全細(xì)胞固態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹多肽工藝及抗氧化性研究

沈大戰(zhàn)，黃均，周榮清，2*

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.制革清潔技術(shù)國家工程實驗室，四川 成都 610065）

蠶蛹是蠶絲業(yè)的主要伴生產(chǎn)物，除18 種氨基酸組成比例符合營養(yǎng)最佳的組合模式[1-3]外，還有多種重要生理功能（如健脾、安神、益精、壯陽等），自古以來就在許多亞洲國家被廣泛使用[4-9]，在20 多年前就已被衛(wèi)生部納入食品資源。 蠶蛹水解物中必需氨基酸含量高達40%，因此蠶蛹蛋白精深加工技術(shù)研究開發(fā)及產(chǎn)物的應(yīng)用在國內(nèi)外被廣泛關(guān)注[10]。蠶蛹水解物[11-12]具有較強的清除自由基的能力，對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率分別可達到90.19%、24.79%和37.07%。 基于酶促作用是解決蠶蛹蛋白致敏風(fēng)險的有效措施[13]，吳文湧等[14]建立了中性蛋白酶酶促水解蠶蛹工藝條件。 目前雖然有很多酶促水解蠶蛹蛋白的工藝，但迄今鮮見基于固態(tài)發(fā)酵方式制備蠶蛹多肽的研究。

本文以米曲霉（Aspergillus orzyae）為對象，探討了水解溫度、時間及加酶量等參數(shù)對脫脂蠶蛹蛋白粉水解度影響，并通過正交試驗優(yōu)化全細(xì)胞固態(tài)培養(yǎng)降解蠶蛹蛋白的條件，并對分離純化后的多肽抗氧化性能進行研究，為開發(fā)無臭蠶蛹蛋白肽生產(chǎn)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

米曲霉（Aspergillu orzyae）：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司；脫脂蠶蛹粉：成都世煌生物科技有限責(zé)任公司；麩皮：成都牧山食品有限公司。

Sephadex G-25 凝膠樹脂、DPPH： 美國Sigma 公司；焦性沒食子酸、VC、VE、牛血清清蛋白（bovine albumin，BSA）、硫酸銅、硫酸鉀、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、甲醛（分析純）：四川蜀都化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-C 高速冷凍離心機： 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；ST3100/F pH 計：上海奧豪斯儀器有限公司；FW100 高速萬能粉碎機：天津市泰斯特試驗設(shè)備有限公司；FDZF-6030A 真空冷凍干燥箱： 上海博迅公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠柱層析柱（1.8 cm×25 cm）、HL-2 恒流泵、BSZ-100 自動部分收集器： 上海滬西分析儀器廠；RLPHR1-4 LSC 型冷凍干燥機：CHRIST公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

蠶蛹粉和麩皮充分混勻后加入90%蒸餾水，121 ℃滅菌30 min。 接種1%米曲霉孢子，48 h 后倒瓶培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入90%的生理鹽水進行發(fā)酵，分別測定發(fā)酵產(chǎn)物水解度、多肽得率。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 酶活力測定

福林酚法測定中性蛋白酶酶活力[15]。

1.3.2.2 多肽得率的測定

稱取1.00 g 發(fā)酵底物， 用研缽研磨5 min 后定容50 mL，靜置30 min 后10 000 r/min 離心5 min，取10 mL濾液加入10 mL 10%三氯乙酸溶液靜置沉淀30 min，10 000 r/min 離心5 min。 取1mL 上清液用雙縮脲法測定多肽得率[16-17]。

1.3.2.3 水解度測定方法

采用pH-state 法[18]用下式計算水解度，此處水解度的含義為水解打斷的肽鍵數(shù)目占原料蛋白質(zhì)中總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

水解度/%=（C×V）/（α×mp×htot）×100

式中：C、V 分別為水解過程中所加NaOH 的濃度（mol/L）和體積（mL）；mp為原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量g；htot為1 g 原料蛋白質(zhì)中所含肽鍵的毫摩爾數(shù)，取為7.8 mmol/g 蛋白；α 為氨基的平均解離度，可按α=（10pH-pK）/（1+10pH-pK）（pH 為水解溶液的pH 值；pK 為α-氨基的解離度的負(fù)對數(shù)，此處取值為7.0）。

1.3.3 蠶蛹多肽工藝的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以水解溫度、水解時間、加酶量為正交試驗的影響因素，以多肽得率和水解度為評價指標(biāo)，采用L9（33）正交設(shè)計確定米曲霉水解蠶蛹蛋白制備多肽的最佳工藝。 正交試驗因素和水平見表1。

表1 蠶蛹水解工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for technology optimization of silkworm pupa meal

1.3.4 多肽純化

1.3.4.1 多肽純化方法

將多肽提取液過濾后用Sephadex G-25 葡聚糖凝膠樹脂進行純化，在上樣濃度0.6 mg/mL、上樣量1 mL的條件下，用流速為1.2 mL/min 的去離子水進行洗脫，并在檢測波長為280 nm 的條件下，收集洗脫后的純化多肽樣品， 用冷凍干燥器將純化多肽制備為粉末，并配制不同濃度多肽溶液進行抗氧化性能測定[19]。

1.3.4.2 純化多肽抗氧化性能力測定

1）DPPH 自由基清除能力的測定

DPPH 自由基清除能力的測定參照Atoui 等[20]的方法。 按式（1）計算其對DPPH 自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/% = [1-（AI-AJ）/A0]×100 （1）

式中：AI為2 mL 樣品液的吸光度；AJ為2 mL 乙醇+2 mL 樣品液的吸光度；A0為2 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 溶液的吸光度。

2）羥自由基（·OH）清除能力

參照張宏梅等[21]的方法測定羥自由基（·OH）清除能力。 按式（2）計算·OH 清除率。

式中：A樣為樣品的吸光度；A損為雙氧水+測試溶劑的吸光度；A未為蒸餾水+測試溶劑的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品3 次平行檢測，結(jié)果采用SPSS19.0 軟件對各項指標(biāo)數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

各因素對蠶蛹蛋白水解度及多肽得率的影響見圖1。

圖1 各因素對蠶蛹蛋白水解度及多肽得率的影響Fig.1 Influence of three factors on silkworm pupa protein degree of hydrolysis and peptide yield

由圖1a 可知，多肽得率隨著水解溫度的升高呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，而水解度卻隨著水解溫度的升高呈現(xiàn)遞增的趨勢。 在25℃恒溫培養(yǎng)水解過程中，多肽得率達到最大為18.23 mg/mL，而水解度卻在45 ℃水解過程中達到最大為12.35%。這是因為在一定的水解條件下， 溫度是影響酶促反應(yīng)的主要因素，隨著溫度的升高其酶促反應(yīng)速度加快，水解度逐漸增大，但過高溫度會導(dǎo)致多肽被分解轉(zhuǎn)化為氨基酸， 不利于多肽的制備，因此選擇水解溫度25、30、35 ℃進行正交試驗。

由圖1b 可知隨著水解時間的延長，多肽得率和水解度均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這是因為前期菌體生長繁殖且不斷產(chǎn)生蛋白酶水解蠶蛹蛋白，所以水解度和多肽得率均在增加， 水解度在第4 天達到最大14.32%，而多肽得率在第5 天達到最大值11.82 mg/mL。繼續(xù)水解多肽得率降低，因為水解初期微生物生長代謝僅需少許蛋白用于自身的生長繁殖消耗，但到了發(fā)酵后期底物消耗較大雖然仍有部分大分子蛋白尚未被水解， 但部分分子量小的多肽被微生物優(yōu)先利用，因此出現(xiàn)多肽得率下降的趨勢[22-23]。 若繼續(xù)水解肽類物質(zhì)可能迅速減少， 因此選擇水解時間3、4、5 d 進行正交試驗。

由圖1c 可知，水解度和多肽得率隨加酶量的增加均先增加后降低，在加酶量2 368 U/g 時，多肽得率達到最高為10.54 mg/mL。在相同時間內(nèi)隨著加酶量的升高其水解程度更為徹底，在加酶量為2 895 U/g 時水解度達到最大10.51%，而其水解程度越大所產(chǎn)生多肽的含量就會相應(yīng)減少[24-25]。 而另一方面由于微生物發(fā)酵制備多肽是一個動態(tài)的過程，在水解過程中過量的酶分子又會抑制中間產(chǎn)物向酶解反應(yīng)終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，即其水解度和多肽的含量就會略有降低。 因此最佳加酶量選擇為2 368 U/g， 并選擇加酶量為2 150、2 368、2 632 U/g 進行正交試驗。

2.2 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果見表2， 以多肽得率和水解度為指標(biāo)的方差分析結(jié)果分別見表3 和表4。

表2 蠶蛹水解工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of silkworm pupa meal

表3 以多肽得率為評價指標(biāo)的正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using flavonoids content as evaluation index

表4 以水解度為評價指標(biāo)的正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using degree of hydrolysis as evaluation index

由表2 可知，影響多肽得率的各因素的主次順序為B＞A＞C，影響水解度的各因素的順序為B＞A＞C。 由表3 可知，水解溫度、水解時間均對多肽得率有顯著性影響（P<0.05）。由表4 可知，水解時間、水解溫度均對水解度有顯著性影響（P＜0.05），加酶量對水解度和多肽得率的影響均不顯著（P＞0.05）。綜合考慮，選擇最優(yōu)組合為A2B1C2，即水解溫度30 ℃、水解時間3 d、加酶量2 368 U/g，并在此條件下進行驗證試驗，其多肽得率為21.35 mg/mL，其水解度為4.58%，優(yōu)于正交試驗的各組合。 因此全細(xì)胞固態(tài)培養(yǎng)水解蠶蛹蛋白的最優(yōu)工藝條件選擇為水解溫度30℃、水解時間3d、加酶量2368 U/g。

2.3 蠶蛹多肽分離純化效果

多肽洗脫圖譜如圖2 所示。

圖2 蠶蛹多肽洗脫圖譜Fig.2 Eluction chart of polypeptide

有兩個組分的肽段被分離，且組分Ⅱ峰高明顯大于組分Ⅰ。閔建華等[26]使用Sephadex G-25 交聯(lián)葡聚糖凝膠柱分離蠶蛹蛋白水解液后也得到兩個不同組分，但其組分Ⅰ為主要成分。 而趙鵬等[27]將蠶蛹蛋白水解液用Sephadex G-25 交聯(lián)葡聚糖凝膠柱分離后，得到3 個較明顯的峰。 這可能是由水解產(chǎn)生的肽單位的分子大小差異產(chǎn)生的結(jié)果。

2.4 純化多肽清除自由基的能力

2.4.1 純化多肽DPPH 自由基清除能力

將純化后多肽組分Ⅰ和組分Ⅱ與VC、VE進行抗氧化活性比較，結(jié)果見圖3。

從圖3 可知，組分Ⅰ抗氧化性優(yōu)于組分Ⅱ，但均低于對照組抗氧化性。 在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著蠶蛹多肽濃度的升高， 蠶蛹多肽對DPPH 自由基清除率線性增加，當(dāng)蠶蛹多肽濃度為0.6 mg/mL 時，組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)PPH 自由基清除率達到37%、36%，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC、VE的抗氧化能力。

圖3 多肽對DPPH 自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH free radical by polypeptide

2.4.2 純化多肽·OH 清除能力

純化多肽對·OH 的清除率結(jié)果如圖4 所示。

圖4 多肽對·OH 的清除率Fig.4 Scavenging rate of·OH by polypeptide

當(dāng)純化多肽濃度在0.4 mg/mL～0.6 mg/mL 范圍時，組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)ΑH 清除能力顯著高于對照組VC和VE，多肽濃度在0.6 mg/mL 時，組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)ΑH 的清除率分別為83%、94%，且組分Ⅱ在不同濃度下對·OH 的清除率均高于對照組VC和VE。 蠶蛹蛋白水解制備的多肽具有較好的抗氧化能力，尤其·OH 的清除能力較強。

3 結(jié)論

本研究以蠶蛹粉和麩皮為原料，通過單因素和正交試驗對蠶蛹粉水解條件進行優(yōu)化，得到制備蠶蛹多肽的最優(yōu)水解條件為：水解時間3 d、水解溫度30 ℃、加酶量2368U/g。在此優(yōu)化條件下多肽得率為21.35mg/mL，水解度為4.58%。蠶蛹多肽具有較強的·OH 清除能力，清除率達到94%。 此工藝制備多肽雖然水解時間稍長， 但此水解工藝簡便且可以得到安全無臭多肽產(chǎn)品，在一定程度上為蠶蛹資源的開發(fā)和利用提供理論和技術(shù)支撐。