì)多重PCR 方法的建立及優(yōu)化進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，采用凝膠成像儀對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后的膠進(jìn)行觀察并另存為圖片，再采用iSee 軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR 反應(yīng)條件的確定

采用1.2.2 中表2 引物建立單重PCR 反應(yīng)體系檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的mgtC、inva（214）、inva（284）、mogA、sseL、araB 毒力基因。 沙門氏菌毒力基因在不同溫度下的電泳圖見圖1。

圖1 沙門氏菌毒力基因在不同溫度下的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of Salmonella virulence genes at different temperatures

由圖1 可知，圖1B 的條帶較清晰，無(wú)雜帶出現(xiàn)，說(shuō)明單重PCR 反應(yīng)的最佳體系為模板1 μL、正向引物和反向引物各0.5 μL、Premix Tap 12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。 單重PCR 反應(yīng)的方法的最佳退火溫度為57.2 ℃。

2.2 多重PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化

本研究采用響應(yīng)面方法對(duì)多重PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，退火溫度、引物添加量和模板添加量對(duì)多重PCR 方法特異性的影響見圖2， 并根據(jù)圖2 的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果見圖3。

圖2 多重PCR 方法響應(yīng)面優(yōu)化Fig.2 Multiplex PCR method response surface optimization

圖3 多重PCR 方法重復(fù)性Fig.3 Repeatability of multiple PCR method

由圖2、圖3 可知，泳道9 的條帶最為清晰且無(wú)交叉污染。 所以多重PCR 方法的最佳反應(yīng)體系為DNA 2 μL、 上下引物各0.8 μL、Premix Tap 25 μL、ddH2O 18.2 μL。 Tm 值為56 ℃。

2.3 特異性驗(yàn)證

采用鼠傷寒沙門氏菌的mgtC、inva（214）、inva（284）、mogA、sseL、araB 毒力基因引物進(jìn)行單重PCR 擴(kuò)增。驗(yàn)證單重PCR 方法檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的mgtC、inva（214）、inva（284）、mogA、sseL、araB 毒力基因的特異性結(jié)果見圖4。

由圖4 可知， 沙門氏菌的毒力基因均擴(kuò)增出目的條帶，陰性對(duì)照無(wú)有效擴(kuò)增條帶，說(shuō)明本研究的方法可用于鼠傷寒沙門氏菌的特異性檢測(cè)。

圖4 單重PCR 特異性分析Fig.4 Specific analysis of single PCR

2.4 靈敏度檢測(cè)

采用鼠傷寒沙門氏菌mgtC、mogA、araB 毒力基因引物進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增以檢測(cè)本研究的靈敏度。多重PCR 方法檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌mgtC、mogA、araB 毒力基因的靈敏度的結(jié)果見圖5。

圖5 多重PCR 靈敏度Fig.5 Multiplex PCR sensitivity

由圖5 可知該方法能檢測(cè)的最低靈敏度為0.016 5 ng/μL。 賀晨、劉駱強(qiáng)等[20-21]等研究的沙門氏菌的最低檢測(cè)限均為0.02 ng/μL，然而劉菲菲[22]研究的沙門氏菌最低檢測(cè)限度為1ng/μL。 由此可知該方法的靈敏度好。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)建立單重PCR 檢測(cè)沙門氏菌毒力基因的試驗(yàn)方法建立多重PCR 快速檢測(cè)多種毒力基因的試驗(yàn)方法。 在6 對(duì)特異性引物中進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)， 篩選出mgtC、mogA、araB 3 種毒力基因進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)的特異性強(qiáng)、無(wú)交叉污染，該方法能檢測(cè)的最低靈敏度為0.016 5 ng/μL。

本試驗(yàn)的單重PCR 方法可以同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌毒力島編碼的基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB， 由于引物之間的交叉污染，本研究中建立的多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）只能同時(shí)檢測(cè)3 種鼠傷寒沙門氏菌毒力基因mgtC、mogA、araB。 若食品中能同時(shí)檢測(cè)出mgtC、mogA、araB 基因，則該食品中的沙門氏菌毒性較強(qiáng)。但是該方法檢測(cè)范圍有限，只能對(duì)mgtC、mogA、araB 3 種基因進(jìn)行檢測(cè)。 本研究檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，重復(fù)性好，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)食品中鼠傷寒沙門氏菌3 種毒力基因， 對(duì)預(yù)防控制鼠傷寒沙門氏菌對(duì)食品污染引起的食品安全問(wèn)題具有很好的應(yīng)用前景。